李文靜，劉凌云，解 媛，史 簡(jiǎn)，李 雪，陸書華

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)寧 272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)寧 272000）

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(ListeriaMonocytogenes，LM)，是一種食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，食用受該菌污染的食物可導(dǎo)致人類感染并可能引起嚴(yán)重的李斯特菌病，該病主要發(fā)生在某些特定人群中，如孕婦、新生兒、免疫功能低下者和患有基礎(chǔ)疾病的老年人，臨床表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥、胎兒早產(chǎn)、孕婦流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致人類死亡，該病死亡率高達(dá)20%～30%[1-2]。李斯特菌病潛伏期長(zhǎng)達(dá)70天，這使得追蹤其流行病學(xué)來(lái)源變得十分困難[3]。近年來(lái)，分子分型技術(shù)作為李斯特菌病流行病學(xué)調(diào)查的重要工具，在明確LM致病性、遺傳相關(guān)性、追蹤污染源、確定傳播途徑、控制疫情暴發(fā)等方面具有重要意義。通過(guò)對(duì)LM分離株進(jìn)行分子分型可以建立臨床病例和可疑食物之間的聯(lián)系，有利于污染源的追蹤。目前，LM分子分型技術(shù)主要包括兩大類，一類是基于電泳的分型技術(shù)，另一類是基于測(cè)序的分型技術(shù)。本文就LM分子分型技術(shù)的最新研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1 基于電泳的分型技術(shù)

1.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳( pulsed-field gel electrophoresis，PFGE) PFGE最早是由哥倫比亞大學(xué)的SCHWARTZ和CANTOR于1984年開(kāi)發(fā)的一種用于分離大分子DNA或染色體的方法。該方法靈敏度高、分辨率強(qiáng)、重復(fù)性好，在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，特別是在菌株鑒定和追蹤污染源方面發(fā)揮了重要作用，被認(rèn)為是細(xì)菌分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。PFGE的基本原理是基于酶切產(chǎn)生的大小不等的DNA片段在脈沖電場(chǎng)中遷移速率的不同將DNA片段分離，經(jīng)溴化乙錠（EtBr，EB）染色后在凝膠上出現(xiàn)按DNA大小排列的電泳條帶，根據(jù)可視化條帶的差異進(jìn)行菌株型別的判斷。PA?IN等[5]人使用限制性核酸內(nèi)切酶APAI對(duì)香腸中分離出的10株LM進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)（PFGE）分型，結(jié)果顯示所有菌株的電泳圖譜之間無(wú)條帶差異，菌株亞型無(wú)法區(qū)分。SHAKUNTALA等[6]人聯(lián)合使用APAI酶和ASCI酶對(duì)印度東北部收集的47株動(dòng)物源性LM分離株進(jìn)行PFGE分析，共發(fā)現(xiàn)37種脈沖型，并指出雙酶切的使用可以大幅度地提高PFGE對(duì)LM亞型的區(qū)分度。盡管PFGE是LM分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但它所需的專業(yè)設(shè)備昂貴、耗時(shí)耗力、對(duì)人員要求高、對(duì)條帶的解釋帶有主觀性、結(jié)果分析需要采用專門的軟件，所以在臨床中未被廣泛應(yīng)用，主要應(yīng)用于科研及食品中LM的分型。

1.2 核糖體分型（ribotyping，RT） RT是基于編碼核糖體的高度保守的基因序列，用標(biāo)記的大腸埃希菌rRNA探針與限制性內(nèi)切酶切割LM全基因組所產(chǎn)生的DNA片段進(jìn)行Southern雜交而獲得帶型差異的一種分子指紋技術(shù)[7]。該技術(shù)靈敏度高、重復(fù)性好，但需要用到放射性同位素、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣、分辨力一般，不能有效區(qū)分1/2b和4b型菌株。目前，國(guó)際上已有完全自動(dòng)化的微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（automated ribotyping，AR)，它是基于RT原理，經(jīng)滅活、酶切、雜交、成像等自動(dòng)化程序，對(duì)細(xì)菌核糖體進(jìn)行指紋圖譜分析的自動(dòng)化設(shè)備。DE CESARE等[8]人基于AR研究了15種不同的酶對(duì)LM菌株鑒別的適用性，發(fā)現(xiàn)使用EcoRI，PvuII和XhoI三種限制性內(nèi)切酶不僅對(duì)LM菌株有較高的鑒別力，而且可以顯著提高4b型菌株的區(qū)分度。AR排除了人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力、高度標(biāo)準(zhǔn)化、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定，但由于AR分辨率較低，故其在菌株鑒定和分子分型方面的應(yīng)用受限，適于大樣本量菌株的初步研究[9]。

