王卓,李嫻靜，張啟春

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198)

巨噬細胞是機體中一類非常重要的免疫細胞，廣泛分布于機體的各個組織中，參與調(diào)節(jié)機體的組織穩(wěn)態(tài)[1]。巨噬細胞具有極強的可塑性和異質(zhì)性，在LPS或干擾素的刺激下，表現(xiàn)出經(jīng)典型極化即M1極化，表達大量的促炎因子如白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-12(interleukin 12，IL-12)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及誘導性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等，同時高表達抗原提呈相關(guān)分子如MHCII、CD86、CD80等，殺傷病原體和腫瘤細胞,發(fā)揮抗腫瘤抗感染的作用；相反，巨噬細胞在IL-4或IL-13的刺激下，表現(xiàn)出替代性極化即M2極化，高表達抑炎因子TGF-β、IL-10、精氨酸酶(arginase 1,Arg1)等，抑制炎癥反應(yīng)，促進血管生成，參與組織重塑與修復。健康狀態(tài)下，機體中的巨噬細胞處于M1與M2動態(tài)平衡中，若M1極化高強度持續(xù)存在，過度炎癥導致自身組織損傷，若M2極化持續(xù)存在，則不利于機體有效清除病原體。因此，巨噬細胞極化的精確調(diào)控對于機體組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

谷氨酰胺(glutamine,Gln)是體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，在機體創(chuàng)傷及感染時，被視為“條件必需氨基酸”[3]。谷氨酰胺是許多細胞和組織最重要的能源物質(zhì)，尤其是免疫細胞如淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等，它們對Gln的利用率遠遠超過其他氨基酸[4]。但Gln對巨噬細胞表型的調(diào)控作用尚不明確，本實驗研究Gln對原代巨噬細胞表型的調(diào)控作用，為Gln的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠10只，體重20～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0005。實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2018-2019。在中國藥科大學新藥安全評價研究中心飼養(yǎng)，自由進食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進行實驗。

1.1.2 主要試劑 DMEM(不含谷氨酰胺)購自Thermo Fisher公司；Trizol、實時定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time Master購自TaKaRa；CB839購自MCE；重組小鼠M-CSF購自Peprotech。

1.1.3 引物序列 具體見表1。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源巨噬細胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)提取 將小鼠脫頸處死，浸泡于裝有75%酒精的燒杯，浸泡2 min左右；取下小鼠脛骨和股骨；用注射器(2.5 mL)吸取PBS沖出骨髓中細胞；離心，300 g，5 min,4 ℃；2 mL培養(yǎng)基將細胞重懸，用70 μm濾器過濾細胞，去除結(jié)締組織及骨頭等非細胞成分；將過濾所得的細胞再次離心，棄上清，加10 mL含100 ng·mL-1M-CSF的培養(yǎng)基重懸后加至10 cm培養(yǎng)皿，該細胞繼續(xù)培養(yǎng)使其分化，每3 d換液一次，第6天后進行藥物處理。

1.2.2 巨噬細胞藥物處理 ①谷氨酰胺剝奪處理：BMDM培養(yǎng)至第6天，鋪6孔板，每孔1×106個細胞；將細胞分為兩組：+ Gln組(正常培養(yǎng)基)及-Gln組(無谷氨酰胺培養(yǎng)基)，各6個孔，處理6 h后將6孔板取出提取RNA。②谷氨酰胺抑制劑處理：將細胞分為3組：對照組、IL-4(50 ng·mL-1)、IL-4+CB-839(1 μmol·L-1)，每組各6個孔，孵育6 h后將6孔板取出提取RNA。

1.2.3 給藥后的巨噬細胞M1/M2標志物mRNA表達水平檢測 Trizol法提取RNA，超微量分光光度計檢測RNA的純度和濃度，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，去除基因組DNA，采用PrimerBank數(shù)據(jù)庫提供的引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成引物。配置PCR反應(yīng)液，采用兩步法PCR擴增程序，用每個樣本的目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值：ΔCt樣本=Ct樣本-Ct內(nèi)參；將對照組的ΔCt值取平均值ΔCt對照：ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對照，計算出2-ΔΔCt。

