談 婷 ，姜友軍 ，袁華山 ，拾 強(qiáng) ，黃文杰 ，鄧 慶 ，董珊珊 ，韓培培 ，周云維 ，肖理文

（1.上海飛測生物科技有限公司，上海 201400；2.中儲糧質(zhì)檢中心有限公司，北京 100043；3.中儲糧江蘇質(zhì)檢中心有限公司，南京 211155；4.中央儲備糧上海直屬庫有限公司，上海 200241；5.廣西中儲糧糧油質(zhì)監(jiān)中心，南寧 530200；6.南京微測生物科技有限公司，南京 210031）

我國是受真菌毒素污染最嚴(yán)重的國家之一。 根據(jù)國家糧食和物資儲備局不完全統(tǒng)計， 我國每年因真菌毒素污染造成的糧食損失累計達(dá)3 000 多萬噸，超過陜西、甘肅、青海、寧夏及西藏5 個西部省區(qū)全年糧食產(chǎn)量的總和， 直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)600~800億元[1-3]。 真菌毒素是產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的，可通過污染谷物、飼料或經(jīng)動物源性食品進(jìn)入食物鏈[4-6]，對人類和動物健康造成致癌、致畸、致突變等傷害[7-9]。

目前市場上糧油真菌毒素的檢測采用快檢和大型儀器檢測相結(jié)合的方式[10-13]。 快檢用于大量樣品的初篩及現(xiàn)場檢測，檢測樣品量大，操作快速簡便，儀器和耗材成本低，已被廣泛使用；大型儀器設(shè)備主要用于法檢或可疑陽性樣品的確證， 儀器設(shè)備以進(jìn)口為主，價格昂貴，對檢測環(huán)境和操作人員要求高，檢測通量低，時間長[14-16]。 因此，快檢作為真菌毒素檢測的技術(shù)手段已被政府監(jiān)管部門和企業(yè)廣泛接受和采用。但是，目前快檢產(chǎn)品大部分都是基于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法和膠體金免疫層析法， 雖然操作快速簡便，但靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較低，全手工操作，無法滿足日趨嚴(yán)格的糧食質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)和要求， 且均為一個卡（條）檢測一個項(xiàng)目，還沒有多合一的檢測卡出現(xiàn)。

本文研制了一種基于時間分辨熒光納米微球的黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一熒光定量快速檢測卡（簡稱ADZ 熒光定量快速檢測卡）， 并通過對多種糧食谷物飼料樣品檢測，驗(yàn)證了該真菌毒素三合一熒光定量快速檢測卡的技術(shù)性能， 實(shí)現(xiàn)了糧食中真菌毒素類多合一的快速、簡便、準(zhǔn)確、定量、自動化檢測。

1 主要試驗(yàn)材料

1.1 試劑

時間分辨熒光微球， 南京微測生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1 單抗、黃曲霉毒素B1 抗原、嘔吐毒素單抗、嘔吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮單抗、玉米赤霉烯酮抗原，均為自制；黃曲霉毒素B1（AFB1）標(biāo)準(zhǔn)品、嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品、玉米赤霉烯酮（ZEN）標(biāo)準(zhǔn)品均來自國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院。

1.2 耗材

硝酸纖維素膜（NC 膜），美國 Millipore 公司；樣品墊（玻璃纖維），美國奧斯龍；吸水紙、PVC 膠板，上海金標(biāo)生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

GL-21M 高速冷凍離心機(jī)， 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-600 型熒光定量快速檢測儀，上海飛測生物科技有限公司；DHG-9620A 電熱鼓風(fēng)干燥箱， 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；XYZ 3060劃膜儀，美國Biodot；HGS510 峰航劃膜噴金儀，杭州峰航科技有限公司；FD-2200 型檢測卡恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司；HGS201 可編程切條機(jī)，杭州峰航科技有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)記抗體熒光膠乳的制備

（1）黃曲霉毒素 B1 膠乳（簡稱 AFB1 膠乳）、嘔吐毒素膠乳 （簡稱DON 膠乳）、 玉米赤霉烯酮膠乳（簡稱ZEN 膠乳）的制備，三種膠乳標(biāo)記工藝都是采用一步直接偶聯(lián)法。

