雷雪梅，桑維鈞*，李昊熙，盧燕回，王五權(quán)，孔 菲，安宣鮮，楊茂發(fā)

(1.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025；2.中國煙草總公司 廣西壯族自治區(qū)公司煙葉處,廣西 南寧 530023)

煙草棒孢霉葉斑病最早于1973年在尼日利亞發(fā)現(xiàn)[1]。我國棒孢霉屬病菌引起的煙草葉斑病于1998年在貴州發(fā)現(xiàn)，煙草棒孢霉葉斑病菌鑒定為多主棒孢霉Corynesporacassiicola[2-3]。2012年在廣西首次發(fā)現(xiàn)煙草棒孢霉葉斑病，其病原菌鑒定為多主棒孢霉[4]。2015年進(jìn)行了廣西煙草棒孢霉葉斑病菌室內(nèi)殺菌劑篩選[5]，之后有研究發(fā)現(xiàn)咪鮮胺、氟啶胺對廣西煙草棒孢霉葉斑病的抑菌效果較好，且該病菌對QoIs類殺菌劑有耐藥性，但抗性相關(guān)的位點(diǎn)未出現(xiàn)Cytb基因突變[6]。煙草棒孢霉葉斑病主要危害中下部葉片，高溫高濕的氣候會(huì)促進(jìn)該病害的發(fā)生與蔓延，其菌絲生長、分生孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢的最適溫度范圍在25～30 ℃之間[7-8]。發(fā)病葉片采烤后質(zhì)量下降，直接影響經(jīng)濟(jì)效益[9]。

多主棒孢霉寄主廣泛，可侵染530余種植物[9]，其中包括煙草[2]、橡膠[10]、香蕉[11]、草莓[12]、蓮藕[13]、茄子[14]、苦瓜[15]和黃瓜[16]等，該病原菌代謝產(chǎn)物中具有某種致病因子[17]。2000年Breton等[18]研究發(fā)現(xiàn)多主棒孢霉可以合成一種蛋白質(zhì)毒素“Cassiicolin”。經(jīng)過試驗(yàn)進(jìn)一步推測毒素蛋白與多主棒孢病菌的致病性有關(guān)[19-20]，Barthe等[21]對侵染橡膠的多主棒孢Cassiicolin毒素蛋白及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)該病菌具有7種毒素蛋白(Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6和Cas7)并開發(fā)出毒素類型的特異性引物檢測方法，將檢測不到任何Cassiicolin毒素的基因劃分為Cas0型[22-25]。該毒素蛋白與致病性相關(guān)，因此明確其毒素亞型對了解多主棒孢霉的生物學(xué)功能有重要意義，同時(shí)可為科學(xué)防治棒孢霉葉斑病奠定基礎(chǔ)。

多主棒孢霉的Cassiicolin毒素亞型，目前的研究多集中于橡膠樹的落葉病上，近年廣西苦瓜棒孢霉葉斑病上也有研究，而煙草上還未見報(bào)道。本文對廣西煙草棒孢霉葉斑病菌進(jìn)行鑒定并測定其毒素類型，對比橡膠等其他作物上多主棒孢毒素類型的異同，這對了解多主棒孢霉的遺傳進(jìn)化關(guān)系和對煙草棒孢霉葉斑病的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病葉樣本采集

2021年4—7月，分別在廣西壯族自治區(qū)賀州市(24°41′N,111°57′E)鐘山縣公安鎮(zhèn)、富川瑤族自治縣富陽鎮(zhèn)、朝東鎮(zhèn)、石家鄉(xiāng)、新華鄉(xiāng)，百色市(23°90′N,106°62′E)靖西市新靖鎮(zhèn)、化峒鎮(zhèn)、地州鎮(zhèn)、同德鄉(xiāng)、隆林各族自治縣德峨鎮(zhèn)、蛇場鄉(xiāng)，河池市(24°70′N,108°09′E)南丹縣六寨鎮(zhèn)、八圩瑤族鄉(xiāng)等煙區(qū)采集煙草棒孢霉葉斑病的病葉樣本。