2 實驗結(jié)果

2.1 谷氨酰胺剝奪對骨髓來源的巨噬細胞表型極化的影響 如圖1所示，使用RT-PCR技術(shù)分別檢測剝奪谷氨酰胺與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs中M1型特異性標志基因IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的表達水平。結(jié)果顯示，與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs相比，剝奪谷氨酰胺的BMDMs的IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS表達水平顯著增加。剝奪谷氨酰胺后，巨噬細胞中IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的基因表達水平分別增加了7.5、80、24、48倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A.IL-12基因表達；B.IL-6基因表達；C.IL-1β基因表達；D.iNOS基因表達

2.2 谷氨酰胺酶抑制劑CB-839對M2型巨噬細胞表型極化的影響 如圖2所示，與對照組相比，IL-4組均顯著上調(diào)M2型特異性基因mRNA表達水平，如Arg1、Chil3、Mrc1表達水平相比對照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義，表明IL-4成功誘導巨噬細胞M2型極化。同時給予 CB-839后，IL-4誘導M2型標志物的表達均顯著降低；此外，CB-839處理亦能促進M1型特異性基因IL-1β和iNOS的表達水平增加。以上結(jié)果表明CB-839能夠抑制BMDMs在IL-4誘導下向M2型極化的能力，增強其向M1型轉(zhuǎn)化的能力。

A.Arg1；B.Chil3；C.Mrc1；D.IL-1β；E.iNOS的mRNA表達水平(n=6；IL-4：50 ng·mL-1，CB-839：1 μmol·L-1)

3 討論

本研究通過實時定量PCR方法研究谷氨酰胺代謝對巨噬細胞極化的作用，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺剝奪抑制M2型極化，而谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理亦能抑制巨噬細胞M2極化且增加M1型標志基因的表達，表明谷氨酰胺代謝過程對巨噬細胞具有調(diào)控作用。

谷氨酰胺通過氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白 ASCT2和 SN2穿過細胞膜，進入胞漿后，首先通過谷氨酰胺酶(GLS/GLS2)轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸通過谷氨酸脫氫酶(GLUD)或轉(zhuǎn)氨酶(如谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PSAT)兩條不同的途徑轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-KG)[5]。谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理顯著抑制巨噬細胞M2極化且增加M1型標志基因的表達，表明谷氨酰胺代謝過程中產(chǎn)生的代謝物α-KG可能是巨噬細胞表型極化的關(guān)鍵分子。αKG是雙加氧酶催化底物羥基化的重要輔因子，其與Fe2+構(gòu)成的雙加氧酶酶活中心結(jié)合，在氧氣的參與下，活化的兩個氧原子分別進攻底物和αKG，進而生成羥基化的底物[5]。組蛋白去甲基化酶KDM家族、DNA去甲基化酶Tets家族及RNA去甲基化酶ALKBH5、FTO等均為雙加氧酶。因此，αKG能夠介導全基因組水平的組蛋白、DNA及RNA甲基化狀態(tài)的改變，從而誘導細胞表觀重編程[6-7]。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)αKG能夠抑制小鼠肺巨噬細胞M1極化，促進巨噬細胞M2極化，亦有研究顯示谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的αKG促進腫瘤微環(huán)境免疫抑制性髓細胞的形成[9]。因此，谷氨酰胺代謝可能通過αKG介導巨噬細胞表觀重編程，從而促進巨噬細胞M2極化。CB-839已進入臨床試驗(NCT02071862)，已被證明在治療三陰性乳腺癌方面具有療效[10]，其有可能通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞M1極化從而增加其抗腫瘤功能。本研究為谷氨酰胺及其代謝過程抑制劑在臨床的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。