肖非凡 盧宇藍 吳冰冰 董欣然 程國強 胡黎園 周文浩, 彭小敏 楊琳 王慧君

（國家兒童醫(yī)學中心/復旦大學附屬兒科醫(yī)院 1.分子醫(yī)學中心；2.新生兒科，上海 201102）

兒童是遺傳性疾病的高發(fā)人群［1-2］，遺傳因素是導致危重癥新生兒早期死亡的重要原因［3］。但是，遺傳性疾病在生命早期的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，臨床診斷困難。因此，早期明確是否存在遺傳性病因，對危重癥新生兒的治療及預后至關重要［4］。目前，快速基因檢測技術已在危重癥新生兒疾病診斷方面具有良好的應用［5］。全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）可檢測整個基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列，是檢測范圍最廣的技術，可為遺傳性疾病的診斷提供更為全面的線索［6-7］。本文旨在通過臨床的應用研究，探索WGS在臨床快速診斷危重癥新生兒中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究，經(jīng)復旦大學附屬兒科醫(yī)院倫理委員會審核批準（批準號：2019-066），并獲得患兒監(jiān)護人知情同意。以2019年8—9月間在復旦大學附屬兒科醫(yī)院進行WGS檢測的危重癥患兒為研究對象，分析患兒臨床特征、基因檢測結果、結局轉歸。納入標準：（1）在新生兒重癥監(jiān)護病房（neonatal intensive care unit，NICU）中懷疑為遺傳因素致病的危重癥新生兒（日齡≤28 d），出現(xiàn)肌力或肌張力異常、先天結構畸形、反復感染、血或尿串聯(lián)質譜遺傳代謝指標異常等；（2）進行了一家三口（患兒和其父母）的WGS檢測。排除標準：（1）患兒已經(jīng)獲得產(chǎn)前基因診斷；（2）無法取得患兒監(jiān)護人知情同意。

1.2 WGS的檢測方法

抽取患兒及其父母外周靜脈血各2 mL，采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）抽提基因組DNA。通過Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序?；純簶颖緶y序深度為40×~50×，測序數(shù)據(jù)量為120 Gb；患兒父母樣本的測序深度為8×~10×，測序數(shù)據(jù)量為30 Gb。應用Illumina公司的Dynamic Read Analysis for GENomics Bio-IT（DRAGEN）平臺對測序數(shù)據(jù)進行超快速分析。依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會評級標準對檢測到的變異進行評級［8］。上述流程中，DNA提取和建庫用時約12 h，基因組測序約42 h，測序數(shù)據(jù)處理及變異檢測約19 h，測序數(shù)據(jù)解讀約1 h。

1.3 臨床資料收集

收集患兒性別、入院年齡、孕產(chǎn)次、出生體重、孕周、出生方式、入院主訴、主要癥狀等資料。通過門診或電話隨訪患兒預后情況。

1.4 WGS的數(shù)據(jù)分析流程

針對危重癥家系的WGS，采用快速反應流程，優(yōu)化了從血樣和臨床信息采集到向臨床醫(yī)生報告候選致病變異的數(shù)據(jù)分析流程［9］。

全部流程包括：測序實驗；原始數(shù)據(jù)快速生成；序列生成、變異格式轉化和篩選；臨床信息處理；候選變異解讀。其中，測序實驗包括血液樣本編號和家系關系登記、DNA質控、測序上機、FastQ產(chǎn)出與質控。測序數(shù)據(jù)分析過程包括使用DRAGEN進行數(shù)據(jù)生成、快速變異檢測、再次質控，校驗性染色體，變異注釋篩選，校驗家系關系以輔助遺傳模式分析。臨床信息處理包括病史標準術語化處理和基于臨床表型的候選基因分析。病史標準術語化處理包括基本的自然語言處理和現(xiàn)有的國際疾病分類（第10版）轉化等，以將原始病歷轉化為人類表型術語（Human Phenotype Ontology）。臨床表型分析以基于表型的候選基因優(yōu)選為目標，主要采用PhenoPro算法，根據(jù)綜合的標準化人類表型術語對可能的致病基因進行排序。最后，遺傳診斷團隊基于篩選的變異和患兒的表型，對變異的致病性進行綜合評估。

2 結果

2.1 一般情況及臨床特征

共納入15例患兒，入院年齡為2 h至28 d，中位年齡為5 d，其中男9例 （60%），女6例（40%）；早產(chǎn)兒8例（53%），足月兒7例（47%）；剖宮產(chǎn)9例（60%），順產(chǎn)6例（40%）。主要入院原因為呼吸異常7例（47%），反應差、喂養(yǎng)困難各2例（13%），發(fā)熱、低體溫、早產(chǎn)、抽搐各1例（7%）。詳細臨床特征見表1。

