朱 杰，周 攀，舒 圣，吳中權(quán) (武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院胸外科，湖北 武漢 430050)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是臨床上最為常見的一種肺癌類型，占所有肺癌的80%以上[1]。手術(shù)切除仍是當(dāng)今治療NSCLC的主要有效手段，可明顯控制癌癥進(jìn)展，延長患者生存期，但存在術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的情況，復(fù)發(fā)率可達(dá)30%以上，嚴(yán)重影響患者長期預(yù)后[2]。相關(guān)研究指出，早期NSCLC患者術(shù)后5年生存率為40%～50%，而其中約有30%的患者因術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)而死亡[3]。因此，積極探尋影響NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素對(duì)指導(dǎo)臨床制定針對(duì)性預(yù)防對(duì)策、減少術(shù)后復(fù)發(fā)、提高患者生存率具有重要意義。己糖激酶2(hexokinase 2，HK2)屬于有氧糖酵解過程中的一個(gè)限速酶和關(guān)鍵酶，可為癌細(xì)胞生長提供能量，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)[4]。相關(guān)研究顯示，HK2在NSCLC組織中高表達(dá)，這可能是患者預(yù)后不良的影響因素[5]。丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2，PKM2)亦在糖酵解過程中起著重要作用，其高表達(dá)可促進(jìn)糖酵解，幫助癌細(xì)胞獲得大量能量，加速腫瘤生長與腫瘤血管生成[6]。有研究指出，對(duì)放療敏感及對(duì)放療不敏感的NSCLC患者的腫瘤組織PKM2蛋白高表達(dá)率分別為21.62%、58.06%，且PKM2表達(dá)量與NSCLC患者對(duì)放療的敏感性呈負(fù)相關(guān)[7]。上述報(bào)道表明，HK2、PKM2蛋白均與NSCLC患者臨床治療效果存在一定的相關(guān)性，但其是否可用于評(píng)估NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)尚需進(jìn)一步探索。鑒于此，本研究就NSCLC組織中HK2、PKM2蛋白表達(dá)與NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系展開分析，以期為臨床工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016年1月至2019年10月在本院行手術(shù)切除治療的165例NSCLC患者的臨床資料，其中男116例，女49例；年齡44～78歲，平均(54.92±10.36)歲；鱗癌68例，腺癌89例，大細(xì)胞癌8例；高分化43例，中分化92例，低分化30例；最大腫瘤直徑0.91～8.63 cm，平均(4.82±0.95)cm；Ⅰ期35例，Ⅱ期97例，Ⅲ期33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例；術(shù)后化療≤4個(gè)周期112例，術(shù)后化療>4個(gè)周期53例；吸煙史63例。本研究已通過武漢科技大學(xué)附屬漢陽醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(202112-003)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合原發(fā)性NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，且經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為NSCLC；初治，行手術(shù)切除聯(lián)合淋巴結(jié)清掃術(shù)；術(shù)中留取NSCLC組織與癌旁組織；臨床資料及隨訪記錄完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；術(shù)前已接受過放化療；術(shù)前有靶向藥物治療史；患有心、肝、腎嚴(yán)重疾??；患有血液系統(tǒng)疾病；患有腦血管疾病；伴其他部位癌癥；術(shù)后3個(gè)月內(nèi)死亡。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 HK2鼠抗人單克隆抗體(武漢博士德生物公司)、PKM2鼠抗人多克隆抗體(美國Abnova公司)、小鼠二抗(北京博奧森公司)、0.1 mol/LPBS(上海邦景實(shí)業(yè)公司)、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液(北京中杉金橋公司)、DAB顯色劑(北京中杉金橋公司)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HK2、PKM2蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 將術(shù)中留取的NSCLC組織與癌旁組織(距離病灶2 cm)標(biāo)本用10%甲醛固定，然后沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋；將石蠟組織塊連續(xù)切片(厚3～4 μm)，附于載玻片上，于60 ℃恒溫烘烤2 h。將石蠟切片室溫放置20 min,然后于60 ℃恒溫箱中烤3 h,將石蠟切片取出，以二甲苯常規(guī)脫蠟、以不同濃度乙醇水化，用自來水、0.1 mol/L PBS沖洗，于室溫下放入1%甲醇雙氧水中浸泡10 min，用蒸餾水漂洗1次，用0.1 mol/L PBS沖洗3次，再滴加抗原修復(fù)液，于室溫下修復(fù)10 min，以0.1 mol/L PBS沖洗3次，在切片上加入山羊血清封閉液，分別滴加一抗(HK2、PKM2蛋白抗體，比例為1∶50)，陰性對(duì)照則以PBS代替一抗，在4 ℃冰箱中過夜，0.1 mol/L PBS沖洗3次，加入生物素化二抗，在37 ℃下孵育20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次；之后加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素液，37 ℃ 20 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次；加DAB顯色6 min，用蘇木素復(fù)染1 min，最后充分水洗、脫水、透明、封片。在顯微鏡下讀片并判斷結(jié)果，在高倍鏡(×400)下每張切片隨機(jī)選5個(gè)視野，各視野均計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。

