廖林輝，陳華平，范國斌，段鈺澤 (.海南省萬寧市人民醫(yī)院泌尿外科，海南 萬寧 57500；.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?5799)

膀胱癌是起源于膀胱上皮黏膜組織的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，男性發(fā)病率高，且發(fā)病率在逐年升高，雖然目前腫瘤的治療技術(shù)在不斷進(jìn)步，但是膀胱癌容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差，并且膀胱癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但其具體機(jī)制尚不清楚，因此，需要進(jìn)一步探究其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)膀胱癌診斷和治療的新靶點(diǎn)[1-3]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 bp的非編碼RNA，不具備編碼功能，但是可通過多種途徑調(diào)控腫瘤等疾病的病理進(jìn)程，包括腫瘤的血管新生、生長和轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、腫瘤干性等[4-6]。目前，已有多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，如lncRNA CASC1和lncRNA GClnc1具有調(diào)控膀胱癌生長和轉(zhuǎn)移的能力，并有研究指出lncRNA具有診斷和治療膀胱癌的潛力，因此需要挖掘更多對膀胱癌具有調(diào)控功能的lncRNA[7-8]。lncRNA NNT-AS1是一類在多種腫瘤中高表達(dá)的lncRNA，有研究指出其對肺癌、膠質(zhì)瘤等在多種腫瘤進(jìn)程均有調(diào)控作用[9-10]。而lncRNA NNT-AS1對膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的影響目前尚不清楚，本研究探究lncRNA NNT-AS1對膀胱癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、腫瘤干細(xì)胞干性的影響，旨在為膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1和人膀胱癌細(xì)胞UM-UC-3、5637、TCC-SUP、T24購自美國ATCC細(xì)胞庫；PrimeScriptTM試劑盒購自日本TAKARA公司(批號：AI21034A)、PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix(批號：A25741)購自購自美國ThermoFisher公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(批號：11668030)購自美國Invitrogen公司；CCK8試劑盒(批號：WLA074)購自沈陽萬類生物科技有限公司；CD44(批號：37259)、CD133(批號：64326)、NCKAP1(批號：34325)、YAP(批號：14074)、TAZ(批號：83669)、ALDH1A1(批號：36671)、Oct4(批號：2750)、Nanog(批號：8822)、GAPDH(批號：5174)抗體和山羊抗兔IgG(批號：4417)購自美國Cell Signaling Technology公司。4～6周齡的雌性Balb/c裸鼠12只購自卡文斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證：SCXK(瓊)2019-0016]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞SV-HUC-1、UM-UC-3、5637、TCC-SUP、T24培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 膀胱癌干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定

T24細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12培養(yǎng)液中，添加20 ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、20 ng/mL表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、5 μg/mL胰島素和2%無血清添加劑B27，培養(yǎng)至形成大體積懸浮球體時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 qRT-PCR

使用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)PrimeScriptTM試劑盒和PowerUpTMSYBRTM Green Master Mix分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和qRT-PCR反應(yīng)，記錄CT值，使用2-△△CT法計(jì)算lncRNA NNT-AS1和miR-582-5p的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

將T24細(xì)胞和膀胱癌干細(xì)胞分為sh-NC組(轉(zhuǎn)染sh-NC)、sh-NNT-AS1組(轉(zhuǎn)染sh-NNT-AS1)、Control組(共轉(zhuǎn)染sh-NC、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(共轉(zhuǎn)染sh-NNT-AS1、inh-NC和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(共轉(zhuǎn)染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和si-NC)、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組(共轉(zhuǎn)染sh-NNT-AS1、miR-582-5p抑制物和NCKAP1小干擾RNA)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，按照上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，將各組細(xì)胞培養(yǎng)液更換為新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液。

1.6 CCK8檢測各組細(xì)胞增殖能力

將各組細(xì)胞稀釋至2×104/mL，96孔板每孔接種100 μL，細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中，分別在0 h、24 h、48 h和72 h取出對應(yīng)的孔板，每孔加入10 μL CCK8溶液，孵育4 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔光密度(optical density,OD)值。

1.7 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

將各組細(xì)胞用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至1×105/mL，取100 μL接種至Transwell小室中，小室下層浸沒于含600 μL 10% FBS的RPMI-1640的24孔板中，24孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后將小室底部用無水甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色，清洗后觀察細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)。

1.8 膀胱癌干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)

