蔣婷婷 李和沛 王丹 李燕雛

(四川大學(xué)華西醫(yī)院 1.液體活檢和單細(xì)胞實(shí)驗室；2.頭頸腫瘤科；3.腫瘤放療科,四川 成都 610041)

目前，臨床常用的腫瘤標(biāo)志物和影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，而且不能準(zhǔn)確動態(tài)監(jiān)測病情發(fā)展，可能導(dǎo)致患者錯過最佳治療時機(jī)。液體活檢作為腫瘤早診、隨訪及預(yù)后判斷中的重要新型手段日漸成熟，當(dāng)腫瘤細(xì)胞從實(shí)體腫瘤的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶中脫落后進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)后即可形成單個的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)或循環(huán)腫瘤癌栓(Circulating tumor microembolis,CTMs)。其中，循環(huán)腫瘤癌栓更有利于細(xì)胞之間的生物信息傳遞，更容易在血流剪切壓力下存活，導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更高[1-2]?！癈TCs和CTMs”作為液體活檢最重要指標(biāo)之一，其動態(tài)監(jiān)測廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期篩查、診斷分期、療效評價、預(yù)后評估以及患者的個體化治療等方面，已在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多種實(shí)體腫瘤中得到證實(shí)[3-7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者外周血中的CTCs數(shù)目可提示鼻咽癌的病情進(jìn)展程度，動態(tài)監(jiān)測CTCs的變化可對化療的療效進(jìn)行及時有效的評估，CTCs不同亞型與化療敏感性和耐藥性相關(guān)[8-9]。另外，研究[10]也發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量與血漿EBV-DNA表達(dá)量呈正相關(guān)。但目前關(guān)于聯(lián)合檢測CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者中的臨床意義尚不清楚，本文探討CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌患者診療中的變化情況，為局部晚期鼻咽癌臨床預(yù)后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入四川大學(xué)華西醫(yī)院自2018年6月～2021年1月收治的38 例局部晚期鼻咽癌患者。其中男28 例，女10 例，中位年齡44.1歲，平均(48.56±0.51)歲。病理分期和TNM分期參照美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第8版，其中納入Ⅲ期患者11例，Ⅳ期患者27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為局部晚期鼻咽癌。②既往無腫瘤病史，且無放化療治療史。③無血管、嚴(yán)重心臟、腎臟等疾病。④血常規(guī)及血生化參數(shù)在正常參考值范圍內(nèi)。⑤ECOG評分0～1 分。本研究已獲四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)[倫理編號為：2015年審(141)號]，且所有受試者均自愿簽訂知情同意書。

1.2 方法 38例局部晚期鼻咽癌患者，首先接受了0～4周期誘導(dǎo)化療，具體方案為：吉西他濱+順鉑或多西紫杉醇+順鉑+氟尿嘧啶。隨后進(jìn)行適型調(diào)強(qiáng)放射治療(Intensity Modulated Radiotherapy，IMRT)，放療期間根據(jù)患者個體差異情況給予同步化療(Concurrent chemoradiotherapy，CRT)，同步周期為0～3周期，使用單藥順鉑或尼妥珠單抗進(jìn)行同步治療。

1.3 療效評價 治療效果評價標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)RECIST 1.1(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,version 1.1)。完全緩解(Complete Response，CR)：腫瘤病灶完全消失。部分緩解(Partial Response，PR)：腫瘤病灶直徑之和比基線水平減少30%以上。疾病進(jìn)展(Progressive Disease，PD)：腫瘤病灶直徑之和相對增加20%以上，直徑之和的絕對值增加5 mm以上，出現(xiàn)1 個或多個新病灶。疾病穩(wěn)定(Stable Disease，SD)：腫瘤病灶增加程度介于PR與PD兩者之間。疾病控制(Disease Control，DC)：治療有效指疾病完全緩解、部分緩解和疾病穩(wěn)定，即治療有效為：CR+PR+SD。治療無效為PD。CTCs療效評價標(biāo)準(zhǔn)：治療有效指治療后外周血中CTCs數(shù)量下降≥1/5治療前的CTCs數(shù)量，治療無效指治療后外周血中CTCs數(shù)量升高或不變>1/5治療前的CTCs數(shù)量[11]。

