張昕淳，李榮玉，湛興瑜，孫明明，姚小龍，李 明，廖 遜

(1.貴州大學(xué) 作物保護研究所，貴州 貴陽 550025；2.貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

吡唑醚菌酯別名唑菌胺脂，屬于具吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙稀酸脂類殺菌劑[1]，具有保護作用、治療作用、內(nèi)吸傳導(dǎo)性和耐雨水沖刷性能；持效期較長，應(yīng)用范圍較廣[2]；通過阻止細(xì)胞色素間的電子傳遞而抑制線粒體呼吸作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其由德國巴斯夫公司于1993年開發(fā)，被廣泛用于防治谷物、蔬菜、水果、藥用植物等由子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌等真菌病原體引起的各種病害[3]，如玉米大斑病[4]、小麥白粉病[5]、番茄頸腐病[6]、大白菜黑斑病[7]、黃瓜蔓枯病[8]、蘋果炭疽病[9]、楊梅褐斑病[10]、草莓白粉病[11]等。

吡唑醚菌酯在我國主要登記作物有水稻、大豆、番茄、楊梅等40余種[12]，其殘留情況受到密切關(guān)注。目前，針對探究吡唑醚菌酯在作物中的最大殘留限量、殘留半衰期、消解動態(tài)、在作物上的最終殘留限量等的研究較多，但在蔬菜中的研究較少。為評估吡唑醚菌酯在不同類型作物中的殘留，國內(nèi)外學(xué)者建立了其在不同作物上的殘留檢測方法及消解動態(tài)試驗[13-20]。如采用高效液相色譜法測定出吡唑醚菌酯在湖南、河北兩地白菜中的半衰期分別為2.97 d和3.34 d，且一次施藥7 d后符合安全要求[21]；噴施吡唑醚菌酯4 d后檢測出在花生殼與花生仁中的殘留量低于檢出限 0.05 mg/kg[22]；吡唑醚菌酯在黃瓜中消解較快，長期膳食攝入風(fēng)險較低[23]；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測出吡唑醚菌酯在人參植株中的半衰期為0.2～8.4 d，且符合慢性膳食風(fēng)險可接受水平[24]；采用超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測出吡唑醚菌酯在枇杷中的半衰期為9.5～12.8 d，且發(fā)現(xiàn)在施藥2～3次間隔7 d及推薦安全間隔期為14 d的條件下，其殘留符合安全要求[25]。

綜上所述，吡唑醚菌酯被廣泛地應(yīng)用于防控多種病害，但其消解動態(tài)研究多集中在谷物、水果和中藥材等作物上，在蔬菜上的消解動態(tài)和最終殘留試驗研究較少。我國2021年新頒布的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了吡唑醚菌酯在蔬菜中的最大殘留限量(GB2763—2021)，其值為0.02～5.00 mg/kg[26]。因此，為明確吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的殘留消解動態(tài)，保障蔬菜生產(chǎn)安全，本文采用高效液相色譜法QuECHES提取與高效液相色譜儀檢測方法，研究吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留消解動態(tài)，為其在7種蔬菜中安全合理地使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司)；25%吡唑醚菌酯懸浮劑(安徽輝隆集團銀山藥業(yè)有限責(zé)任公司)；乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉等；N-丙基乙二胺(PSA)。

高效液相色譜儀(DAD檢測器，安捷倫1260)；CK2000渦旋振蕩儀(Thmorgan)；AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；4000 rpm/min離心機(Thermo Fisher)；12 000 rpm/min離心機(Sigma)。

1.2 田間試驗設(shè)計

試驗參照《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[27]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[28]設(shè)計消解動態(tài)和最終殘留試驗。露地栽種蔬菜，每種蔬菜設(shè)4個處理，3次重復(fù)，1個對照。每個小區(qū)面積為30 m2，小區(qū)定苗150株左右，小區(qū)間設(shè)保護帶，常規(guī)管理。待蔬菜長至出苗時，采用背負(fù)式噴霧器(3WBD-18B)噴霧施藥。

1.2.1消解動態(tài)試驗方法

在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地(露地)進行殘留消解動態(tài)試驗。每種蔬菜試驗小區(qū)面積30 m2，重復(fù)3次；分別在每種蔬菜葉片發(fā)育期施藥，施藥劑量45 mL/667 m2(制劑用量)，采用背負(fù)式噴霧器兌水噴霧，兌水量按每畝50 L，施藥1次，于施藥后2 h，1、2、3、5、7、10、14、21、28 d分別采集各種蔬菜樣品。另設(shè)對照區(qū)，施用等量清水，并采集對照樣品。所有樣本在采集后2 h內(nèi)運回實驗室，并立即制成實驗室樣品于-20℃冷凍保存。

