潘中閃，史紅玲，李 瑩，李中洋，唐存多，王 娜*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，河南鄭州 450002；2.南陽師范學院南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南南陽 473061；3.恒利康生物科技股份有限公司,河南南陽 473081)

抗生素被用作飼料添加劑以來，在全球范圍內(nèi)得到了廣泛的應用，但同時也帶來了藥物殘留和耐藥性等一系列嚴峻的社會問題[1-2]。大健康時代，健康產(chǎn)業(yè)的概念已經(jīng)不再是依賴抗生素等藥物的單一救治模式，而是從這種單一救治模式轉(zhuǎn)向“防-治-養(yǎng)”一體化模式[3]，同時緩解因濫用抗生素對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成的嚴重威脅[4]。在這種新型模式之下，益生菌與人體健康的關系已成為研究的熱點[5]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，人體腸道內(nèi)的微生物種群變化與人體健康的關系非常密切[6]，而益生菌在提升人體健康水平中扮演著舉足輕重的角色。益生菌可通過維護腸道菌群的健康穩(wěn)態(tài)，刺激宿主的免疫系統(tǒng)，增強宿主的免疫應答反應，從而幫助宿主抵抗各類疾病的發(fā)生[7]。益生菌是一類可以通過攝取適當?shù)牧俊κ秤谜叩纳眢w健康能發(fā)揮有效作用的活菌[8]，在口腔疾病、腸道疾病、過敏性疾病等的預防、治療和修復過程中發(fā)揮著重要作用[9-11]。

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)廣泛應用于食品工業(yè)領域，尤其是在益生菌劑及天然防腐劑等領域具有很廣闊的應用前景[13-15]。目前戊糖片球菌多采用MRS培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，但MRS發(fā)酵培養(yǎng)基成分復雜且價格昂貴。另外，菌種的自主知識產(chǎn)權也是制約我國益生菌產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的一個瓶頸。該研究從丹江口庫區(qū)的青貯飼料中篩選一株具有知識產(chǎn)權、適應庫區(qū)環(huán)境的土著戊糖片球菌，并在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎上對碳源、氮源和無機鹽離子分別進行成分及濃度的優(yōu)化，以實現(xiàn)戊糖片球菌低成本、高密度的發(fā)酵生產(chǎn)，為丹江口庫區(qū)的畜禽及水產(chǎn)的健康無抗養(yǎng)殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1主要試劑。牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、結晶乙酸鈉、檸檬酸二銨、Tween 80、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CaCO3，購自北京索萊寶科技有限公司；細菌DNA基因組提取試劑盒、2×TransStart?FastPfu PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech) 股份有限公司；蛋白胨、瓊脂、蔗糖和酵母粉，購自上海生工生物工程有限公司；淀粉、玉米粉、豆粕、麩皮，購自南陽市武侯路農(nóng)貿(mào)市場；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2培養(yǎng)基。

(1)MRS液體培養(yǎng)基。蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖5 g/L、結晶乙酸鈉5 g/L、檸檬酸二銨2 g/L、Tween 80 1 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L和CaCO32 g/L，用去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，用于菌種活化。

(2)MRS固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基的基礎上添加15 g/L 瓊脂粉。

(3)基礎發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L和MnSO4·H2O 0.2 g/L，用去離子水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min，用于種子液發(fā)酵。

1.1.3主要儀器與設備。恒溫搖床，購自上海智城分析儀器制造有限公司；UV1000紫外可見分光光度計，購自上海天美科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1菌種的分離及鑒定。稱取1 g青貯飼料，將其置于99 mL 無菌水中，充分打散，定義稀釋度為10-2，然后進行10倍梯度稀釋，直到稀釋度為10-6，取10-4、10-5和10-6這3個稀釋度進行涂板，每個稀釋度取0.1 mL涂布于MRS平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取單菌落，在MRS平板上劃線純化。吸取部分液體用基因組提取試劑盒提取細菌基因組DNA。根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》，對目標菌株進行形態(tài)和生理生化特征鑒定。

利用細菌16S rRNA通用引物27F和1492R，以目的菌種基因組DNA為模板進行PCR擴增，1%的瓊脂糖凝膠電泳。擴增后的PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程有限公司測序，將測序結果提交到NCBI數(shù)據(jù)庫并進行BLAST比對，下載相關序列，采用ClustalX 2.0軟件進行同源性分析， Mega 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2種子液的培養(yǎng)。挑取單菌落于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.3生長曲線的測定。以原始發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵種子液，37 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測定發(fā)酵液在600 nm 處的吸光度，繪制生長曲線。

