張?jiān)娙A，郭朝暉，倪琳，宋平順，李辰荃

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藏藥檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥品質(zhì)與安全評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

大薊為菊科植物薊(CirsiumjaponicumFisch.ex DC.)的干燥地上部分。通常在夏、秋二季大薊花開(kāi)時(shí)收割干燥地上部分，除去雜質(zhì)并干燥。其性味甘、苦，涼。在臨床上常用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外傷出血，癰腫瘡毒。小薊為菊科植物刺兒菜[Cirsiumsetosum(Willd.)MB.]的干燥地上部分[1]。大薊和小薊在全國(guó)各地均有栽培，由于市場(chǎng)流通混亂，常將小薊作為大薊進(jìn)行交易，導(dǎo)致臨床藥效參差不齊。二者雖均能涼血止血，解毒消癰，主治血熱型出血，熱毒瘡瘍，但是小薊涼血止血作用強(qiáng)，解毒之力不如大薊；大薊涼血止血作用不如小薊，而解毒療瘡作用較強(qiáng)[2]。所以大薊和小薊在臨床上不得混用。

當(dāng)前中藥鑒別方法包括傳統(tǒng)鑒別方法和現(xiàn)代鑒別方法，傳統(tǒng)鑒別方法主要是利用觸覺(jué)、嗅覺(jué)、視覺(jué)、味覺(jué)等感官方法，或火試、水試等方法進(jìn)行鑒別，對(duì)中藥飲片的種類(lèi)、真?zhèn)蔚燃右耘袛?；現(xiàn)代鑒別方法主要是采用顯微技術(shù)，利用組織鑒別法、粉末鑒別法、化學(xué)分析方法等進(jìn)行顯微分析[3]。這些方法操作簡(jiǎn)便，但準(zhǔn)確率有待商榷。同時(shí)中藥及其中藥制劑所含化學(xué)活性成分復(fù)雜多樣，對(duì)所有化合物進(jìn)行定性定量也十分困難，而且某些活性成分在治療方面也具有協(xié)同加和作用[4]，因此單一成分含量也不能準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。

中紅外光譜指紋圖譜目前已經(jīng)應(yīng)用于中藥活性成分，真?zhèn)舞b別、質(zhì)量控制等方面的研究[5-12]。TQ、SIMCA兩款軟件可對(duì)光譜進(jìn)行分析，目前TQ軟件已經(jīng)在前胡的快速鑒別[13]、三七的真?zhèn)舞b別[14]、天麻有效成分的快速定量[15]等方面中有所應(yīng)用。SIMCA判別分析也已經(jīng)在不同產(chǎn)地山藥的鑒別[16]、金銀花與山銀花的區(qū)分判別[17]、硫熏白芍的快速鑒別[18]等方面廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)收集不同產(chǎn)地的大薊及小薊樣品，采集大薊與小薊的中紅外光譜，利用TQ軟件和SIMCA軟件建立主成分分析-馬氏距離與正交偏最小二乘判別模型，為鑒別大薊與小薊及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 樣品收集 2021年共收集44份不同產(chǎn)地的大薊及小薊樣品，樣品信息見(jiàn)表1。本研究中的大薊、小薊樣品均由甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師收集并鑒定。經(jīng)過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)大薊及小薊樣品的表面顏色、葉片形狀等性狀差異性較小，如果僅憑肉眼觀察和顯微觀察無(wú)法準(zhǔn)確地區(qū)分。

表1 大薊和小薊樣品信息

為了方便區(qū)分，將所有樣品編號(hào)后，統(tǒng)一進(jìn)行干燥。具體干燥方法是將大薊、小薊樣品在45 ℃烘箱中干燥12 h，每4 h翻動(dòng)一次。干燥處理后將樣品放置于真空干燥器中冷卻至室溫。將干燥后的樣品粉碎并過(guò)80目篩，以得到大小均一的大薊和小薊粉末，粉末樣品保存于自封袋中，放陰涼干燥處貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器 PC-12型號(hào)壓片機(jī)(天津精拓儀器科技有限公司);Spectrum Two傅立葉變換紅外光譜儀(PerkinElmer北京儀器有限公司)；A11basic025沖擊式粉碎機(jī)(德國(guó)IKA)；QUINTTX224-1CN萬(wàn)分之一天平(德國(guó)賽多利斯)；JB2018940標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(紹興市張興紗篩廠)；9240A型號(hào)電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司)。