將膀胱癌干細(xì)胞用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋至5×103/mL，在吸附性低的24孔板中每孔接種600 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，每周更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并記錄各組細(xì)胞成球能力。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD133和CD44表達(dá)

膀胱癌干細(xì)胞重懸成單細(xì)胞懸液，每管中加入1×105個(gè)細(xì)胞，加入5 μL FITC-CD44和PE-CD133抗體并設(shè)置單染對照管，避光孵育30 min，檢測各組細(xì)胞CD133和CD44表達(dá)。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的結(jié)合位點(diǎn)，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將lncRNA NNT-AS1過表達(dá)質(zhì)粒(lncRNA NNT-AS1 WT)、突變質(zhì)粒(lncRNA NNT-AS1 MUT)及空白質(zhì)粒(Vector)轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，然后分別將miR-NC和miR-582-5p mimic轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-582-5p與NCKAP1的結(jié)合位點(diǎn)，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒將NCKAP1質(zhì)粒(NCKAP1 WT)、突變質(zhì)粒(NCKAP1 MUT)及空白質(zhì)粒(Vector)轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，然后分別將miR-NC和miR-582-5p mimic轉(zhuǎn)染至上述細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光強(qiáng)度。

1.11 Western blot

RIPA蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞的總蛋白，取10 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白(80 V電泳2 h)，轉(zhuǎn)膜(300 mA轉(zhuǎn)膜1 h)，封閉2 h，PVDF膜與NCKAP1、YAP、TAZ、CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog和GAPDH一抗(均按1∶1 000的比例稀釋)于4 ℃孵育過夜，TBST清洗，按1∶2 000的比例稀釋二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL試劑盒顯影，拍照，并對曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.12 小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

4～6周齡的雌性Balb/c裸鼠12只，隨機(jī)分為 4組，每組3只，飼養(yǎng)于溫度25 ℃、濕度50%、12 h明暗交替的SPF級動物房中，隔天更換墊料及飲用水。取Control組、sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組、sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組T24細(xì)胞用生理鹽水稀釋至1×108/mL，然后于各組小鼠右側(cè)腋下接種100 μL細(xì)胞懸液。接種后，每2 d使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長(a)和寬(b)，計(jì)算小鼠腫瘤體積(V)，腫瘤體積計(jì)算公式為：V=0.5×a×b2。接種20 d后，頸椎脫臼處死小鼠，解剖取瘤組織。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 lncRNA NNT-AS1在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與人正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1比較，人膀胱癌細(xì)胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP中l(wèi)ncRNA NNT-AS1顯著增加(P<0.001)，見圖1a。說明lncRNA NNT-AS1高表達(dá)于膀胱癌細(xì)胞。為了探究lncRNA NNT-AS1對膀胱癌的影響，在lncRNA NNT-AS1表達(dá)最高的T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染lncRNA NNT-AS1 shRNA(sh-NNT-AS1組)和si-lncRNA NNT-AS1 negative control(sh-NC組)，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1b。

a：qRT-PCR檢測各細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達(dá)；b：qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達(dá) *：與SV-HUC-1比較，P<0.05；#：與sh-NC組比較，P<0.05圖1 qRT-PCR檢測lncRNA NNT-AS1表達(dá)

2.2 lncRNA NNT-AS1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細(xì)胞的OD值在24 h、48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，見圖2a。說明抑制lncRNA NNT-AS1可顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組T24細(xì)胞的遷移數(shù)和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2b。說明抑制lncRNA NNT-AS1表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

a：CCK8檢測各細(xì)胞增殖能力；b：Transwell小室法檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力(×20) #：與sh-NC組比較，P<0.05圖2 lncRNA NNT-AS1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

2.3 抑制lncRNA NNT-AS1對膀胱癌干細(xì)胞干性的影響

干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，與sh-NC組比較，sh-NNT-AS1組膀胱癌干細(xì)胞成球數(shù)顯著減少(圖3a)。Western blot檢測結(jié)果顯示，sh-NNT-AS1組膀胱癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P<0.05)，見圖3b。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，sh-NNT-AS1組CD44+CD133+的細(xì)胞比例顯著低于sh-NC組(P<0.05)，見圖3c。說明抑制lncRNA NNT-AS1可抑制膀胱癌干細(xì)胞干性。

a：細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測膀胱癌干細(xì)胞干性(×10)；b：Western blot檢測各組細(xì)胞CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達(dá)；c：流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD44+CD133+的細(xì)胞比例 #：與sh-NC組比較，P<0.05圖3 lncRNA NNT-AS1調(diào)控膀胱癌干細(xì)胞干性