表1 15例患兒的基本臨床特征、基因檢測結果及臨床轉歸

2.2 WGS檢測結果分析

WGS平均檢測周期為4.5 d，最短為72 h。3例患兒（患兒7、9、11）經(jīng)WGS檢測后獲得基因診斷，診斷陽性率為20%（3/15）。

患兒7因早產(chǎn)生后氣促呻吟入院，臨床表型為肥厚型梗阻性心肌病、室間隔缺損、肺動脈高壓，WGS檢測到PTPN11基因存在錯義變異c.1528C>G(p.Q510E)。PTPN11基因是常染色體顯性遺傳的Noonan綜合征的致病基因。截至2022年12月，ClinVar數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）已有20余篇文獻與該變異有關，并將其評為致病變異。本例患兒父母均未攜帶該變異，分析為新發(fā)變異，其心臟表現(xiàn)是典型的Noonan綜合征心臟表型，結合臨床與變異位點分析，該患兒診斷為Noonan綜合征?；純喝朐汉蠓磸统霈F(xiàn)經(jīng)皮血氧飽和度波動，后因呼吸困難明顯、血氧飽和度持續(xù)降低予以氣管插管，氣管插管加壓下可維持血氧飽和度?；純杭覍倩诨純翰∏榧凹彝ソ?jīng)濟情況，選擇放棄治療，拔管后患兒死亡。分析文獻顯示，該位點的多個病例均在數(shù)月內因嚴重心臟問題夭折［10-11］。

患兒9因生后2 d喂養(yǎng)困難入院，臨床表現(xiàn)為皮-羅綜合征，WGS檢測到COL11A1基因存在剪接變異c.2295+1G>A，該變異位點未見報道，經(jīng)Sanger驗證，確認遺傳自父親（父親自述表型正常，但未來院進行相關檢查）。COL11A1基因變異可導致常染色體顯性遺傳病Stickler綜合征II型。本例患兒下頜短小、舌根后墜、腭裂、隱匿性陰莖，符合該綜合征表型。根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會評級依據(jù)［8］，該變異評為可疑致病變異（PVS1+PM2_S），該患兒診斷為Stickler綜合征。本例患兒因舌根后墜及下頜短小導致呼吸困難，血氧飽和度不能維持。外科會診后建議手術，家屬拒絕并出院。最終患兒死亡。結合患兒病史及基因檢測結果，推測該基因變異導致的畸形引起呼吸功能障礙是患兒的直接死亡原因。

患兒11因陣發(fā)性發(fā)紺半天入院，主要表型為中樞性呼吸衰竭，WGS檢測到PHOX2B基因存在新發(fā)插入變異c.756_776dup(p.Ala254_Ala260dup)。PHOX2B基因是先天性中樞性低通氣綜合征的致病基因，呈常染色體顯性遺傳。ClinVar數(shù)據(jù)庫記錄有7篇文獻報道該變異，評級為致病變異。既往文獻［12］報道該病患兒需有創(chuàng)機械通氣支持。本例患兒臨床表現(xiàn)為中樞性呼吸衰竭，住院期間需呼吸機輔助呼吸，基因檢測結果回報前，患兒家屬已要求放棄治療，后患兒死亡。

此外，在患兒8的CHD7基因編碼區(qū)38號外顯子上發(fā)現(xiàn)一個臨床意義未明變異：c.8639C>T(p.Q510E)，變異位點遺傳自母親。

2.3 臨床結局及轉歸

3例基因診斷陽性的患兒（患兒7、9、11）均死亡。攜帶臨床意義未明變異的患兒8，因胎糞性腹膜炎行剖腹探查術，術中見全腸全壞死，患兒父母決定放棄治療后患兒死亡。11例基因檢測結果為陰性的患兒中，5例病情好轉；3例患兒需呼吸機輔助通氣，家屬考慮患兒預后不良，放棄治療；3例患兒隨訪結局死亡。