1.3 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP又稱選擇性限制片段擴(kuò)增,它是限制性酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳后得到不同分子量大小的DNA條帶，通過(guò)比較DNA條帶的差異來(lái)檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種技術(shù)[10]。目前，國(guó)外學(xué)者關(guān)于AFLP在病原微生物方面的研究比較廣泛，國(guó)內(nèi)尚不多見(jiàn)。LOMONACO等[11]人利用AFLP技術(shù)對(duì)環(huán)境及食品中的108株LM進(jìn)行分析，結(jié)果顯示AFLP可將LM菌株分成兩個(gè)遺傳譜系，包括譜系I（血清型1/2b，4b，3b)和譜系II(血清型1/2a，1/2c，3a)。FONNESBECH VOGEL等[12]人指出，AFLP技術(shù)能夠區(qū)分LM和其他李斯特菌種，并對(duì)96株LM進(jìn)行了分型，主要分為2個(gè)簇，相似度為82%。其中，I簇包括32種AFLP類型，II簇包括13種AFLP類型，其余為其他李斯特菌種和反硝化菌株。AFLP技術(shù)不僅具有重復(fù)性好、靈敏度高、分辨率高、DNA用量少等優(yōu)勢(shì)，還可以揭示菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，適于基因組同源性高的生物群的研究，但由于引物需要同位素標(biāo)記，對(duì)樣品DNA質(zhì)量要求嚴(yán)格、制備和進(jìn)行凝膠電泳所需時(shí)間長(zhǎng)以及對(duì)帶型的解釋和分析帶有主觀性而受到一定的限制。

1.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragment length polymorphism，RFLP） RFLP是一種利用限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別雙鏈DNA的某一段序列，并在特定位置進(jìn)行DNA雙鏈切割，進(jìn)而產(chǎn)生長(zhǎng)度大小不等的限制性片段，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，比較DNA多態(tài)性的基因分型技術(shù)[13]。RIP等[14]人針對(duì)LM設(shè)計(jì)了一種基于hly基因的PCR-RFLP新方法，該方法可將LM區(qū)分為三個(gè)譜系組：譜系Ⅰ（血清型1/2b，3b，4b，4d，4e和7）、譜系Ⅱ（血清型1/2a，1/2c，3a和3c）和譜系III（血清型4a和4c），并用其他方法驗(yàn)證了PCR-RFLP方法的有效性和可靠性，認(rèn)為該法可作為L(zhǎng)M血清型譜系組分類的一種替代方法。RFLP技術(shù)操作簡(jiǎn)單、無(wú)需探針標(biāo)記、實(shí)驗(yàn)設(shè)備比較普及、成本低、不依賴自動(dòng)化設(shè)備，但通量低、部分結(jié)果不容易判斷，適于硬性條件不好的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行低通量的分子檢測(cè)。