1.3 樣品處理 取粉碎后的樣品置于研缽，加入溴化鉀(光譜級(jí))研磨后放置于高溫?zé)粝聜溆?。每掃描一個(gè)樣品均采集一次背景，一批樣品在相同條件下進(jìn)行5次掃描。參數(shù)設(shè)定：光譜掃描范圍在4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)14次，溫度20 ℃，空氣相對(duì)濕度70%；掃描時(shí)扣除H2O和CO2的干擾，每種樣品平行測(cè)量5次，取平均光譜[19]。大薊及小薊樣品原始中紅外光譜圖見(jiàn)圖1～4。

圖1 大薊樣品原始中紅外光譜

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證 選取隨機(jī)樣品進(jìn)行方法學(xué)考察，選取中紅外光譜中吸收強(qiáng)度最大的5個(gè)特征峰作為評(píng)價(jià)峰，考察儀器的精密度、樣品的穩(wěn)定性、操作可重復(fù)性，以對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最為評(píng)判依據(jù)。

1.4.1 精密度試驗(yàn) 樣品連續(xù)測(cè)定5次，得到紅外光譜并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值均小于1.45%，表明儀器的精密度良好。

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品壓片，壓片后放入真空干燥器中進(jìn)行保存。每隔30 min進(jìn)行一次光譜采集，測(cè)定5次，得到紅外光譜并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示RSD值均小于1.89%，表明該樣品的穩(wěn)定性良好。

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 將樣品平行制樣5份，分別進(jìn)行測(cè)定，得到紅外光譜并計(jì)算RSD值，結(jié)果顯示圖譜RSD值均小于0.99%，表明方法的可重復(fù)性良好。

2 光譜分析結(jié)果

由圖可知，大薊和小薊樣品中紅外原始光譜存在以下特征：整體可見(jiàn)，不同產(chǎn)地的大薊和小薊中紅外光譜走勢(shì)和主要吸收峰的位置基本相同，說(shuō)明不同產(chǎn)地的大薊以及不同產(chǎn)地的小薊質(zhì)量總體穩(wěn)定。4 000～1 300 cm-1稱(chēng)為官能團(tuán)區(qū)，1 300～600 cm-1的區(qū)域，除單鍵的振動(dòng)外，還有因變性振動(dòng)產(chǎn)生的復(fù)雜光譜，這一區(qū)域稱(chēng)為指紋區(qū)。

由圖2大薊圖譜可以看出，其中3 010.4 cm-1處的峰為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；2 864.7 cm-1處的峰是甲基的對(duì)稱(chēng)伸縮吸收峰；1 718.2 cm-1為羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰；1 490.3 cm-1和1 525.1 cm-1附近為芳香環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰；1 389 cm-1與1 347.8 cm-1為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰；1 300～910之間主要為各類(lèi)C-O的伸縮振動(dòng)。

圖2 大薊樣品紅外光譜及吸收峰圖

由圖4小薊圖譜可以看出3 000.4 cm-1處的峰為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，2 861.4 cm-1處的峰是甲基的對(duì)稱(chēng)伸縮吸收峰，1 715 cm-1為羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1 487.5 cm-1和1 557 cm-1附近為芳香環(huán)骨架振動(dòng)吸收峰，1 389.6 cm-1與1 348.6 cm-1為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰，1 300～910 cm-1之間主要為各類(lèi)C-O的伸縮振動(dòng)，通過(guò)對(duì)比可以看出，小薊在1 557cm-1、754.78 cm-1和489.33 cm-1附近有吸收峰，而大薊在這幾處的峰不顯著，大薊在907.6 cm-1附近有吸收峰，而小薊在此處吸收不明顯。

3 建立模型

3.1 主成分分析-馬氏距離(PCA-MD)判別模型 使用TQ Analyst軟件對(duì)光譜進(jìn)行優(yōu)化處理，光譜中除了樣本本身信息之外，還包括了一些無(wú)用信息，噪聲等，因此本文采用多元散射校正法(MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、SG平滑、ND平滑的組合方法去除光譜中存在的無(wú)用信息[20]，以提高判別模型的準(zhǔn)確性。通過(guò)表2可知，通過(guò)分析選擇的預(yù)處理方法為MSC+ND+SD。