取40 μL 時間分辨熒光微球1 加入到360 μL活化緩沖液中，加入 10 mg/mL EDC 12 μL，37 ℃搖床振蕩 30 min。 15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。用標(biāo)記緩沖液重懸至400 μL，振蕩混勻。 加入一定量的標(biāo)記抗體， 振蕩混勻后于 37 ℃搖床反應(yīng)120min。 15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。 用封閉緩沖液重懸至400 μL， 振蕩混勻后于37 ℃搖床反應(yīng) 30 min。 15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。 用微球稀釋液重懸至400 μL，振蕩混勻，備用。

（2）雞 IgY 膠乳（簡稱 IgY 膠乳）的制備時間分辨熒光微球1 標(biāo)記雞IgY 抗體采用的是一步直接偶聯(lián)法。

取40 μL 時間分辨熒光微球1 加入到360 μL活化緩沖液中，加入 10 mg/mL EDC 12 μL，37 ℃搖床反應(yīng) 30 min。 15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。用標(biāo)記緩沖液重懸至400 μL，振蕩混勻。 加入一定量的雞IgY 抗體， 振蕩混勻后于37 ℃搖床反應(yīng)60min。15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。 用封閉緩沖液重懸至400 μL， 振蕩混勻后于37 ℃搖床反應(yīng)30min。15 000 r/min 離心 10 min，棄上清。 用微球稀釋液重懸至400 μL，振蕩混勻，備用。

（3）黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素膠乳（簡稱ADZ 膠乳）的制備，根據(jù)AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳、IgY 膠乳各自的調(diào)試結(jié)果，確認(rèn)各自膠乳的稀釋倍數(shù)。

取一定量的微球稀釋液， 分別加入一定比例的AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳、IgY 膠乳，充分混合后，即得ADZ 膠乳。

2.2 熒光定量快速檢測卡的制備

2.2.1 ADZ 膠乳結(jié)合墊的制備

在45%~65%的濕度和18~26 ℃的溫度下，將ADZ 膠乳用峰航劃膜噴金儀噴涂于結(jié)合墊上，噴膜量4~8 μL/cm，噴完后在該環(huán)境下繼續(xù)平鋪放置4~6 h， 后轉(zhuǎn)入提前設(shè)置37 ℃的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥4h，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 ADZ 包被抗原大卡的制備

定義140 膜靠近吸水紙端為上端， 分別在140NC 膜距離上端 4 mm、8 mm、12 mm、16 mm、20mm 處依次為 C、T1、T2、T3 線。 將 140 NC 膜貼于PVC 膠板上， 于45%~65%的濕度和18~26 ℃的溫度下平衡2 h。 用XYZ 3060 劃膜儀分別在NC 膜上的 C、T1、T2、T3 線處， 依次包被已用抗原稀釋液稀釋到0.1~0.2 mg/mL 的黃曲酶毒素B1 抗原、嘔吐毒素抗原、玉米赤霉烯酮抗原，包被量為0.5~0.8 μL/cm。 包被結(jié)束后，在該環(huán)境下干燥4~6 h，后轉(zhuǎn)入提前設(shè)置37 ℃的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥72 h， 干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 ADZ 熒光定量快速檢測卡的組裝

在10%~30%的濕度和18~26 ℃的溫度下，在長8 cm 的ADZ 大卡上，依次搭接樣品墊、ADZ 膠乳結(jié)合墊、吸水紙，切成4 mm 寬的細(xì)條，放入塑料卡殼中，用壓殼機(jī)壓緊，裝入鋁箔袋中，加入1 包1 g 的干燥劑，密封保存即可。

2.3 樣本的檢測

2.3.1 樣本前處理

取有代表性的待測樣品（玉米、小麥、大米、加工副產(chǎn)物等）500 g， 用小型粉碎機(jī)粉碎1 min 后過20目篩，收集過篩后的細(xì)小樣品用于試驗(yàn)。稱取過篩后的樣品（5.00 g±0.03 g）于 50 mL 離心管中，量筒量取25 mL 樣品提取液 （50%乙醇水+2%氯化鈉），旋渦混勻器振蕩提取3 min， 提取結(jié)束后， 離心機(jī)4000r/min 離心2 min，取上清液待用。