2.4 lncRNA NNT-AS1對miR-582-5p/NCKAP1分子軸的影響

通過數(shù)據(jù)庫StarBase預(yù)測到lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖4a)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，在lncRNA NNT-AS1 WT細(xì)胞中，與miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimic細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)；而在Vector和lncRNA NNT-AS1 MUT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-582-5p mimic后細(xì)胞熒光強(qiáng)度無顯著變化(P>0.05)，見圖4b。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，抑制T24細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1表達(dá)后，細(xì)胞中miR-582-5p表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖4c。說明lncRNA NNT-AS1可靶向調(diào)控miR-582-5p的表達(dá)。

通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-582-5p與NCKAP1結(jié)合位點(diǎn)(圖4d)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，在NCKAP1 WT細(xì)胞中，與miR-NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimic細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)；而在Vector和NCKAP1 MUT細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-582-5p mimic后細(xì)胞熒光強(qiáng)度無顯著變化(P>0.05)，見圖4e。轉(zhuǎn)染miR-582-5p mimic后T24細(xì)胞中NCKAP1表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，轉(zhuǎn)染miR-582-5p inhibitor后T24細(xì)胞中NCKAP1表達(dá)顯著上調(diào)P<0.05)，見圖4f。說明miR-582-5p可靶向調(diào)控NCKAP1的表達(dá)。

a：lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測；b：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA NNT-AS1與miR-582-5p的靶向關(guān)系；c：qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-582-5p的表達(dá)；d：miR-582-5p與NCKAP1結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測；e：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-582-5p與NCKAP1的靶向關(guān)系；f：Western blot檢測各組細(xì)胞中NCKAP1表達(dá) *：與sh-NC組比較，P<0.05；#：與miR-NC組比較，P<0.05圖4 lncRNA NNT-AS1調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸

2.5 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

細(xì)胞增殖、遷移和侵襲檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組細(xì)胞OD值顯著下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)；與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組細(xì)胞OD值上調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著增加(P<0.05)；與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組細(xì)胞OD值顯著下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖5。說明lncRNA NNT-AS1通過調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移。

a：CCK8檢測各組細(xì)胞增殖能力；b：Transwell小室法檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲能力(×20) *:與Control組比較，P<0.05；#:與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△:與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖5 lncRNA NNT-AS1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的能力

2.6 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對膀胱癌干細(xì)胞干性的影響

干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組膀胱干細(xì)胞成球數(shù)，膀胱癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達(dá)及CD44+CD133+的細(xì)胞比例均顯著低于Control組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組膀胱干細(xì)胞成球數(shù)，CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達(dá)及CD44+CD133+的細(xì)胞比例均顯著高于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組膀胱干細(xì)胞成球數(shù)，CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog表達(dá)及CD44+CD133+的細(xì)胞比例均顯著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖6。說明lncRNA NNT-AS1通過調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌干細(xì)胞干性。

a：細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)檢測膀胱癌干細(xì)胞干性；b：Western blot檢測各組細(xì)胞CD44、ALDH1A1、Oct4、Nanog蛋白表達(dá)；c：流式細(xì)胞術(shù)鑒定CD44+CD133+的細(xì)胞比例 *:與Control組比較,P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖6 lncRNA NNT-AS1調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而促進(jìn)膀胱癌干細(xì)胞干性

2.7 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對小鼠體內(nèi)成瘤的影響

小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組小鼠腫瘤體積顯著減小(P<0.05)，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組小鼠腫瘤體積顯著大于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)，sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組小鼠腫瘤體積顯著小于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖7。說明lncRNA NNT-AS1調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而影響膀胱癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖7 小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果

2.8 lncRNA NNT-AS1/miR-582-5p/NCKAP1分子軸對Hippo-YAP/TAZ信號通路的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組T24細(xì)胞NCKAP1、YAP、TAZ表達(dá)顯著降低(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組細(xì)胞NCKAP1、YAP、TAZ表達(dá)顯著高于sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組(P<0.05)；sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1組細(xì)胞NCKAP1、YAP、TAZ表達(dá)顯著低于sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組(P<0.05)，見圖8。說明lncRNA NNT-AS1調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1分子軸而激活Hippo-YAP/TAZ信號通路。