1.1.2供試培養(yǎng)基

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，青島海博生物技術(shù)公司)。稱取46 gPDA培養(yǎng)基，加去離子水定容至1 L，經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min后備用。

1.1.3供試植物

廣西賀州煙區(qū)主栽煙草品種K326；其他寄主植物(橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄、香蕉)。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離與純化

在實(shí)驗(yàn)室對病原菌進(jìn)行常規(guī)組織分離、單孢純化[26]。選取病斑清晰的煙草葉片，利用滅菌后的手術(shù)剪在無菌操作臺(tái)中剪取病健交界處約0.5 cm×0.5 cm病葉組織，用75%乙醇浸泡3～5 s，然后用無菌水清洗3～5次，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)。待菌落長出后，在菌落前緣挑取少量菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，通過2～3次轉(zhuǎn)接后，將菌落后純化。將純化的病原菌轉(zhuǎn)接到PDA試管斜面，4 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)采用5 mm直徑打孔器打取菌餅，保存在1 mL的40%無菌甘油凍存管中，-20 ℃保存[27]。圖1為煙草棒孢霉葉斑病田間癥狀圖，與關(guān)國經(jīng)等[2]、張中義等[3]的癥狀描述一致。

圖1 煙草棒孢霉葉斑病田間癥狀圖Fig.1 The symptom of tobacco Corynespora leaf spot(a and b)

1.2.2病原菌診斷

將分離純化的菌株接file:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/SDNS202301/SDNS202301/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F/%E5%B1%B1%E5%9C%B0%E5%86%9C%E4%B8%9A%E7%94%9F%E7%89%A92023%E5%B9%B4%E7%AC%AC1%E6%9C%9F.ebook/images/3bb00483a95be371416a443576906f39.jpg種于PDA平板上(90 mm培養(yǎng)皿，15 mL培養(yǎng)基)，每個(gè)培養(yǎng)皿接種1個(gè)菌餅于PDA平板中央，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù)，黑暗條件、28 ℃恒溫下培養(yǎng)8 d，觀察菌落的形狀、顏色等[4,28]。

采用生工生物工程(上海)股份有限公司提供的DNA提取試劑盒提取病原菌DNA，再利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)[29]、翻譯延伸因子(EF-1α)[30]、β微管蛋白(TUB)[31]等多基因的引物序列對病原菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增成功的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。參照GenBank數(shù)據(jù)庫分析病原菌信息。

1.2.3病原菌毒素蛋白亞型鑒定

利用毒素亞型的特異性引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將擴(kuò)增成功的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析。

表1 本研究所用鑒定毒素亞型引物信息(Déon[32-33],2012年)Tab.1 Primer information for identifying toxin subtypes used in this study (Déon[32-33],2012)

1.2.4致病性分析

根據(jù)毒素類型鑒定，選取本研究中不同毒素類型的代表菌株進(jìn)行致病性分析。2022年3月將健康的K326煙草、橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄、香蕉移栽至廣西壯族自治區(qū)賀州市富川瑤族自治縣福利鎮(zhèn)試驗(yàn)基地。每種移栽植物30株，待植物葉片長至6～8片時(shí)進(jìn)行室外活體接種。在經(jīng)過黑暗條件、28 ℃恒溫下培養(yǎng)了7 d的PDA平板，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。將菌餅倒置在健康的葉片上，對照作物接同樣大小的新鮮PDA培養(yǎng)基，覆保鮮膜保濕。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。接種7 d后觀察發(fā)病情況。待葉片發(fā)病后觀察發(fā)病癥狀，并重新分離病原菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)其特征與本研究的菌株一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與純化

從廣西壯族自治區(qū)煙草種植區(qū)分離純化得到15株病原菌，保存于貴州大學(xué)煙草學(xué)院煙草病害研究室，菌株相關(guān)信息如表2所示。