在對(duì)原始光譜預(yù)處理的基礎(chǔ)上采用主成分分析-馬氏距離判別分析方法，選取的光譜范圍為3 930.22～520.69 cm-1，從中選取8個(gè)為驗(yàn)證集，212個(gè)為預(yù)測(cè)集。判別模型結(jié)果見(jiàn)表2和圖5。在表2中可見(jiàn)模型的性能指數(shù)(performance index)為95.7，其預(yù)測(cè)率(previous)為95.0，表明建立的PCA-MD判別模型是合理有效的，MSC+ND+SD可以作為大薊和小薊光譜的有效處理方法。如圖5所示，可以看出大薊樣品和小薊樣品有良好的區(qū)分度。

表2 光譜預(yù)處理方法

圖3 小薊樣品原始中紅外光譜

圖4 小薊樣品紅外光譜及吸收峰圖

圖5 PCA-MD判別模型圖

3.2 正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)判別模型的建立 采用SIMCA 14.0軟件，建立大薊與小薊樣品的正交偏最小二乘法判別模型，OPLS-DA模型中的R2Y代表積累的自變量X對(duì)Y的解釋能力，Q2代表模型的預(yù)測(cè)能力。在所設(shè)計(jì)的模型中R2Y的值為0.95，Q2的值為0.944，OPLS-DA模型判別結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖6可知，大薊與小薊的中紅外光譜信息是具有差異性的。在OPLS-DA模型建立的基礎(chǔ)上，采用SIMCA軟件對(duì)其進(jìn)行置換檢驗(yàn)，排列數(shù)為200，結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，R2的截距值為0.037 2，Q2的截距值為-0.179<0.05，表明所建立的模型是穩(wěn)定有效的，且沒(méi)有過(guò)度擬合，可用于判別大薊及小薊樣品。

圖6 OPLS-DA模型判別結(jié)果

圖7 置換檢驗(yàn)結(jié)果

4 討論

目前對(duì)大薊小薊的區(qū)分鑒別集中在顯微和含量成分測(cè)定方面。易炳學(xué)等[21]測(cè)定大薊小薊中含量發(fā)現(xiàn)柳穿魚(yú)葉苷可以作為大薊和小薊藥材區(qū)別的依據(jù)。倪曉霓等[22]建立了反向高效液相色譜分析方法，利用大薊、小薊黃酮類(lèi)化合物的指紋圖譜來(lái)鑒別二者。胡建平等[23]利用聚酰胺薄層色譜法進(jìn)行層析，以此來(lái)鑒別大薊。梁鸝等[24]對(duì)大薊與小薊的顯微進(jìn)行鑒別研究，發(fā)現(xiàn)大薊、小薊的橫切面顯微特征可從莖及葉維管束排列緊密程度來(lái)進(jìn)行區(qū)分;粉末的顯微特征可從多細(xì)胞非腺毛的細(xì)胞個(gè)數(shù)來(lái)進(jìn)行區(qū)分。張景景等[25]研究表明ITS2序列可以鑒定大薊藥材。但以上方法操作均較為復(fù)雜。

本研究中所用到的PCA-MD與OPLS-DA 模型均是模式識(shí)別的方法，其中PCA-MD為無(wú)監(jiān)督的方法，主成分的提取是采用降維的方法，提取出有用的光譜信息，本實(shí)驗(yàn)中所建立的PCA-MD 判別模型對(duì)大薊和小薊的鑒別率僅達(dá)到 95.0%，因此建模波段與建模方法需進(jìn)一步優(yōu)化以便實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分。而 OPLS-DA為有監(jiān)督的方法，由于OPLS-DA方法同時(shí)對(duì)光譜陣和類(lèi)別陣進(jìn)行分解，加強(qiáng)了類(lèi)別信息在光譜分解時(shí)的作用，以提取出與樣本類(lèi)別最相關(guān)的光譜信息，即最大化提取不同類(lèi)別光譜之間的差異[26]，因此 OPLS-DA方法通常可以得到比基于 PCA 的識(shí)別方法更優(yōu)的分類(lèi)和判別結(jié)果，基于此進(jìn)一步對(duì)光譜波段進(jìn)行了優(yōu)化，建立了OPLS-DA判別模型并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該模型鑒別率能夠達(dá)到94.4%。

本研究首次通過(guò)中紅外光譜實(shí)現(xiàn)了對(duì)大薊和小薊樣品的準(zhǔn)確鑒別，該方法操作簡(jiǎn)單，建立的判別模型準(zhǔn)確可靠，可為相似中藥材的鑒別提供新的思路。