*：與Control組比較，P<0.05；#：與sh-NNT-AS1+inh-NC+si-NC組比較，P<0.05；△：與sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NC組比較，P<0.05圖8 lncRNA NNT-AS1激活Hippo-YAP/TAZ信號通路

3 討論

膀胱癌是一類多發(fā)于男性的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，尤其早期的病理特征不明顯，并且缺乏有效的腫瘤診斷標(biāo)志物，使得其常在確診時(shí)就已經(jīng)處于中晚期，因此需要探究更多用于膀胱癌診斷和治療的新靶點(diǎn)以及標(biāo)志物[11-12]。近年來，許多非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)或者抑制多種腫瘤的病理進(jìn)程，其中l(wèi)ncRNA是一類對腫瘤具有廣泛的調(diào)節(jié)作用、且有望成為腫瘤診斷和治療新靶點(diǎn)的非編碼RNA[13]。lncRNA不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，但是可在表觀遺傳的層面調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，包括腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、腫瘤耐藥、放療抗性等[14-15]。在膀胱癌的研究中，也有多種lncRNA被發(fā)現(xiàn)具有重要的調(diào)控功能，如Wang等[16]和Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，lncRNA GClnc1和lncRNA CCAT1均在膀胱癌中高表達(dá)，并且可促進(jìn)膀胱癌的生長和轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)更多具有調(diào)控功能的lncRNA有助于膀胱癌診斷和治療靶點(diǎn)的篩選。

lncRNA NNT-AS1在多種腫瘤中差異表達(dá)，lncRNA NNT-AS1高表達(dá)于肺癌、膠質(zhì)瘤[9-10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1在膀胱癌細(xì)胞T24、5637、UM-UC-3、TCC-SUP中高表達(dá)，提示lncRNA NNT-AS1也可能具有調(diào)控膀胱癌發(fā)生發(fā)展的能力。所以本研究選擇lncRNA NNT-AS1表達(dá)水平最高的T24細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染shRNA抑制T24細(xì)胞中l(wèi)ncRNA NNT-AS1的表達(dá)后，T24細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力以及膀胱癌干細(xì)胞的干性亦顯著降低，說明lncRNA NNT-AS1能夠調(diào)控膀胱癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。He等[18]和Huang等[19]等也發(fā)現(xiàn)lncRNA NNT-AS1可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌和膽管癌的增殖、遷移和侵襲。

在調(diào)控機(jī)制上，lncRNA NNT-AS1可結(jié)合于其靶向的miRNA抑制靶基因的表達(dá)，而miRNA又可結(jié)合于其靶基因的3’UTR區(qū)，進(jìn)而抑制靶基因的翻譯，即lncRNA能夠調(diào)控miRNA/mRNA信號軸[20]。有研究表明，lncRNA NNT-AS1可調(diào)控miR-142-5p/SOX4分子軸從而調(diào)控胃癌的發(fā)展[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1軸，并且lncRNA NNT-AS1可通過抑制miR-582-5p而上調(diào)NCKAP1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控T24細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及干細(xì)胞干性。同樣，此類調(diào)控機(jī)制也在肝癌中被發(fā)現(xiàn)，如Lu等[22]發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調(diào)控miR-363/CDK6軸進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的生長。

NCKAP1可通過多種途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Zhu等[23]研究發(fā)現(xiàn)NCKAP1可調(diào)控Hippo-YAP/TAZ信號通路而影響非小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。Hippo信號通路具有高保守性，YAP和TAZ是重要的同源轉(zhuǎn)錄共刺激因子，二者可在Hippo信號通路下游發(fā)揮關(guān)鍵的作用，Hippo信號通路激活后，通過激酶的級聯(lián)反應(yīng)磷酸化YAP和TAZ，進(jìn)而抑制YAP和TAZ轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，而Hippo信號通路的抑制可促進(jìn)非磷酸化的YAP和TAZ轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與細(xì)胞核內(nèi)TEAD等下游靶基因結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[24]。本研究預(yù)測并驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，lncRNA NNT-AS1可調(diào)控miR-582-5p/NCKAP1軸進(jìn)而激活Hippo-YAP/TAZ信號通路。有研究表明，Linc00673可調(diào)控miR-515-5p/MARK4/Hippo信號通路而影響乳腺癌的增殖[25]。因此，本研究推測lncRNA NNT-AS1可通過激活Hippo-YAP/TAZ信號通路而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及腫瘤干細(xì)胞干性。但是lncRNA NNT-AS1是否能成為膀胱癌診斷和治療的新靶點(diǎn)，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。