3 討論

我們前期的數(shù)據(jù)顯示，約20%（44/223）的NICU死亡患兒存在遺傳致病因素［13］。早期基因診斷可協(xié)助臨床醫(yī)生改善危重癥新生兒的管理策略。一些傳統(tǒng)的遺傳檢測方法，如核型分析和基因芯片技術，難以檢測單基因位點的變異。目前，國內已有多項研究［14-16］證實基因包測序和/或全外顯子組測序技術具有很好的臨床應用價值。但是，這些測序技術并不能全面覆蓋整個基因組的變異情況。近年來，一些團隊已經(jīng)嘗試將WGS用于危重癥患兒的快速遺傳性病因檢測。一項納入11篇文獻的薈萃分析［5］結果表明，快速WGS技術在危重癥嬰兒中的綜合診斷率為37%，說明快速WGS在危重癥患兒的遺傳性病因檢測中具有良好的應用價值。

本研究檢測15例患兒，其中3例獲得基因診斷，診斷陽性率為20%，與國外的WGS診斷陽性率接近［17］。結合國內臨床實際應用情況，本研究采用高性價比的測序方案，即對患兒樣本使用測序深度為40×~50×，父母樣本使用8×~10×的低覆蓋測序，在確保有效檢測效果的同時降低測序成本。常規(guī)高通量測序，因需要進行目標區(qū)域捕獲建庫，需要耗時3周以上，本研究中WGS檢測，因不需要進行目標序列捕獲，節(jié)省建庫時間，平均檢測周期僅為4.5 d，極大地縮短了檢測時間。WGS檢測數(shù)據(jù)量龐大，數(shù)據(jù)處理和變異解讀是目前一個難點問題。本研究基于實驗室已經(jīng)開發(fā)的高通量測序數(shù)據(jù)一體化全流程分析系統(tǒng)［9］，根據(jù)不同變異類型的特點，按照單核苷酸變異和小插入/缺失，拷貝數(shù)變異、結構變異、非編碼區(qū)域的變異注釋、線粒體和雜合性缺失分別進行注釋和篩選，將結果統(tǒng)一匯總至基因層面進行分析，便于數(shù)據(jù)解讀人員結合受檢患兒的臨床表型，提升解讀效率。當然，對于在WGS數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的臨床意義未明變異，仍需結合人工判讀、病例表型隨訪進行致病性分析。

遺傳性疾病的臨床表型在新生兒期沒有特異性，臨床診斷困難，易錯過最佳治療時間。既往研究［6］顯示，僅有10%的病例可根據(jù)典型的臨床表型預測出最有可能導致疾病的基因。與既往報道［6］類似，本研究納入的15例患兒入院主訴均不典型，主要表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)異常、反應差及喂養(yǎng)困難等常見的新生兒疾病臨床癥狀。在明確診斷后，我們對基因診斷陽性患兒的表型與基因診斷陰性的患兒表型進行比較，無法獲得較為特異性的表型，難以根據(jù)表型進行陽性診斷的預測。因此，采用快速WGS檢測有利于盡早查明NICU患兒的病因，明確診斷，確定治療方案并進行相應的遺傳咨詢。

目前NICU日均住院費用在2 000元以上，長時間的維持治療給患兒家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔，家屬急迫需要知道具體的病因。有些遺傳性疾病需要在生命早期盡快干預，而一些遺傳性疾病在現(xiàn)有的醫(yī)療條件下缺乏有效治療手段，只能進行姑息治療?？焖俚幕驒z測的結果可以為病因診斷提供重要依據(jù)，輔助臨床醫(yī)生做出最佳的醫(yī)療決策，還有可能減輕患兒及其家庭的痛苦，避免無效努力。這其中需要遵循遺傳咨詢的相關倫理問題。在基因檢測前，臨床醫(yī)生應詳細地向患兒家屬解釋基因檢測在病因診斷中的意義。獲得基因檢測結果后，臨床醫(yī)生應客觀地告知患兒家屬關于該疾病的知識，強調遺傳性疾病在個體間存在的差異，科學引導患兒家屬做出合理選擇。

本研究尚有兩點局限性值得探討。首先，WGS數(shù)據(jù)量龐大，對生物信息學分析和臨床解讀要求非常高，需要配備相應的信息處理系統(tǒng)和生物信息分析團隊，短期內難以在各醫(yī)院推廣應用；其次，WGS數(shù)據(jù)的變異解讀基于對現(xiàn)有疾病知識的認知，一些患兒的數(shù)據(jù)可能在之后的數(shù)據(jù)更新中獲得診斷，可能需要醫(yī)生和家屬配合提供進一步的臨床隨訪信息，定期更新數(shù)據(jù)分析。

綜上，WGS可為臨床懷疑為遺傳性疾病的危重癥新生兒提供全面、快速、高性價比的遺傳檢測技術，縮短等待時間，為臨床處置危重癥病例提供診斷依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。