1.2.2最終殘留試驗方法

在貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗基地(露地)進行最終殘留試驗。試驗小區(qū)面積30 m2，重復(fù)3次；分別以30 mL/667 m2(制劑用量)和45 mL/667 m2(制劑用量)兌水稀釋使用，兌水量按每畝50 L。分別于每種蔬菜葉片發(fā)育期，進行莖葉噴霧。分別施藥2、3次，每次施藥間隔期為7天。在最后一次施藥后的7、14、21和28 d采集每種蔬菜莖葉樣品。試驗重復(fù)3次。另設(shè)清水對照區(qū)，施用等量清水，同時采集對照樣品。所有樣本在采集后2 h內(nèi)運回實驗室，并立即制成實驗室樣品-20 ℃冷凍保存。

1.3 測定方法

1.3.1樣品提取及凈化

提取：分別稱取不同時期不同蔬菜的樣品于高速組織搗碎機中搗碎，分別稱取10 g研磨后樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取3 min，加入硫酸鎂分散于樣品中至不結(jié)塊，樣品成糊狀。將離心管以4000 r/min離心5 min，使有機溶劑與樣品分離。

凈化：取上清液1.5 mL于2 mL離心管中(2 mL離心管要預(yù)先加入150 mg無水硫酸鎂和50 mg PSA吸附劑)，渦旋振蕩儀振蕩3 min，再以12 000 r/min離心3 min。

檢測樣品的制備：用一次性注射器吸取凈化后的上清液1 mL，過0.22 μm濾膜，注入2 mL樣品瓶內(nèi)，進液相色譜測定。

1.3.2液相色譜儀檢測條件

色譜柱：ZORBAX 300SB-C18 250 mm×4.6 mm(5.0 μm)；柱溫30 ℃；流動相：甲醇-水(80∶20)；流速1.0 mL/min；檢測波長：278 nm；進樣量20 μL；相對保留時間2.00 min。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取0.01 g吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解定容至50 mL，配制成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃下避光保存。根據(jù)需要，用50%的甲醇逐漸稀釋成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2條件檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品的進樣質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4計算1.3.4.1樣品中吡唑醚菌酯含量的計算方法

式中Xs為樣品中吡唑醚菌酯的殘留量，單位mg/kg。

Cs為把樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得到的濃度，單位mg/L。

VAC為提取時加入乙腈的體積，單位mL。

m為提取時所稱量樣品的質(zhì)量，單位g。

以采樣時間為橫坐標(biāo)，殘留量為縱坐標(biāo)，繪制散點圖，用下面的一級動力學(xué)方程擬合出參數(shù)k和x，利用參數(shù)k計算半衰期。

一級動力學(xué)方程：y=xe-kt

半衰期：T1/2=ln2/k

式中：y為時間t時農(nóng)藥的殘留量(mg/kg)，x為農(nóng)藥的初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)，k為降解速率常數(shù)，t為降解時間(d)。

1.4 添加回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析

分別在空白基質(zhì)中添加0.05、0.2、1.0 mg/kg 3個水平的吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)3次，按1.3.1和1.3.2測定回收率，并計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法的靈敏度和線性范圍

精準(zhǔn)稱取吡唑醚菌酯的標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g(精確至0.0001g)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液待用。根據(jù)需要，用50%的甲醇溶液稀釋成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于4 ℃保存。以標(biāo)準(zhǔn)品的進樣質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。吡唑醚菌酯在蔬菜樣品中的最低定量限(LOQ)為0.27 mg/kg，以3倍信噪比(S/N)計算得吡唑醚菌酯在蔬菜樣品中的檢出限(LOD)為0.15 mg/kg。吡唑醚菌酯的回歸方程為：y=77.19x+3.87，R2=0.99997，在0.625～100 mg/L范圍內(nèi)溶液濃度與峰面積的靈敏度及線性關(guān)系良好(圖1)。

圖1 吡唑醚菌酯液相色譜圖(a)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(b)Fig.1 Chromatogram(a) and standard curve(b) of pyraclostrobin

2.2 分析方法的準(zhǔn)確度和精密度

在0.05～1.00 mg/kg的添加水平下，吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、蘿卜菜、黃心烏白菜、奶油小白菜7種蔬菜中的平均添加回收率均在89.7%～103.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值在添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差皆符合農(nóng)藥殘留試驗要求(表1)。

表1 吡唑醚菌酯的添加回收率表Tab.1 Fortified recovery of pyraclostrobin

2.3 25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的消解動態(tài)