2.3.2 檢測過程

取 100 μL 離心后上清液加入 1 000 μL 樣品稀釋液中， 用旋渦混勻器混勻3~5 s， 然后取100 μL加入到ADZ 熒光定量快速檢測卡的加樣孔中，水平放置于FD-2200 檢測卡恒溫孵育器上37 ℃恒溫孵育8 min， 孵育器孵育8 min 結(jié)束后將檢測卡插入FD-600 型熒光定量快速檢測儀中，讀數(shù)值即為樣品的實(shí)際檢測濃度值。 若檢測濃度值大于設(shè)定的定量值時， 可用提取液將離心上清液稀釋5 倍后再進(jìn)行檢測， 所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)稀釋倍數(shù)即為最終檢測結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)方案

分別優(yōu)化本項(xiàng)目中需要使用的時間分辨納米微球的整個制備工藝、玉米赤霉烯酮（簡稱ZEN）的靈敏度低、黃曲霉毒素B1（簡稱AFB1）的均一性差、樣本檢測C 線線條擴(kuò)散問題等等，分別進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)。其中，熒光微球制備工藝的效果確定基于陰性樣本檢測的T 線熒光強(qiáng)度；ZEN 靈敏度的最佳工藝的確定基于陰性樣本T 線、C 線的熒光強(qiáng)度比值和不同濃度點(diǎn)的ZEN 陽性樣本的競爭抑制率；AFB1均一性優(yōu)化的最佳工藝確定基于檢測AFB1 不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品的變異系數(shù)和檢測卡展層； 樣本檢測C 線線條擴(kuò)散問題的解決的最佳工藝的確定基于C值的波動情況；

3.1 靈敏度優(yōu)化

3.1.1 高效率時間分辨熒光納米微球探針的制備工藝優(yōu)化

ADZ 熒光定量快速檢測卡的標(biāo)記工藝采用的是南京微測生物自主研發(fā)的時間分辨熒光納米微球，通過對包裹技術(shù)的優(yōu)化和改良，納米微球中銪離子的密度可提升到20 萬個/微球， 包裹完熒光離子后，在微球表面再進(jìn)行葡聚糖修飾，大大提升了微球的穩(wěn)定性和對可逆環(huán)境的抗干擾性，如圖1。 南京微測生物的微球種類多，有不同粒徑、不同表面羧基含量、不同長短的碳原子手臂等等，可選擇性更多。

圖1 時間分辨熒光納米微球示意圖

由于ADZ 熒光定量快速檢測卡， 集AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳于一體，故膠乳量的多少對整個產(chǎn)品的均一性有很大的影響， 故選擇熒光強(qiáng)度極高的熒光微球極為重要。 本項(xiàng)目對比了三家時間分辨熒光微球，都是包裹的稀土熒光離子銪，分別為賽默飛200 nm 微球、Bangs 200 nm 微球、南京微測生物210 nm 熒光微球。 用這三款微球分別標(biāo)記了AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳。

3.1.2 時間分辨熒光納米微球的選擇

ADZ 熒光定量快速檢測卡中ZEN 的靈敏度低，本項(xiàng)目進(jìn)行了ZEN 靈敏度優(yōu)化。選擇了四個不同長短的碳原子手臂的210 nm 熒光微球進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比， 分別選擇 0 原子手臂、6 原子手臂、200 原子手臂、1 000 原子手臂的熒光微球。

3.2 均一性優(yōu)化

ADZ 熒光定量快速檢測卡采用的是干式免疫熒光側(cè)向流層析法， 當(dāng)時間分辨熒光膠乳隨樣本一起向上爬NC 膜時，其跑板的速度均一性、跑板時整個樣本膠乳混合物的均一性都會影響到整個抗原與抗體結(jié)合的均一性，直接影響了T 線、C 線熒光值讀數(shù)的均一性，從而影響了整個檢測卡的性能，尤其是變異系數(shù)（CV）。ADZ 熒光定量快速檢測卡在開發(fā)過程中，難點(diǎn)之一是黃曲霉毒素B1 的CV 優(yōu)化，即均一性優(yōu)化。

3.2.1 樣品墊的選擇

針對ADZ 熒光定量快速檢測卡的AFB1 均一性差的問題，本項(xiàng)目進(jìn)行了樣品墊的選擇。選擇了美國奧斯龍的8964、上海捷寧生物的G-6、美國奧斯龍8965 這三款樣品墊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對比，主要考量爬條速度、前鋒液流均一性等。

