茍海梅 ，方 莉 ，鐘曉武

（1）川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000;2）川北醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系;3）轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，四川 南充 637007）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率位居所有惡性腫瘤的第3 位和第2 位[1]，目前其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢[2]。CRC 較易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肝臟是其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最主要的靶器官，約15%～25%的CRC 患者在確診時(shí)出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，既同時(shí)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（synchronous colorectal liver metastasis，synCRLM），約15%～25%的患者在CRC 原發(fā)灶根治術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，既異時(shí)性結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（metachronous colorectal liver metastasis，metCRLM）[3]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（colorectal liver metastases，CRLM）是CRC 患者最主要的死亡原因，不經(jīng)任何治療的肝轉(zhuǎn)移患者中位生存期僅僅約為7 個(gè)月，無法手術(shù)切除的患者5 a 生存率小于5%[3]。

隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的深入研究，與CRC 發(fā)病和治療相關(guān)的基因也越來越多被發(fā)現(xiàn)，一些針對特定基因靶點(diǎn)的分子靶向藥物不斷問世，CRC 治療也進(jìn)入了靶向個(gè)體化治療時(shí)代。KRAS、NRAS 和BRAF 基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）所介導(dǎo)信號通路下游的重要調(diào)控分子，參與調(diào)控細(xì)胞生長、分化及增殖，其突變狀態(tài)與CRC 能否從靶向藥物抗EGFR 的單克隆抗體獲益密切相關(guān)。KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變后會引起EGFR 依賴的RAS-RAF-MAPK 信號通路持續(xù)激活，引起不依賴于表皮生長因子刺激的細(xì)胞異常增殖和腫瘤產(chǎn)生，導(dǎo)致抗EGFR 單抗治療無效[4]。此外，KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變狀態(tài)與CRC 預(yù)后密切相關(guān)，是CRC 預(yù)后不良獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)[5-7]。

目前國內(nèi)外多項(xiàng)臨床指南推薦原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性CRC 患者均應(yīng)進(jìn)行KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變檢測，對預(yù)后進(jìn)行分層，指導(dǎo)臨床用藥[3,8-10]。但KRAS、NRAS 和BRAF 基因與CRLM的關(guān)系尚不清楚，且鮮有報(bào)道，因此本研究旨在分析KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與CRLM的關(guān)系，為CRC 患者精準(zhǔn)診治提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 病理資料

選取川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2019 年1 月至2021 年10 月間經(jīng)手術(shù)切除后確診CRC 的組織標(biāo)本246 例，進(jìn)行KRAS、NRAS 和BRAF 基因聯(lián)合檢測，并收集每例患者臨床資料包括對應(yīng)的肝轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位、組織學(xué)類型、大體類型、分化程度、腫瘤大小直徑、TNM 分期、乙肝感染情況等。其中男148 例，女98 例；年齡22～85 歲，中位年齡57 歲。

1.2 檢測方法

采用離心柱法應(yīng)用FFPE-DNA 樣品核酸提取試劑盒（艾德，廈門）提取組織基因組DNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測DNA 的濃度和純度，并將提取好的DNA 稀釋至1 ng/μL 備用?；贏RMS 法和熒光PCR 技術(shù)，采用KRAS/NRAS/BRAF 基因突變聯(lián)合檢測試劑盒（艾德，廈門），應(yīng)用SLAN-96P 全自動(dòng)熒光定量PCR 儀（宏石，上海）進(jìn)行KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變檢測。基因檢測位點(diǎn)，見表1。

表1 246 例結(jié)直腸癌患者 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變分析Tab.1 Analysis of KRAS，NRAS and BRAF gene mutations in 246 CRC patients

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較，采用二元Logistic 回歸分析與CRLM 有關(guān)聯(lián)的因素，以P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變分析