1.2.4種子液的發(fā)酵培養(yǎng)。將活化后的種子液按體積分數(shù)5%轉(zhuǎn)接至50 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min，振蕩培養(yǎng)18 h。

1.2.5發(fā)酵液中活菌數(shù)的測定。發(fā)酵液菌落形成單位(CFU)的測定采用稀釋涂布法[16]。將稀釋完的發(fā)酵液各吸取100 μL涂布于MRS固體平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。計數(shù)平板上形成的菌落，計算發(fā)酵液菌落形成單位數(shù)值(CFU/mL)，該研究中以涂板時形成一個菌落定義為有一個活菌。

1.2.6不同碳源及其添加量對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。配制初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 g、蛋白胨1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、MnSO4·H2O 0.02 g，用去離子水定容至100 mL，取50 mL分裝至250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min。初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎碳源為葡萄糖，在測定不同碳源對戊糖片球菌的發(fā)酵影響試驗中，分別用蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉替代葡萄糖作為碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)發(fā)酵活菌數(shù)確定最佳的碳源。

添加不同質(zhì)量濃度的最佳碳源，分別設置濃度梯度為10、20、40、60、80和100 g/L。挑取單菌落經(jīng)37 ℃、200 r/min活化24 h，按5%的接種量接種至上述不同濃度碳源的培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，然后分別按“1.2.5”的稀釋涂布法測定不同濃度碳源下的發(fā)酵活菌數(shù)，確定最佳的碳源濃度。

1.2.7不同氮源及其添加量對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)“1.2.6”中確定的發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳碳源及其添加量，在該條件下配制初始發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖4 g、蛋白胨1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、MnSO4·H2O 0.02 g，用去離子水定容至100 mL，取50 mL分裝至250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min)。初始發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源為蛋白胨，在測定不同氮源對戊糖片球菌的發(fā)酵影響試驗中，分別用酵母粉、豆粕、麩皮替代蛋白胨作為氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)發(fā)酵活菌數(shù)確定最佳的氮源。

添加不同質(zhì)量濃度的最佳氮源，設置濃度梯度為10、20、30、40和50 g/L。挑取單菌落經(jīng)37 ℃、200 r/min活化24 h，按5%的接種量接種至上述不同濃度氮源的培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，然后分別按“1.2.5”的稀釋涂布法測定不同濃度氮源下的發(fā)酵活菌數(shù)，確定最佳的氮源濃度。

1.2.8不同無機鹽離子及其添加量對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)“1.2.6”和“1.2.7”確定的發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳碳源、氮源及其濃度，對無機鹽離子的種類和濃度繼續(xù)進行優(yōu)化。在無機鹽離子成分優(yōu)化中，選擇單一離子進行試驗，即培養(yǎng)基中只含Mg2+或Mn2+，在此條件配制發(fā)酵培養(yǎng)基[葡萄糖4 g、酵母粉4 g、MgSO4·7H2O 0.05 g(或MnSO4·H2O 0.02 g)，用去離子水定容至100 mL，取50 mL分裝至250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min]，根據(jù)發(fā)酵活菌數(shù)確定最佳的無機鹽離子。

在無機鹽離子濃度梯度優(yōu)化中，分別設置梯度為0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/L。挑取單菌落經(jīng)37 ℃、200 r/min 活化24 h，按5%的接種量接種至上述不同濃度無機鹽離子的培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，然后分別按“1.2.5”的稀釋涂布法測定不同濃度無機鹽離子下的發(fā)酵活菌數(shù)，確定最佳的無機鹽離子濃度。

2 結果與分析

2.1 菌種的鑒定

2.1.1形態(tài)和生理生化鑒定。該研究篩選到潛在的Pediococcuspentosaceus菌株為革蘭氏陽性菌，球形，在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)呈圓形，乳白色，中央凸起、邊緣齊整，光滑濕潤不透明，與汪祥燕等[17]報道的高抗氧化活性戊糖片球菌菌落形態(tài)較為一致。