3.2.2 樣品墊的優(yōu)化處理

根據(jù)3.2.1 中選出的一款最佳樣品墊，在此基礎(chǔ)上，對比了幾種樣品墊緩沖液配方，主要改變了緩沖液中的糖量、表活量、蛋白量等。 本實(shí)驗(yàn)一共比較了三種配方， 對比三種緩沖液處理樣品墊后對AFB1變異系數(shù)、圖譜展層的優(yōu)化效果。

3.3 準(zhǔn)確度的優(yōu)化

ADZ 熒光定量快速檢測卡在檢測部分樣本的過程中， 發(fā)現(xiàn)了C 線線條擴(kuò)散問題， 從而影響了C線熒光讀值，C 值忽高忽低，波動較大，進(jìn)一步影響到樣本準(zhǔn)確度。本項(xiàng)目從原稀釋液方面進(jìn)行了優(yōu)化，從C 值強(qiáng)弱等角度考量。

3.3.1 抗原稀釋液

抗體/抗原劃膜稀釋液的選擇也極為重要，本項(xiàng)目嘗試了三種緩沖體系的C 線抗體劃膜稀釋液，分別是碳酸緩沖液、磷酸緩沖液、檸檬酸鈉緩沖液。

4 結(jié)果與討論

4.1 靈敏度優(yōu)化

4.1.1 高效率時間分辨熒光納米微球探針的制備工藝優(yōu)化

本項(xiàng)目對比了三家時間分辨熒光微球， 都是包裹的稀土熒光離子銪，分別為賽默飛200 nm 微球、Bangs 200 nm 微球、 南京微測生物210 nm 熒光微球。 用這三款微球分別標(biāo)記了AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳。 取一定量的微球稀釋液，分別加入一定比例的 AFB1 膠乳、DON 膠乳、ZEN 膠乳、IgY 膠乳，充分混合后，即得ADZ 膠乳，將ADZ 膠乳噴涂在結(jié)合墊上，烘干后，與ADZ 大卡匹配后檢測。如圖2， 從左往后， 依次是賽默飛 200 nm 微球、Bangs 200nm 微球、南京微測生物210 nm 熒光微球的陰性樣本的檢測卡的紫外照射圖， 從圖中可以明顯看出T 線的熒光強(qiáng)度從左往右依次增強(qiáng)， 尤其是南京微測生物210 nm 熒光微球的T 線熒光最強(qiáng)最亮。

圖3 顯示的是圖2 中三條檢測卡對應(yīng)的檢測圖譜， 圖譜中可以看到 T1 值、T2 值、T3 值、C 值，從左往右， 依次是賽默飛200 nm 微球、Bangs 200 nm微球、 南京微測生物210 nm 熒光微球的陰性樣本的檢測卡的檢測圖譜，同樣，直觀地看出，南京微測生物210 nm 熒光微球的信號最強(qiáng)。 南京微測生物自主研發(fā)了增強(qiáng)型時間分辨熒光微球， 標(biāo)記效率提高了3 000 倍以上， 對于真菌毒素三合一檢測卡的性能而言，一是可以提高效價與靈敏度，二是可以用更少的標(biāo)記抗體熒光膠乳，有助于均一性的改善。