表2 本研究病原菌信息Tab.2 Pathogen information of this study

2.2 病原菌診斷與回接驗(yàn)證

在PDA培養(yǎng)基上的菌落正面為青灰色，菌絲緊密呈絨毛狀(圖2-a)，菌落邊緣呈灰白色；背面以黑青、褐青色為主(圖2-b)。對15株病原菌進(jìn)行孢子形態(tài)觀察，孢子呈棒狀，一端略細(xì)，直徑為(29.44～63.26)μm×(5.53～10.14)μm(圖2-c、2-d)。且經(jīng)回接煙草證明具有致病性，初步鑒定15株病原菌為多主棒孢霉。

注：a.菌落正面；b.菌落背面；c.孢子；d.分生孢子梗。圖2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定Fig.2 Morphological identification of pathogenic bacteria

利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物對病原菌目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè)菌株與GenBenk里的多主棒孢霉具有99 %以上的同源性。將15個(gè)菌株的序列上傳GenBank，登錄號如表3所示。將15個(gè)病原菌與GenBank中的棒孢屬菌株和以鏈格孢菌CAU8331為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。本研究病原菌與C.cassiicola聚于一個(gè)分支上，因此，確定本研究15個(gè)病原菌為C.cassiicola。

表3 本研究病原菌GenBank登錄號Tab.3 The landing number of the pathogen GenBank in this study

圖3 基于rDNA-ITS、TUB、EF-1α序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS,TUB and EF-1α sequences

將該病原菌接種到煙草葉片上，4 d后葉片接種部位變黑，周圍褪綠變黃明顯(圖4-a)，產(chǎn)生的病斑形態(tài)與田間癥狀也十分相似。從接種發(fā)病的葉片中再次分離得到菌株，發(fā)現(xiàn)與原接種菌株相同，說明該菌株為致病菌。空白對照無發(fā)病跡象(圖4-b)。

注：a.菌餅無傷接種4 d癥狀；b.空白對照PDA接種4 d癥狀。圖4 病原菌回接癥狀圖Fig.4 Symptom of pathogen reconnection

2.3 病原菌毒素蛋白亞型鑒定

利用毒素亞型的特異性引物與CasF15和CasR28進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在用6種特異性引物時(shí)，本研究菌株均無條帶；用CasF15和CasR28時(shí)只有一個(gè)菌株(CBJT)有條帶，條帶大小500 bp左右，其他菌株均無條帶(圖5)，初步認(rèn)定為多主棒孢霉菌不產(chǎn)生毒素的亞型Cas0。將擴(kuò)增出的樣品送到生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)與Cas7亞型是100%同源性。因此，本研究15個(gè)多主棒孢霉菌株中，14個(gè)菌株毒素蛋白亞型為Cas0，1個(gè)菌株毒素蛋白亞型為Cas7,且已將Cas7序列上傳至GenBank，登錄號為ON803445。

注：M為Marker;8為Cas7基因PCR產(chǎn)物。圖5 電泳凝膠成像圖Fig.5 Electrophoretic gel image

將本試驗(yàn)中含Cas7毒素的菌株CBJT與GenBank中22個(gè)已鑒定的來自不同國家、不同作物、不同毒素亞型的多主棒孢霉菌株，利用毒素基因序列構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從圖6可看出相同毒素亞型的多主棒孢霉菌分別聚在一支，其中來自黃瓜、橡膠、馬纓丹寄主的Cas2亞型多主棒孢霉菌聚在一支；來自橡膠寄主的Cas1、Cas3、Cas4、Cas5的多主棒孢霉菌分別各聚一支；來自大豆寄主的Cas6亞型多主棒孢霉菌聚在一支；本試驗(yàn)含Cas7毒素的菌株CBJT與來自黃瓜寄主的Cas7亞型多主棒孢霉菌聚在一支。

圖6 部分煙草多主棒孢霉菌株Cassiicolin基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the Cassiicolin precursor genes from C.cassiicola isolates of tobacco