1.5 多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分型(multilocus variable number of tandem repeat analysis，MLVA) MLVA是通過(guò)檢測(cè)基因組中特定位點(diǎn)上串聯(lián)重復(fù)序列可變拷貝數(shù)之間的差異來(lái)推斷菌株間遺傳進(jìn)化關(guān)系的一種分子分型技術(shù)[15]。近年來(lái)，MLVA已被廣泛應(yīng)用于LM菌株分型。MARTíN等[16]采用MLVA對(duì)從肉制品和肉制品加工廠中分離的113株LM進(jìn)行分型，共獲得27個(gè)不同的MLVA譜，Simpson多樣性指數(shù)為0.907，證實(shí)了MLVA是鑒別LM菌株的一種常用的、快速的、可靠的亞型分型方法。MIYA等[17]通過(guò)比較MLVA，MLST，PFGE和Ribotyping，發(fā)現(xiàn)這四種技術(shù)鑒別能力大小排序?yàn)椋篗LVA＞PFGE＞MLST＞Ribotyping，其中，MLVA對(duì)4b型菌株的鑒別能力最高，它可將4b型菌株分為三組(ECI，ECIa和ECII)，結(jié)果更容易解釋。MLVA只需常規(guī)的PCR和標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳即可完成，結(jié)果可在DNA提取后不到8h內(nèi)獲得，具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高通量、重復(fù)性好、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，不僅能確定基因多態(tài)性，而且能揭示菌株群體遺傳的結(jié)構(gòu)特征，可作為減輕PFGE工作量的一種有用的篩選方法。此外，該技術(shù)將檢測(cè)結(jié)果數(shù)字化，減少了在結(jié)果分析過(guò)程中的主觀因素，便于不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的比較[18]。

1.6 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD) RAPD又稱任意引物PCR，是由WILLIAMS和WELSH于1990年首次提出并發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的遺傳標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)[19]是以PCR為基礎(chǔ)，利用隨機(jī)合成的寡核苷酸片段作為引物,在低退火溫度下擴(kuò)增目的基因組DNA，經(jīng)凝膠電泳分離，分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段多態(tài)性的一種分子生物技術(shù)。BYUN等[20]人為了解進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)肉類中LM的流行病學(xué)特點(diǎn)，利用RAPD技術(shù)對(duì)54株LM分離株進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)用三種引物組合可將LM分為40個(gè)類型，并且證實(shí)了韓國(guó)與美國(guó)牛肉分離株、韓國(guó)與丹麥豬肉分離株之間的親緣關(guān)系，上述結(jié)果表明，RAPD不僅可作為L(zhǎng)M流行病學(xué)研究中一種有效的分型工具，還可以揭示LM菌株間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。該技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、靈敏、成本低、DNA用量少，結(jié)果易于解釋，但由于它采用的是隨機(jī)引物擴(kuò)增并使用了較低的退火溫度，故它的穩(wěn)定性及重復(fù)性較差，可用于少量菌株的快速分型及流行病學(xué)追蹤。

2 基于測(cè)序的分型技術(shù)

2.1 多位點(diǎn)序列分型( multilocus sequence typing，MLST) MLST是參照法國(guó)巴斯德研究所的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bigsdb.pasteur.fr/listeria/listeria.html）操作流程，對(duì)7個(gè)管家基因（abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，hkA）PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析，確定其序列類型（sequence type，ST）的一種方法[21]。LU等[22]人對(duì)2008～2019年從中國(guó)患者的血液、腦脊液、胎膜、胎盤等標(biāo)本中分離出的144株LM進(jìn)行MLST分型研究，發(fā)現(xiàn)所有菌株被分為23個(gè)ST型，ST87(49株，34.0%)最常見(jiàn)，其次為ST1(18株，12.5%)，ST8(10株，6.9%)，ST619(9株，6.3%)，ST7(7株，4.9%)和ST3(7株，4.9%)。ZHANG等[23]人使用MLST技術(shù)對(duì)2014～2018年中國(guó)北京從臨床感染病例中分離出的120株LM進(jìn)行分型分析，所有菌株被分為25個(gè)ST型，ST8最常見(jiàn)，其次是ST87和ST5。CHEN等[24]人利用MLST技術(shù)對(duì)中國(guó)43個(gè)代表性城市新鮮蔬菜中分離出的30株LM進(jìn)行研究，30株LM被分為9個(gè)ST型，其中ST87和ST8占優(yōu)勢(shì)。CHEN等[25]人報(bào)道從中國(guó)即食食品和巴氏殺菌乳中分離出的48株LM亦以ST87和ST8為主。綜上所述，ST87，ST8和ST5在中國(guó)食品和臨床分離菌中占優(yōu)勢(shì)，是引起中國(guó)人類李斯特菌病的主要序列型。然而，國(guó)外最常見(jiàn)和報(bào)道最廣泛的序列型是ST1和ST9[26]。加強(qiáng)上述常見(jiàn)ST型的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)不僅有利于李斯特菌病的預(yù)防與控制，還可以揭示LM菌株的種群結(jié)構(gòu)，從廣泛的地理、時(shí)間和流行病學(xué)來(lái)源推斷菌株之間的進(jìn)化關(guān)系。MLST是一種成熟的、國(guó)際通用的、基于群體的菌株分化技術(shù)，該技術(shù)特異性強(qiáng)、分辨率高、實(shí)驗(yàn)結(jié)果可在不同的實(shí)驗(yàn)室間共享。與PFGE相比，MLST更具鑒別力，能夠進(jìn)一步區(qū)分PFGE無(wú)法區(qū)分的類型，被廣泛應(yīng)用于LM的流行病學(xué)調(diào)查和暴發(fā)期間特異性菌株的來(lái)源追蹤。