圖2 采用不同制備工藝的熒光微球的ADZ 檢測卡紫外照射圖

圖3 采用不同制備工藝的熒光微球的ADZ 檢測卡檢測圖譜

4.1.2 時間分辨熒光納米微球的選擇

南京微測生物基于自主研發(fā)的高效率增強(qiáng)型的時間分辨熒光微球的工藝上，進(jìn)一步進(jìn)行了改良，在微球表面分別修飾了不同長度的碳鏈， 做出不同碳原子手臂的時間分辨熒光微球， 給不同產(chǎn)品提供了微球多樣性選擇， 滿足了不同產(chǎn)品或者同一產(chǎn)品不同性能需求的工藝優(yōu)化。 從理論上講， 原子手臂越長，標(biāo)記抗體與微球間的空間位阻將大大減少，有助于提高標(biāo)記抗體的偶聯(lián)效率。但是，具體使用效果還需結(jié)合不同項(xiàng)目具體對比分析。 表1 中對比了南京微測生物的4 種不同數(shù)量的碳原子手臂的熒光微球標(biāo)記ZEN 膠乳的不同濃度點(diǎn)的陽性樣本與陰性樣本的競爭抑制率， 分別選擇0 原子手臂、6 原子手臂、200 原子手臂、1000 原子手臂的熒光微球。 從表1 中的數(shù)據(jù)得出：0 原子手臂的靈敏度最低，其50μg/kg 的樣本抑制率才26.5%；200 原子手臂的靈敏度最強(qiáng)， 其 10 μg/kg 的樣本抑制率已經(jīng)達(dá)21.49%，且從整體T/C 值的分布看，200 原子手臂的拉開幅度更開，10~1 000 μg/kg 抑制率達(dá)21.49%~96.47%；1 000 原子手臂的T/C 值拉開幅度雖然也很開，10~1 000 μg/kg 抑制率達(dá) 12.73%~96.36%，但是靈敏度不如200 原子手臂的。本項(xiàng)目中ZEN 膠乳標(biāo)記工藝中最終選擇了南京微測生物的200 原子手臂的時間分辨熒光微球。

表1 碳原子手臂的時間分辨熒光微球?qū)EN 靈敏度的影響

4.2 均一性優(yōu)化

4.2.1 樣品墊的選擇

樣品墊在免疫層析方法學(xué)中的主要作用就是起到過濾樣本、緩沖樣本、調(diào)節(jié)樣本流速等作用，研發(fā)人員還會根據(jù)產(chǎn)品的特性，對樣品墊進(jìn)行預(yù)處理，保證樣本在樣品墊形成的通道中快速地流動而不被非特異性的吸附或者改變樣本的性質(zhì)。 本項(xiàng)目對比了美國奧斯龍的8964、上海捷寧生物的G-6、美國奧斯龍的8965 這三款樣品墊的爬條速度、前鋒液流均一性等，結(jié)果見表2 與圖4。 從表2 中可以得出，上海捷寧生物的G-6 的跑條時間最短，爬完窗口用時47 s；其次是美國奧斯龍的8964，用時52 s；最后是美國奧斯龍的8965，用時最長，達(dá)1 min 4 s 。

表2 不同樣品墊的爬條時間

圖4 是采用不同樣本墊的ADZ 熒光定量快速檢測卡，同時加樣爬條，爬條20 s 時的爬條速度直觀圖。從圖4 也能看出，圖中從左到右依次是用了美國奧斯龍的8964、上海捷寧生物的G-6、美國奧斯龍的8965 樣品墊， 可見上海捷寧生物的G-6 的爬條速度最快，且其前鋒液流比較均一，未出現(xiàn)鋸齒狀的前鋒。所以ADZ 熒光定量快速檢測卡采用了上海捷寧生物的G-6 樣品墊。

圖4 不同樣品墊的爬條速度直觀圖

4.2.2 樣品墊的優(yōu)化處理

在上海捷寧生物G-6 樣品墊的基礎(chǔ)上，對樣品墊緩沖液進(jìn)一步優(yōu)化。免疫層析中，糖量對改善膠乳的殘留問題有一定的效果， 使得膠乳能夠完全地釋放到NC 膜上； 表面活性劑， 可以改變一定的疏水性，讓層析過程更加均一；惰性蛋白（如BSA、酪蛋白等）起到封閉的作用，可以流動中封閉，大大減少非特異性吸附。 本項(xiàng)目從糖量、表面活性劑量、蛋白量三個角度進(jìn)行了樣品墊緩沖液配方優(yōu)化。 表3 中共列了三個樣品墊緩沖液配方，配方1 中無蛋白，配方2 中無蔗糖， 配方3 在配方2 的基礎(chǔ)上加大了表面活性劑量。

表3 三種樣品墊緩沖液配方表

用以上3 種樣品墊緩沖液配方處理上海捷寧生物G-6 樣品墊，烘干后，對比了對檢測卡的展層圖譜，如圖 5、圖 6、圖 7。 對比 3 張圖的曲線平整度，顯而易見，圖7 中配方3 的展層最平整，基線較平滑；而圖5 的配方1 的展層左邊上揚(yáng)， 說明膠乳在檢測時間8 min 到達(dá)時還未爬完NC 膜，爬速略慢；圖6的配方2 的展層雖然整體看平整， 但是在兩個峰之間的基線不平整， 說明膠乳在兩條包被線之間分布不均，展板不均一；這些因素都會體現(xiàn)在檢測卡的變異系數(shù)（CV）上。