1.4 外周血CTCs/CTMs檢測方法 入組患者在治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后1周和調(diào)強(qiáng)放射治療結(jié)束1月及1年后四個時間點(diǎn)分別采集患者肘靜脈血6 mL用于CTCs及CTMs檢測，置于含有ACD的抗凝真空管中(Becton,Dickinson and Company，NJ，USA)，避光低溫保存，于24 h內(nèi)檢測，檢測操作過程均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。檢測試劑盒購于賽特生物醫(yī)藥科技有限公司，其試劑盒具體包括SE-CTC試劑盒(Cytointelligen，SanDiego，CA，USA)和iFISH 試劑盒(Cytointelligen，SanDiego，CA，USA)。SE-CTC試劑盒用于分離富集外周血中的CTCs和CTMs，iFISH 試劑盒用于鑒定判別分類CTCs和CTMs。上述實(shí)驗操作完成后在自動掃描平臺上進(jìn)行自動掃描。CTCs的判讀標(biāo)準(zhǔn)：PD-L1+/CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或者PD-L1-/ CD31-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2；CTMs 的判讀標(biāo)準(zhǔn)：單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥2個的CTCs 聚集成的細(xì)胞團(tuán)[8,12]。在CTCs和CTMs采血的各個時間點(diǎn)同時檢測血漿 EBV-DNA 水平。

1.5 隨訪 截止2021年8月1日，入組患者在治療結(jié)束后，門診或電話定期隨訪，治療結(jié)束后半年內(nèi)每個月隨訪一次，1～3 年內(nèi)每三個月隨訪一次，3～5 年內(nèi)每半年隨訪一次，5年后每年隨訪一次。隨訪終點(diǎn)為疾病出現(xiàn)進(jìn)展或死亡。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS 26.0版本對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料采用最小值、最大值、中位數(shù)及均數(shù)進(jìn)行描述，計數(shù)資料之間的相關(guān)分析采用卡方檢驗，等級資料采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，定量資料之間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數(shù)目與病理特征的關(guān)系 38例初治局部晚期鼻咽癌患者外周血中檢出CTCs和CTMs細(xì)胞，見圖1，CTCs和CTMs的計數(shù)基線與患者的臨床病理特征的關(guān)系，見表1。基線分析可見，CTCs和CTMs的陽性檢出率與鼻咽癌患者的性別、年齡、ECOG評分和TNM分期均無關(guān)(P>0.05)。病理分期為Ⅲ期和Ⅳ期患者的外周血中CTCs陽性檢出率Ⅳ期比Ⅲ期患者高18.2%。患者外周血中血漿EBV-DNA水平范圍為0.0～44700.0 copies/mL。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析CTCs和CTMs與EBV-DNA水平的相關(guān)性顯示，局部晚期鼻咽癌患者與血漿EBV-DNA 表達(dá)水平均無相關(guān)性(P>0.05)。值得關(guān)注的是，納入38例患者中，其中有5例患者EBV-DNA表達(dá)水平陰性，但這5例患者的外周血中均發(fā)現(xiàn)了CTCs，其中1 例患者外周血中還發(fā)現(xiàn)了CTMs，提示CTCs和CTMs可能在外周血中的檢測靈敏度更高。

圖1 CTCs和CTMs細(xì)胞Figure 1 CTCs and CTMs cells注：A.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體≥5體的CTC；B.由兩個EpCAM+的CTC組成的CTM

表1 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs和CTMs數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系[n(×10-2)]Table 1 The relationship between the number of baseline CTCs/CTMs and clinicopathological characteristic in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

2.2 局部晚期鼻咽癌患者CTCs和CTMs基線數(shù)目與放療靶區(qū)參數(shù)的相關(guān)性 納入患者在治療前CTCs基線數(shù)目檢出的范圍為0～21 個，治療前CTMs基線數(shù)目檢出的范圍為0～4 個。36例CTCs陽性患者中，腫瘤原發(fā)灶靶區(qū)(GTVnx)范圍為(52.07±30.14) cm3，淋巴結(jié)靶區(qū)(GTVnd)范圍為(30.95±19.94) cm3，大體腫瘤體積(GTV)范圍為(64.90±42.45) cm3；2例CTCs陽性患者中，GTVnx范圍為(47.31±26.74) cm3，GTVnd范圍為(13.82±8.16) cm3，GTV范圍為(63.37±27.17) cm3。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，入組患者治療前CTCs數(shù)目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性(P=0.478，P=0.647，P=0.077)。同樣，CTMs與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性(P=0.254，P=0.687，P=0.082)。