1.2.3 術(shù)后復(fù)發(fā)判斷與分組 術(shù)后隨訪24個(gè)月(隨訪截止時(shí)間為2021年11月)，患者定期至醫(yī)院復(fù)診(每個(gè)月復(fù)查1次)，行血清腫瘤標(biāo)志物檢查、影像學(xué)檢查(腹部彩超、胸部CT、頭顱CT或MRI、全身骨掃描)等。根據(jù)上述檢查結(jié)果及查體(淋巴結(jié)腫大)，若懷疑患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，則進(jìn)行針刺細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果陽性且提示與原發(fā)NSCLC相關(guān)，則記為復(fù)發(fā)，結(jié)果陰性則進(jìn)一步強(qiáng)化CT并完善相關(guān)檢查，提示轉(zhuǎn)移灶記為腫瘤復(fù)發(fā)[9]；對(duì)于影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)檢查陰性者，繼續(xù)隨訪；復(fù)發(fā)包括局部復(fù)發(fā)(手術(shù)切除區(qū)域、肺門、縱隔淋巴結(jié))與轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)(胸腔外腫瘤病變)。將出現(xiàn)復(fù)發(fā)患者歸為復(fù)發(fā)組，反之歸為未復(fù)發(fā)組。

1.2.4 患者臨床資料收集與整理 收集并整理患者臨床資料，包括性別、年齡、吸煙史、組織類型、腫瘤分化程度、最大腫瘤直徑、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后化療周期、癌組織HK2以及PKM2蛋白表達(dá)情況。

1.3 觀察指標(biāo)

比較NSCLC組織與癌旁組織HK2、PKM2蛋白表達(dá)情況，其中HK2以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕色或棕黃色顆粒記為陽性，PKM2以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒記為陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)，將陽性細(xì)胞占比<10%、10%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計(jì)0、1、2、3、4分；根據(jù)染色強(qiáng)度，將無著色、黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分；若陽性細(xì)胞占比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分的乘積為0分，則記作陰性，若≥1分，則記作該蛋白陽性表達(dá)[10]。比較患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況及NSCLC組織HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)患者與陰性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況，并分析NSCLC組織HK2、PKM2蛋白表達(dá)與NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，若任一理論頻數(shù)<5且≥1則采取連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線分析蛋白表達(dá)陽性與陰性患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況，蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系分析采用Cox回歸模型分析法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織與癌旁組織HK2、PKM2蛋白表達(dá)比較

NSCLC組織中HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁組織(P<0.05)，見表1、圖1～2。