將該菌株根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》的方法進行生理生化鑒定。結果顯示，該菌株發(fā)酵葡萄糖、果糖、乳糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵山梨醇、甘露醇、木糖及糊精，不還原硝酸鹽，接觸酶陰性，無運動性，在25和50 ℃下生長較好，這些生理生化指標均與戊糖片球菌的指標一致。

2.1.216S rRNA測序鑒定。隨著分子生物學技術的發(fā)展，16S rRNA、18S rRNA及ITS測序技術已經(jīng)成為微生物鑒定最可靠、最常用的分子鑒定手段。將分離出的目標菌株，利用27F和1492R通用引物克隆出了部分16S rRNA片段，并進行了測序分析，將序列在NCBI中進行BLAST分析，用ClustalX 2.0和Mega 6.0軟件繪制該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示。結果表明，該菌株的16S rRNA與PediococcuspentosaceusLE1-1菌株的相似度達到99.9%，結合形態(tài)學和生理生化特征，可以初步鑒定該菌株為Pediococcuspentosaceus，因此將其命名為PediococcuspentosaceusNY001，也獲得具有自主知識產(chǎn)權的戊糖片球菌原始土著菌種。同時，由于它來源于本地的青貯飼料，可能具有更大地適應豫西南地區(qū)天然環(huán)境的潛能。

圖1 Pediococcus pentosaceus NY001菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of Pediococcus pentosaceus NY001 strain

2.2 生長曲線的測定根據(jù)“1.2.3”方法測定戊糖片球菌的生長曲線，結果如圖2所示，依此確定PediococcuspentosaceusNY001菌株的發(fā)酵穩(wěn)定期。由圖2可知，由于在一定營養(yǎng)物質(zhì)的密閉空間內(nèi)發(fā)酵，營養(yǎng)物質(zhì)含量逐漸降低、溶液酸堿度變化等均是影響發(fā)酵后期吸光度的因素[18]，當培養(yǎng)到18 h時，菌體的濃度基本趨于穩(wěn)定，此時戊糖片球菌的生長處在穩(wěn)定期；超過18 h后，菌體的濃度不會再隨時間的延長而增加，相反地，活菌數(shù)目可能還有一定的降低。因此，在該研究中對PediococcuspentosaceusNY001菌株的發(fā)酵培養(yǎng)初步選定18 h為所考察的培養(yǎng)時間。

圖2 戊糖片球菌生長曲線Fig.2 Growth curve of Pediococcus pentosaceus

2.3 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1不同碳源對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。按照“1.2.6”方法，考察不同碳源對PediococcuspentosaceusNY001菌株生長的影響，利用稀釋涂布法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，結果如圖3所示。由圖3可知，在所考察的4類碳源中，最適的碳源為葡萄糖。以葡萄糖為碳源時，PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵18 h后發(fā)酵液中的活菌數(shù)達2.5×107CFU/mL，顯著高于其他3類碳源。這也表明該菌株利用二糖和多糖的能力較弱，可能歸因于它體內(nèi)相關的水解酶活性較低，難以將其他復合糖水解成葡萄糖進行利用。

圖3 不同碳源培養(yǎng)的活菌數(shù)比較Fig.3 Comparison of viable bacteria numbers cultured from different carbon sources

2.3.2不同碳源濃度對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)圖3，該研究選定葡萄糖為PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵的最佳碳源。然后，參照“1.2.6”方法繼續(xù)考察不同葡萄糖濃度對菌株發(fā)酵的影響，結果如圖4所示。由圖4可知，過低的葡萄糖濃度不能滿足菌體生長的基本需求，過高的葡萄糖濃度對菌體生長也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用，雖然20 g/L的葡萄糖濃度培養(yǎng)的活菌數(shù)稍低于40 g/L的葡萄糖濃度培養(yǎng)的活菌數(shù)，但考慮到后續(xù)試驗優(yōu)化條件中其他因素的相互作用，因此該研究選定40 g/L為PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵最適的葡萄糖濃度。

圖4 不同葡萄糖濃度培養(yǎng)的活菌數(shù)比較Fig.4 Comparison of viable bacteria numbers cultured at different glucose concentrations