2.3 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs與治療效果的關(guān)系 對在納入患者中20例進(jìn)行了治療前、誘導(dǎo)化療結(jié)束后1周和調(diào)強(qiáng)放射治療結(jié)束1月及1年后進(jìn)行了四個采血時間點(diǎn)的動態(tài)監(jiān)測。分析20 例患者外周血中CTCs動態(tài)變化情況，按照CTCs評價標(biāo)準(zhǔn)判定，16 例有效，4 例無效。CTCs數(shù)目在四個時間點(diǎn)的數(shù)目分別為：(9.7±10.3)個、(5.40±6.4)個、(2.3±7.1)個和(1.5±3.4)個，經(jīng)過治療后CTCs總數(shù)較治療前明顯降低(P=0.0241)。進(jìn)一步分析，CTMs數(shù)目四個時間點(diǎn)的數(shù)目分別為：(2.5±2.1) 個、(2.4±1.5)個、(0±3.1)個和(0±0.9)個，經(jīng)過治療后CTMs較治療前降低(P=0.431)。②按照RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)，上述20 例患者中，17 例患者治療后DCR率為85.0%(17/20)，PD率為15.0%(3/20)。CR、PR或SD患者CTCs數(shù)目在治療前為(9.8±5.7)個，治療后下降為(2.4±6.2)個；CTMs數(shù)目在治療前為(2.9±1.2)個，治療后下降至(1.4±0.2)個。另外，3例PD患者CTCs數(shù)目在治療前為(14.2±3.9)個，治療后降為(3.7±4.2)個；CTMs數(shù)目在治療前為(2.9±1.2)個，治療后下降至(1.4±2.2)個。結(jié)果提示，局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數(shù)目的動態(tài)變化情況與治療后的療效密切相關(guān)，PD患者治療后的CTCs和CTMs數(shù)目更高，治療效果更差。③采用Fisher檢驗比較CTCs評價標(biāo)準(zhǔn)和RECIST 1.1評價標(biāo)準(zhǔn)，兩種療效評價方式差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=3.821，P=0.557)。局部晚期鼻咽癌患者CTCs數(shù)目與治療效果的關(guān)系，見表2。

表2 局部晚期鼻咽癌患者基線CTCs數(shù)目與治療效果的關(guān)系[n(×10-2)]Table 2 The relationship between baseline CTCs number and treatment effect in patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma

2.4 局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs各亞型在治療過程中的分布情況 分析動態(tài)監(jiān)測的20例患者在治療過程中CTCs各個亞型變化的情況(見圖2)。三倍體CTCs四個時間點(diǎn)的檢出百分比分別為：75.9%、59.3%、41.3%和5.7%；四倍體CTCs在四個時間點(diǎn)的檢出百分比分別為：68.1%、30.3%、20.1%和18.6%；≥五倍體CTCs在四個時間點(diǎn)的檢出百分比分別為：43.0%、37.0%、20.6%和20.5%。隨訪患者CTCs從治療前到治療后動態(tài)變化情況可見，三倍體、四倍體和≥五倍體CTCs分別下降了70.2%、49.5%和22.5%。經(jīng)治患者中，三倍體CTCs對化療或者放療更為敏感，而≥五倍體的CTCs可能和耐藥相關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步驗證。

圖2 患者外周血中CTCs亞型分布情況統(tǒng)計圖(n=20)Figure 2 Distribution of CTCs subtypes in patients 注：CTCs各亞型百分比計算方式為：各亞型個數(shù)/CTCs總數(shù)×100%

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，2例患者在治療前檢出表達(dá)PD-L1陽性CTCs，且均為病情進(jìn)展(PD)患者。對其分型發(fā)現(xiàn)，1例患者血液樣本中，有一個三倍體CTC細(xì)胞表達(dá)PD-L1陽性；1 例患者有一個≥五倍體CTCs細(xì)胞表達(dá)PD-L1陽性。上述結(jié)果提示，外周血中出現(xiàn)表達(dá)PD-L1陽性CTCs提示預(yù)后不良。

3 討論

鼻咽癌常見于中國南方和東南亞等地區(qū)，發(fā)病與環(huán)境、地理位置、遺傳因素、EB病毒等因素有關(guān)[13-14]。據(jù)統(tǒng)計，僅不足1/3鼻咽癌患者可在早期確診，約2/3患者確診已是局部晚期。局部復(fù)發(fā)、局部未控和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的主要原因。目前，常規(guī)鼻咽癌的診斷及隨訪主要依賴于病理組織、血清腫瘤標(biāo)志物和醫(yī)學(xué)影像等檢查。CTCs/CTMs作為一種新型、敏感監(jiān)測指標(biāo)有助腫瘤的早期診斷、實(shí)時動態(tài)檢測、判斷療效和預(yù)后評估。