25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的消解動力學(xué)方程見表2和圖2。結(jié)果表明，25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的原始沉積量分別為9.25、6.40、12.82、5.59、7.99、12.45、11、52 mg/kg；用一級動力學(xué)方程擬合吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、蘿卜菜、黃心烏白菜、奶油小白菜中的消解動態(tài)方程如表2所示。吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的半衰期為1.36～6.93 d，屬于易降解農(nóng)藥。表明吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的消解速率有一定差異，其中在白菜中的消解率最快，而在奶油生菜中的消解率最慢。

表2 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)Tab.2 Dissipation of pyraclostrobin in seven vegetables

圖2 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)曲線Fig.2 Degradation curve of pyraclostrobin in seven vegetables

2.4 25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的最終殘留

25%吡唑醚菌酯懸浮劑在7種蔬菜中的最終殘留如表3所示，采集末次施藥后7、14、21、28 d的7種蔬菜作為最終殘留試驗檢測樣品，測定7種蔬菜中農(nóng)藥殘留量。結(jié)果顯示，施藥量為30或45 mL/667 m2，施藥2～3次，施藥后14～28 d，所有蔬菜樣品中吡唑醚菌酯均符合安全要求(低于5 mg/kg)。

表3 吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的最終殘留Tab.3 Terminal residues of pyraclostrobin in seven vegetables

30 mL/667 m2(制劑用量)噴施莖葉，施藥2～3次，距離末次施藥后7 d，黃心烏白菜、奶油小白菜、香菜、白菜和奶油生菜樣品中吡唑醚菌酯殘留量為1.14～4.84 mg/kg，均低于我國規(guī)定吡唑醚菌酯在蔬菜中的最高殘留量(MRL)5 mg/kg，而韭菜和蘿卜菜樣品中吡唑醚菌酯殘留量為4.12～6.20 mg/kg，高于安全要求。距離末次施藥后14～28 d，7種蔬菜中吡唑醚菌酯殘留量為0.00～3.89 mg/kg，均低于規(guī)定的MRL值，符合安全要求；尤其28 d后奶油小白菜中未檢出吡唑醚菌酯。

45 mL/667 m2(制劑用量)噴施莖葉，施藥2～3次，距離末次施藥后7 d，黃心烏白菜和奶油小白菜中吡唑醚菌酯殘留量為1.13～2.44 mg/kg，未超安全限量；而白菜、韭菜、奶油生菜、香菜和蘿卜菜中吡唑醚菌酯殘留量為1.98～10.78 mg/kg，部分超過殘留限量。距離末次施藥14～28 d后，7種蔬菜中吡唑醚菌酯殘留量為0.00～4.95 mg/kg，均低于吡唑醚菌酯在蔬菜上的最大殘留限量，且28 d后奶油小白菜中仍未檢出吡唑醚菌酯。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了高效液相色譜法測定吡唑醚菌酯殘留的分析方法，明確了其在7種蔬菜中的消解動態(tài)及最終殘留量。該方法靈敏度好，準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)要求。消解動態(tài)試驗結(jié)果表明，吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留消解動態(tài)均符合一級動力學(xué)方程。田間施藥后，吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的降解半衰期有一定差異，其在奶油生菜中的降解半衰期為6.93 d，而在白菜中的降解半衰期為1.36 d。降解速率快，屬易降解農(nóng)藥。

本研究中測定的吡唑醚菌酯在白菜中的降解半衰期為1.36 d，這與張少軍等[21]測定吡唑醚菌酯在大白菜(河北試驗點，半衰期為2.97 d；湖北試驗點，半衰期為3.34 d)中的消解動態(tài)試驗結(jié)果，以及余維維等[23]測定吡唑醚菌酯在黃瓜(廣西試驗點，半衰期為2.08 d)中的消解動態(tài)試驗結(jié)果具有一定差異，可能是由作物自身、土壤、地理條件、氣候以及人為因素等所導(dǎo)致的差異。最終殘留試驗結(jié)果表明，距末次施藥14～28 d，殘留量均小于我國規(guī)定的吡唑醚菌酯MRL值(0.5 mg/kg)，表明吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的殘留風(fēng)險較低。

本文通過研究吡唑醚菌酯在7種蔬菜中的消解動態(tài)及最終殘留量，為評估吡唑醚菌酯在蔬菜中的膳食風(fēng)險提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)[29]。同時，吡唑醚菌酯在除白菜外的許多常見蔬菜中的MRL值并未有明確的制定，本研究也為7種蔬菜中吡唑醚菌酯MRL值的制定提供參考依據(jù)。