2.4 病原菌致病性分析

通過對病原菌毒素蛋白亞型的鑒定，選取了Cas0亞型的兩個(gè)代表菌株CZFX-2、CHNL-2和Cas7亞型的菌株CBJT進(jìn)行致病性分析試驗(yàn)。由表4可知，Cas0、Cas7亞型均可侵染煙草K326、橡膠、黃瓜、苦瓜、番茄，不能侵染香蕉。結(jié)果表明雖然毒素亞型不同，但對本研究中的煙草K326、橡膠(海墾6號、海墾1號)、黃瓜、苦瓜、番茄等作物均有致病性，對香蕉(金粉1號、桂蕉6號)無致病性。

表4 病原菌致病性分析Tab.4 Pathogenicity analysis of pathogenic bacteria

注：a、b、c、d、e、f、g、h分別為菌株CHNL-2無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀；i、j、k、l、m、n、o、p分別為菌株CZFX-2無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀；q、r、s、t、u、v、w、x分別為菌株CBJT無傷接種煙草、番茄、黃瓜、苦瓜、香蕉(金粉1號)、香蕉(桂蕉6號)、橡膠(海墾6號)、橡膠(海墾1號)7 d癥狀。圖7 病原菌致病性測定Fig.7 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria

3 結(jié)論與討論

本研究利用ITS、EF-1α、TUB等多基因的引物對病原菌進(jìn)行系統(tǒng)分析，確定了廣西煙草棒孢霉葉斑病病原菌是多主棒孢霉。該病具體分布區(qū)域包括賀州市鐘山縣(公安鎮(zhèn))、富川瑤族自治縣(新華鄉(xiāng))，百色市靖西市(新靖鎮(zhèn)、化峒鎮(zhèn)、同德鄉(xiāng))、河池市南丹縣(六寨鎮(zhèn))，與譚海文等[4]的研究相比病害發(fā)生區(qū)域增多。

目前國內(nèi)多主棒孢霉菌僅存在Cas2和Cas5這2種Cassiicolin毒素亞型，和未檢測到毒素的Cas0亞型。從我國橡膠分離的多主棒孢霉的毒素類型主要是Cas2、Cas5與未檢測到毒素的Cas0亞型[34]；從黃瓜、苦瓜等葫蘆科寄主上分離的多主棒孢霉毒素亞型主要是Cas2和未檢測到毒素的Cas0亞型[35]。上述不同毒素亞型的多主棒孢霉菌能否侵染煙草未見報(bào)道。本研究首次測定了廣西15個(gè)多主棒孢霉菌株的Cassiicolin毒素亞型，其中14個(gè)菌株是Cas0亞型，1個(gè)菌株是Cas7亞型。此前我國有關(guān)多主棒孢霉菌Cassiicolin毒素亞型的研究未見在煙草上報(bào)道，且我國此前也沒有Cas7毒素亞型的報(bào)道。本研究測定結(jié)果表明，目前廣西煙草棒孢霉病菌中無毒素亞型(Cas0)為優(yōu)勢群體，這種亞型分布在百色市靖西市(化峒鎮(zhèn)、新靖鎮(zhèn))，賀州市富川瑤族自治縣(新華鄉(xiāng))、鐘山縣(公安鎮(zhèn))，與河池市南丹縣(六寨鎮(zhèn))。Cas7亞型菌株出現(xiàn)在百色市靖西市(同德鄉(xiāng))。推測煙草上多主棒孢霉的毒素亞型不存在地區(qū)差異。此外，本研究從廣西煙草上分離到的Cas0、Cas7毒素亞型菌株可以侵染煙草，也可以侵染橡膠(海墾6號、海墾1號)、黃瓜、苦瓜、番茄。但是對香蕉(金粉1號、桂蕉6號)不致病。因此推測除毒素外還存在其他致病因子。

本研究結(jié)合有關(guān)參考序列，進(jìn)行了病原菌的遺傳關(guān)系分析。結(jié)果表明煙草棒孢霉葉斑病菌存在遺傳分化，相同毒素類型的菌株分別聚在一支，與Déon等[22]、劉先寶等[36]研究結(jié)果一致。本研究鑒定了廣西煙草棒孢霉葉斑病病原菌并首次測定報(bào)道煙草棒孢霉病菌的毒素亞型，為該病害的科學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)。