2.2 多毒力位點(diǎn)序列分型(multi-virulence-locus sequence typing，MVLST) MVLST是一種基于MLST用進(jìn)化較快的毒力和毒力相關(guān)基因（prfA，inlB，inlC，dal，clpP和lisR）代替管家基因?qū)Σ≡⑸镞M(jìn)行分型的一種新技術(shù)。ZHANG等[27]人利用LM的3個(gè)毒力基因(prfA，inlB，inlC)和3個(gè)毒力相關(guān)基因(dal，lisR，clpP)對(duì)28株LM進(jìn)行MVLST分析，發(fā)現(xiàn)與MLST相比，MVLST對(duì)血清型1/2a和4b的鑒別力更高。ZHANG等[28]人利用MVLST技術(shù)對(duì)從中國(guó)食品中分離出的73株LM進(jìn)行分析，共確定了18個(gè)毒力型，31.5%的分離株屬于流行克隆，包括ECI，ECIV，ECV，ECVI，ECVIII和ECXI，其中以ECV為主。KIM等[29]人對(duì)2002～2014年從美國(guó)奶牛場(chǎng)中分離出的121株LM進(jìn)行MVLST分析，共鑒定出59個(gè)毒力型，25%的分離株被確定為流行克隆。LM在國(guó)內(nèi)外廣泛流行，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品衛(wèi)生的管理與監(jiān)督，盡量避免人類因食用受污染的食物而感染LM。MVLST鑒別能力高，分型能力強(qiáng)，適用于當(dāng)?shù)囟玖投玖ο嚓P(guān)基因進(jìn)化更快的菌株的流行病學(xué)研究。