2.3.3不同氮源對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)碳源優(yōu)化的結果，該研究選定最佳的碳源為40 g/L葡萄糖，在此基礎上再按照“1.2.7”方法繼續(xù)考察不同氮源對PediococcuspentosaceusNY001菌株生長的影響，利用稀釋涂布法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，結果如圖5所示。由圖5可知，在所考察的4類氮源中，最適的氮源為酵母粉。以酵母粉為氮源時，PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵18 h后發(fā)酵液中的活菌數(shù)達5.5×107CFU/mL，顯著高于其他3類氮源。這可能歸因于酵母粉的氮源組分與戊糖片球菌的組分更接近，因此戊糖片球菌對它的利用速率和效率均顯著高于其他氮源。

圖5 不同氮源培養(yǎng)的活菌數(shù)比較Fig.5 Comparison of viable bacteria numbers cultured from different nitrogen sources

2.3.4不同氮源濃度對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)圖5，該研究選定酵母粉為PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵的最佳氮源。然后，參照“1.2.7”方法繼續(xù)考察不同酵母粉濃度對菌株發(fā)酵的影響，結果如圖6所示。由圖6可知，過低的酵母粉濃度不能滿足菌體生長的基本需求，過高的酵母粉濃度對菌體生長也表現(xiàn)出了一定的抑制作用，因此該研究選定40 g/L為PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵最適的酵母粉濃度。

圖6 不同酵母粉濃度培養(yǎng)的活菌數(shù)比較Fig.6 Comparison of viable bacteria numbers cultured at different yeast powder concentrations

2.3.5不同無機鹽離子對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)碳源和氮源優(yōu)化的結果，該研究選定最佳的碳源為40 g/L 葡萄糖，最佳的氮源為40 g/L酵母粉，在此基礎上再按照“1.2.8”方法繼續(xù)考察不同無機鹽離子類型對PediococcuspentosaceusNY001菌株生長的影響，利用稀釋涂布法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，添加Mg2+的效果顯著高于添加Mn2+的效果，在此條件下，PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵18 h后發(fā)酵液中的活菌數(shù)達1.8×109CFU/mL，約為添加Mn2+的3倍。

2.3.6不同Mg2+濃度對戊糖片球菌發(fā)酵活菌數(shù)的影響。根據(jù)“2.3.5”可知，當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Mg2+時更有益于戊糖片球菌生長。為了進一步提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)，參照“1.2.8”方法繼續(xù)考察不同Mg2+濃度對菌株發(fā)酵的影響，結果如圖7所示。由圖7可知，過低和過高的Mg2+濃度均不利于戊糖片球菌的生長，在所考察的濃度范圍內(nèi)，1.0 g/L為最適的Mg2+濃度，在此條件下，PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵18 h后發(fā)酵液中的活菌數(shù)達2.2×109CFU/mL，約為初始發(fā)酵水平(2.5×107CFU/mL)的88倍。同時，與前人的研究相比[19]，該研究在沒有使用牛肉膏、蛋白胨等昂貴氮源的前提下，經(jīng)過18 h的發(fā)酵，發(fā)酵液中的活菌數(shù)也能達到109CFU/mL，因此該研究在一定程度上節(jié)約了生產(chǎn)成本和發(fā)酵時間，具有較強的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢和應用前景。

圖7 不同Mg2+濃度培養(yǎng)的活菌數(shù)比較Fig.7 Comparison of viable bacteria numbers at different Mg2+ concentrations

3 結論

(1)該研究從南陽地區(qū)的青貯飼料中篩選到了一株野生型乳酸菌株，經(jīng)過形態(tài)學、生理生化及16S rRNA測序鑒定，該菌株為戊糖片球菌，并將其命名為PediococcuspentosaceusNY001菌株。該菌株為南陽地區(qū)原始的土著菌種，長期適應了南陽地區(qū)的氣候、溫度、濕度等環(huán)境因素，在后續(xù)的生產(chǎn)應用中可能會具有更強的環(huán)境適應性。

(2)對PediococcuspentosaceusNY001菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的成分進行了優(yōu)化，獲得了PediococcuspentosaceusNY001菌株較優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖40 g/L、酵母粉40 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L。在此條件下，PediococcuspentosaceusNY001菌株的最大發(fā)酵活菌數(shù)可達到2.2×109CFU/mL，約為初始發(fā)酵水平的88倍。

(3)該研究為開發(fā)丹江口庫區(qū)環(huán)境適應性強、能用于獸用益生菌的土著戊糖片球菌制劑奠定了堅實的基礎，對推動南水北調(diào)中線工程后期高質(zhì)量發(fā)展有重要的意義。