外周血中CTCs和CTMs是實(shí)體瘤的“液體活檢”的重要組成，具有取材方便、多次反復(fù)取材和無創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)[15-17]。既往循環(huán)腫瘤細(xì)胞在鼻咽癌的研究主要集中于外周血中CTCs 的陽性率與TNM分期間的相關(guān)性，Zhang等[8]報道，CTCs陽性檢出率與TNM分期無顯著相關(guān)性；He等[18]在納入的33 例鼻咽癌研究中發(fā)現(xiàn)CTCs 計數(shù)與腫瘤負(fù)荷成正相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，在入組的38 例局部晚期的鼻咽癌患者中，Ⅲ期和Ⅳ期患者CTCs陽性檢出率分別高達(dá)81.8%以上，Ⅳ期患者比Ⅲ期患者CTCs陽性檢出率高18.2%，提示腫瘤分期越晚，CTCs計數(shù)越高，腫瘤的負(fù)荷也越大。另外，本文進(jìn)一步分析納入的38 例治療前局部晚期鼻咽癌患者CTCs陽性檢出率與放療靶區(qū)參數(shù)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)入組患者治療前CTCs和CTMs數(shù)目與GTVnx、GTVnd及GTV均無相關(guān)性。雖然以上述分析均為陰性結(jié)果，但CTCs陽性的局部晚期鼻咽癌患者治療前勾畫的GTV范圍均比CTCs陰性的患者勾畫的范圍更廣，提示臨床醫(yī)生可參考CTCs檢出情況來進(jìn)一步作出精準(zhǔn)的范圍選擇。

Si等[19]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者治療中CR或PR患者，外周血中的CTCs數(shù)目明顯降低。本研究不僅分析20 例局部晚期鼻咽癌患者在治療過程中外周血CTCs和CTMs數(shù)目的動態(tài)變化，更進(jìn)一步分析了CTCs的各個亞型變化情況?；颊呓?jīng)過治療后，發(fā)現(xiàn)局部晚期鼻咽癌患者外周血中CTCs和CTMs數(shù)目的動態(tài)變化情況與治療后的療效密切相關(guān)，與CR、PR或SD組患者相比較，3 例PD患者治療后的CTCs和CTMs檢出率更高，治療效果更差。上述結(jié)果提示，PD患者治療后CTCs患者更容易產(chǎn)生耐藥，治療結(jié)束后更應(yīng)該加強(qiáng)隨訪，防止腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)一步轉(zhuǎn)移。不同的亞型的CTCs具有不同的臨床意義，不同亞型在不同腫瘤中具有明顯異質(zhì)性[20-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，三倍體、四倍體及≥五倍體CTCs從治療前到治療后逐步下降，各亞型CTCs數(shù)目下降從高到低依次分別是三倍體CTCs、四倍體CTCs和≥五倍體CTCs。上述結(jié)果提示，≥五倍體的CTCs在治療過程中可能存在耐藥。進(jìn)一步可見，本研究中表達(dá)PD-L1 CTCs的兩例患者均出現(xiàn)病情進(jìn)展，提示CTCs中表達(dá)PD-L1可能是預(yù)后不良因素之一。有研究顯示，鼻咽癌病理組織中PD-L1陽性率高可95%，癌巢周圍有大量的浸潤性T淋巴細(xì)胞，因此，針對PD-L1靶點(diǎn)的PD-1抗體聯(lián)合化療治療鼻咽癌的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，卡瑞利珠單抗單藥用于PD-L1表達(dá)陽性的鼻咽癌患者具有較高的抗腫瘤活性且安全性可控。提示局部晚期鼻咽癌聯(lián)合應(yīng)用PD-1單抗類抗腫瘤藥物具有可期的療效。

4 結(jié)論

CTCs和CTMs在局部晚期鼻咽癌病程及治療過程中均有較高的檢出率，并表現(xiàn)出顯著差異，因此CTCs和CTMs可以用于局部晚期鼻咽癌動態(tài)監(jiān)測、評估療效及指導(dǎo)預(yù)后判斷，將可根據(jù)檢測結(jié)果制定精準(zhǔn)化的治療方案，及早采取對應(yīng)的臨床干預(yù)措施。