表1 各組織HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)比較[n=165，例(%)]

a：肺鱗癌組織HK2蛋白陽性表達(dá)；b：肺腺癌組織HK2蛋白陽性表達(dá)；c：癌旁組織HK2蛋白陰性表達(dá)圖1 NSCLC組織與癌旁組織HK2蛋白的表達(dá)(×400)

a：肺鱗癌組織PKM2蛋白陽性表達(dá)；b：肺腺癌組織PKM2蛋白陽性表達(dá)；c：癌旁組織PKM2蛋白陰性表達(dá)圖2 NSCLC組織與癌旁組織PKM2蛋白的表達(dá)(×400)

2.2 術(shù)后復(fù)發(fā)情況及NSCLC組織HK2、PKM2蛋白不同表達(dá)患者復(fù)發(fā)情況比較

術(shù)后隨訪24個(gè)月，復(fù)發(fā)68例，復(fù)發(fā)率為41.21%；NSCLC組織HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高于陰性表達(dá)患者(χ2=11.438、11.462，P<0.05)，見圖3～4。

圖3 NSCLC組織HK2蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況

圖4 NSCLC組織PKM2蛋白陽性表達(dá)與陰性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況

2.3 NSCLC組織HK2、PKM2蛋白表達(dá)與NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

經(jīng)單因素及多因素Cox回歸模型分析顯示，中/低分化、臨床分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后化療周期≤4個(gè)周期、NSCLC組織中HK2及PKM2蛋白陽性表達(dá)均是NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表2～3。

表2 NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的單因素分析[例(%)]

表3 NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的多因素Cox回歸分析

3 討論

NSCLC主要包括鱗癌、腺癌與大細(xì)胞癌，其病因復(fù)雜，多認(rèn)為與吸煙、職業(yè)、大氣污染、遺傳等因素有關(guān)[11]。現(xiàn)階段，手術(shù)切除是挽救此類患者生命的重要療法，但術(shù)后復(fù)發(fā)是臨床常見且不可避免的問題，可明顯增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)[12]。本研究中，NSCLC患者術(shù)后24個(gè)月的復(fù)發(fā)率為41.21%，稍低于李彥明等[13]報(bào)道的45.83%，但均提示NSCLC術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，分析NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素對(duì)指導(dǎo)臨床制定術(shù)后綜合治療策略具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)率均較癌旁組織顯著增高，提示HK2、PKM2蛋白在NSCLC組織中高表達(dá)。有氧糖酵解在腫瘤的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可為維持腫瘤細(xì)胞增殖創(chuàng)造適宜的微環(huán)境并滿足其能量需求[14]。HK2同線粒體的結(jié)合在有氧糖酵解途徑起關(guān)鍵作用，HK2在正常機(jī)體組織中低表達(dá)，而當(dāng)其過表達(dá)則可促進(jìn)糖酵解，為細(xì)胞增殖補(bǔ)充能量，從而刺激腫瘤發(fā)生[15]。有研究指出，肝癌組織中HK2的表達(dá)量相較于癌旁組織顯著升高[16]；HK2可通過影響PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移[17]；另有研究報(bào)道，HK2介導(dǎo)的糖酵解可增加間變性淋巴瘤激酶陽性的NSCLC患者對(duì)克唑替尼的耐受性，而抑制HK2可增加患者對(duì)該藥物的敏感性，表明HK2蛋白與NSCLC的進(jìn)展及治療具有相關(guān)性[18]。以上研究結(jié)果表明，HK2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，且會(huì)影響NSCLC患者化療效果，有可能成為抑制NSCLC細(xì)胞增殖與腫瘤演進(jìn)的干預(yù)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)HK2表達(dá)可能對(duì)治療NSCLC具有積極作用。PKM2亦參與了糖酵解過程，可增加癌細(xì)胞核酸生成，并能將烯醇式丙酮酸變成丙酮酸，同時(shí)可將二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)轉(zhuǎn)成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，在糖酵解與糖代謝中作用重大[19]。有研究指出，PKM2可通過調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R)的表達(dá)水平及IGF-1R前體的穩(wěn)定性而促進(jìn)細(xì)胞生長與存活，尤其在缺氧條件下，其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用更為明顯[20]；Biyik-Sit等[21]的研究顯示，PKM2參與了表皮生長因子受體突變型NSCLC細(xì)胞中磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶1介導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移；張軼等[22]的研究指出，PKM2蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，本研究結(jié)果與之相似。上述研究表明PKM2參與了腫瘤進(jìn)展，且可影響NSCLC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，有望成為臨床治療與預(yù)后評(píng)估的觀察指標(biāo)。