2.3 全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS） WGS是在基因水平上對(duì)病原菌進(jìn)行測(cè)序并分析其遺傳信息的一種新興技術(shù)。WGS作為一種流行病學(xué)工具不僅可以識(shí)別高度相關(guān)的LM，而且還可以用來(lái)檢測(cè)與高毒力或特定致病模式相關(guān)的毒力島的存在，在了解LM的遺傳變異、地理起源、進(jìn)化狀況、未來(lái)監(jiān)測(cè)方向、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及追蹤溯源等方面發(fā)揮了重要作用，越來(lái)越多地被應(yīng)用于疫情的檢測(cè)和調(diào)查。GUIDI等[30]人使用WGS方法對(duì)屠宰場(chǎng)中分離出的122株LM進(jìn)行研究，共檢出5個(gè)CCs: CC1-ST1(21.3%)，CC6-ST6(22.9%)，CC9-ST9(44.2%)，CC121-ST121(10.6%)和CC193-ST193(0.8%)，其中，CC9和CC121被定義為低毒性克隆，CC1和CC6被定義為高毒性克隆，并發(fā)現(xiàn)高毒性克隆CC1和CC6屠宰場(chǎng)中存在的時(shí)間更長(zhǎng)，這些發(fā)現(xiàn)表明，高毒性LM克隆存在嚴(yán)重的食品污染風(fēng)險(xiǎn)，與人類李斯特菌病相關(guān)。LI等[31]人應(yīng)用WGS技術(shù)對(duì)中國(guó)11個(gè)省份2013～2019年收集的360株LM臨床分離株進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢出25個(gè)CCs，其中CC87，CC8和CC5是引起人類李斯特菌病的常見(jiàn)克隆復(fù)合體，此外，他們還發(fā)現(xiàn)所有臨床分離株LIPI-1，LIPI-3和LIPI-4均為陽(yáng)性，且LIPI-4陽(yáng)性菌株中的CC87，ST619，ST382，CC4和CC2已被證明具有高毒力。YIN等[32]人利用WGS分析中國(guó)侵襲性李斯特菌病病例中LM分離株的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)ST87在中國(guó)占優(yōu)勢(shì)，系統(tǒng)發(fā)育樹顯示從臨床病例和零售食品中分離出的ST87親緣關(guān)系十分密切，這說(shuō)明人類感染李斯特菌很有可能是由食品傳播給人類的，因此，我們應(yīng)多關(guān)注ST87的毒力因素及致病機(jī)理，為李斯特菌病的控制和預(yù)防打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。WGS具有高度鑒別力，對(duì)LM流行菌株的檢測(cè)和分析更加準(zhǔn)確，現(xiàn)已成為L(zhǎng)M分子分型的新的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管WGS在疫情調(diào)查中具有優(yōu)勢(shì)，但由于基礎(chǔ)設(shè)施和資源的不足，對(duì)許多國(guó)家來(lái)說(shuō)，WGS的廣泛應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性。

3 分子血清分型

除以上兩大類分子分型技術(shù)外，分子血清分型( molecular serotyping)也是一種經(jīng)典的區(qū)分LM的方法。分子血清分型[34]是利用多重PCR擴(kuò)增LM血清型目標(biāo)基因lmo0737，lmo1118，ORF2819，ORF2110和prs，從而對(duì)LM進(jìn)行血清型分型的一種技術(shù)。目前，LM已鑒定出14種血清型，其中1/2a，1/2b和4b型與96%以上的人類李斯特菌病有關(guān)，1/2a在食物中常見(jiàn)，4b在臨床分離株中常見(jiàn)[33]。SHEN等[35]人利用分子血清分型技術(shù)對(duì)中國(guó)2018～2020年食品中檢測(cè)出的81株LM進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)1/2a占優(yōu)勢(shì)，分離物以豬肉為主，這與世界范圍內(nèi)之前所報(bào)道的一致。VALLEJO等[36]人利用分子血清分型技術(shù)對(duì)西班牙北部某地區(qū)2010～2020年從臨床樣本中分離出的111株LM進(jìn)行研究，結(jié)果顯示4b在臨床感染病例中最常見(jiàn)(53.2%，59株)，其次是1/2b(27%，30株)，1/2a(18.9%，21株)和1/2c(1株)，該數(shù)據(jù)更加印證了4b在臨床分離株中常見(jiàn)這一結(jié)論。分子血清分型是最常用和使用最廣泛的分型技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性較好，特別適合于疫情暴發(fā)時(shí)的快速檢測(cè)和李斯特菌病的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。

4 總結(jié)與展望

產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(LM)作為一種食源性致病菌，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。分子分型技術(shù)作為食源性疾病流行病學(xué)調(diào)查的重要工具必不可少，上述分型技術(shù)各有利弊，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件及研究需求選擇一種或聯(lián)合使用多種分型技術(shù)。理想的分型技術(shù)應(yīng)該具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度強(qiáng)、特異度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，WGS對(duì)LM遺傳相似的分離株的區(qū)分度更高，已成為L(zhǎng)M分子分型的新的金標(biāo)準(zhǔn)，未來(lái)隨著測(cè)序成本的下降，WGS有可能取代其它分型技術(shù)成為細(xì)菌分子分型的有力工具，為細(xì)菌的致病性、耐藥機(jī)制、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供有效依據(jù)。