圖5 樣品墊緩沖液配方1 展層圖譜

圖6 樣品墊緩沖液配方2 展層圖譜

圖7 樣品墊緩沖液配方3 展層圖譜

將上面3 種樣品墊緩沖液配方的樣品墊分別貼于黃曲霉毒素B1 的檢測卡上進(jìn)行變異系數(shù)比較，檢測黃曲霉毒素 B1 的 5、10、25、50 μg/kg 濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品，記錄 C 值、T 值，計算 T/C 值、T/C 值的變異系數(shù)（CV），結(jié)果見表 4。

表4 三種樣品墊緩沖液配方的變異系數(shù)對比

由表4 中黃曲霉毒素B1 的4 個標(biāo)準(zhǔn)品濃度點(diǎn)的變異系數(shù)大小比較后得出， 配方3 的每個濃度點(diǎn)的變異系數(shù)最小，配方1 的變異系數(shù)最大。故本項(xiàng)目中樣品墊緩沖液配方選擇配方3。

4.3 準(zhǔn)確度優(yōu)化

4.3.1 抗原稀釋液

本項(xiàng)目在開發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)了C 值波動巨大的問題，一是影響了檢測卡的均一性，二是嚴(yán)重影響了檢測的準(zhǔn)確度，針對這一問題，研發(fā)人員從抗原稀釋液種類進(jìn)行了優(yōu)化， 本項(xiàng)目嘗試了三種緩沖體系的C 線抗體劃膜稀釋液，分別是碳酸緩沖液（CBS）、磷酸緩沖液（PBS）、檸檬酸鈉緩沖液（NMS），對比了50mM CBS+5%蔗糖、50mM PBS+5%蔗糖、50mM NMS+5%蔗糖這三種抗原劃膜液的C 值波動情況，結(jié)果見圖8。 由圖8 中的3 條曲線， 很直觀地看出50mM PBS+5%蔗糖的C 值曲線波動很平緩，50mM CBS+5%蔗糖的C 值波動幅度大。 故本項(xiàng)目選擇50mM PBS+5%蔗糖的抗原稀釋液。

圖8 抗原稀釋液對C 值的影響

5 結(jié)論

本文成功優(yōu)化了一種快速、簡易、省時省力地檢測糧食谷物中的黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一熒光定量快速檢測卡。 該方法用時間分辨熒光微球分別標(biāo)記曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮單克隆抗體作為分析探針，黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮抗原偶聯(lián)物作為競爭抗原，以羊抗鼠IgG 作為控制抗體，進(jìn)行黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮的檢測分析。 該方法快速便捷，一次提取，一次檢測，8 min 內(nèi)即可得到3個項(xiàng)目的檢測結(jié)果。 利用熒光微球的光電信號的強(qiáng)弱，可進(jìn)行定量檢測。

本項(xiàng)目成功優(yōu)化了黃曲霉毒素B1/嘔吐毒素/玉米赤霉烯酮真菌毒素三合一熒光定量快速檢測卡的時間分辨納米微球的整個制備工藝、 玉米赤霉烯酮（簡稱ZEN） 的靈敏度低、 黃曲霉毒素 B1 （簡稱AFB1）的均一性差、樣本檢測C 線線條擴(kuò)散等問題。通過對微球制備工藝、 微球表面修飾不同數(shù)量碳原子手臂， 確認(rèn)了ADZ 檢測卡中ZEN 膠乳所用的熒光微球， 即南京微測生物的200 原子手臂的時間分辨熒光微球，解決了ZEN 靈敏度低的問題；通過對樣品墊的選擇、樣品墊緩沖液配方的優(yōu)化，確認(rèn)了樣品墊工藝，即用上海捷寧生物的G-6 玻纖墊，并處理樣品墊緩沖液配方3， 解決了AFB1 均一性差問題；通過對抗原稀釋液優(yōu)化，確認(rèn)用50mM PBS+5%蔗糖劃膜液，解決了樣本C 線線條擴(kuò)散問題。