本研究結(jié)果還顯示，NSCLC組織HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高于陰性表達(dá)患者，且Cox回歸模型分析顯示，NSCLC組織中HK2、PKM2蛋白陽性表達(dá)均是NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示NSCLC組織HK2、PKM2蛋白表達(dá)與NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切。HK2、PKM2蛋白表達(dá)增加可增強(qiáng)細(xì)胞糖酵解，促使腫瘤微環(huán)境酸化，在腫瘤惡性進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中作用明顯。HK2通過與線粒體外膜上的電壓依賴陰離子通道相結(jié)合，有效利用ATP，并向線粒體提供ADP而促進(jìn)三羧酸循環(huán)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用。有研究顯示，抑制HK2可起到誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性的作用[23]；另有相關(guān)研究報(bào)道，吉西他濱在胰腺癌化療中產(chǎn)生耐藥性可能與HK2二聚體增加有關(guān)[24]。以上研究均表明，HK2表達(dá)增加可能與癌癥患者治療效果不佳及不良預(yù)后相關(guān)。另有研究指出，高表達(dá)HK2的腎透明細(xì)胞癌患者的總生存率較低表達(dá)患者顯著降低，進(jìn)一步表明了HK2蛋白與癌癥患者不良預(yù)后存在一定的關(guān)系[25]。有研究表明，PKM2可通過調(diào)節(jié)cyclinD1、c-myc、Bax、Bak等的表達(dá)而影響腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡，進(jìn)而可能會(huì)影響腫瘤組織對(duì)放化療的敏感性[26]。研究指出，在缺氧情況下，順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞中PKM2表達(dá)增加，且PKM2高表達(dá)能夠降低NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，可作為NSCLC順鉑耐藥的治療靶點(diǎn)[27]。Tryfonidis等[28]的研究表明，NSCLC患者PKM2水平越低，其總生存期越長。上述研究均提示PKM2高表達(dá)可能會(huì)削弱NSCLC患者對(duì)放化療的敏感性，影響治療效果，導(dǎo)致預(yù)后不佳。周志強(qiáng)等[29]的研究顯示，術(shù)前血清PKM2水平與子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)，且對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，進(jìn)一步證實(shí)了PKM2表達(dá)與癌癥患者術(shù)后復(fù)發(fā)存在一定的聯(lián)系。此外，本研究顯示，中/低分化、臨床分期Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后化療周期≤4個(gè)周期均是NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與焦江琴[30]、趙方超等[31]研究結(jié)果相一致。分化程度越低、臨床分期越晚，則腫瘤惡性程度越高，治療的難度越大，根治率越低，可能會(huì)殘留腫瘤細(xì)胞，而殘留的腫瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移則會(huì)導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)；當(dāng)存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，即使進(jìn)行了淋巴結(jié)清掃，仍可能存在微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞不能被完全識(shí)別的情況，殘存的微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞則為癌癥患者術(shù)后復(fù)發(fā)提供了條件；術(shù)后輔助化療對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移具有較好效果，若術(shù)后化療周期較短，則對(duì)殘留癌細(xì)胞的抑制作用不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上，NSCLC患者癌組織中HK2、PKM2蛋白均呈陽性表達(dá)，且與患者術(shù)后短期復(fù)發(fā)有一定的相關(guān)性，其陽性表達(dá)可能會(huì)增加NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，HK2、PKM2蛋白表達(dá)水平對(duì)患者術(shù)后復(fù)發(fā)的評(píng)估及預(yù)防具有一定的指導(dǎo)意義。