246 例CRC 患者中，KRAS 突變率最高，突變率為45.93%（113/246）；其次為NRAS，突變率為6.10%（15/246）；BRAF 突變率最低，突變率為4.87%（12/246）。在所有突變類型中，以KRAS 基因G12S、G12D 突變類型最為常見。KRAS 和NRAS 檢測區(qū)域均包含了2 號外顯子、3 號外顯子和4 號外顯子，其中均以2 號外顯子的檢出率最高，2 號外顯子在KRAS 總突變中占86.72%（98/113），在NRAS 總突變中占66.67%（10/15）。此外，共發(fā)現(xiàn)雙基因突變3 例，分別為KRAS 和NRAS 共同突變、KRAS 和BRAF 共同突變，以及NRAS 和BRAF 共同突變。有2 例存在KRAS雙位點(diǎn)突變，分別為G12C、G12R、G12V、G12A、G13C 突變合并Q61L、Q61R、Q61H 突變，G12S、G12D 突變合并G13D 突變。

2.2 KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結(jié)直腸癌TNM 分期相關(guān)性分析

為了探討KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，本研究分析KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變狀態(tài)與結(jié)直腸癌初診時(shí)TNM 分期的相關(guān)性（表2），結(jié)果顯示NRAS 基因在Ⅳ期的突變率顯著高于Ⅰ～Ⅲ期（P=0.004），且有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的突變率顯著高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者（P=0.001），提示NRAS 突變狀態(tài)與初診時(shí)結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)KRAS 和BRAF基因與TNM 分期具有相關(guān)性（P＞ 0.05）。

表2 KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與結(jié)直腸癌TNM 分期的關(guān)系[n（%）]Tab.2 Relationship between TNM staging and KRAS，NRAS and BRAF gene mutations in CRC [n（%）]

2.3 KRAS、NRAS 和BRAF 基因與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析

本研究246 例CRC 患者中，26.02%（64/246）的CRC 患者在確診時(shí)發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移，既synCRLM。對研究病例進(jìn)行隨訪，分析CRC 患者從確診到病程至1 a 的肝轉(zhuǎn)移情況，共計(jì)200 例CRC 患者獲得隨訪資料，其中1 a 內(nèi)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的比率為46.00%（92/200）。

KRAS、NRAS 和BRAF 基因突變與CRLM 分析結(jié)果顯示，NRAS 突變與synCRLM 相關(guān)，在NRAS 突變組發(fā)生synCRLM 頻率高于NRAS 野生組（P=0.005），見表3，但隨著病程時(shí)間延長，1 a 內(nèi)發(fā)生CRLM 在NRAS 突變組和野生組未見明顯差異（P=0.155）。KRAS 和BRAF 突變與CRLM無明顯相關(guān)性（P＞ 0.05）。

表3 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)影響因素[n（%）]Tab.3 Related influencing factors of colorectal liver metastases [n（%）]

為了進(jìn)一步明確CRLM 的影響因素，本研究分析了性別、年齡、CRC 病理特征及乙肝感染狀況與CRLM 的相關(guān)性，研究結(jié)果顯示，CRLM 與CRC 大體類型具有相關(guān)性，浸潤型CRC 患者發(fā)生synCRLM 頻率高于潰瘍型及隆起型患者（P=0.011），但隨著病程時(shí)間延長，不同大體類型組1a 內(nèi)發(fā)生CRLM 未見明顯差異（P＞ 0.05），見表3。CRLM 與性別、年齡、腫瘤位置、乙肝感染、分化程度、組織學(xué)類型及腫瘤直徑大小均無明顯相關(guān)性（P＞ 0.05）。

將NRAS 突變狀態(tài)和大體類型納入二元Logistic 回歸模型，結(jié)果顯示NRAS 突變是synCRLM 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=9.974，95%CI=1.838～54.130，P=0.008）；潰瘍型（OR=0.253，95%CI=0.085～0.754，P=0.014）和隆起型（OR=0.167，95%CI=0.039～0.709，P=0.015）較浸潤型CRC 發(fā)生synCRLM 的風(fēng)險(xiǎn)低。

3 討論

CRC 的發(fā)生發(fā)展是環(huán)境因素及遺傳因素等共同作用的多階段、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程，受多種基因突變、基因表達(dá)紊亂及表觀遺傳改變等的影響。KRAS、NRAS 和BRAF 作為EGFR 信號通路的關(guān)鍵調(diào)控基因，在CRC 患者的靶向治療中具有重要的指導(dǎo)作用，并可作為CRC 預(yù)后的標(biāo)志物[5-10]。

本研究結(jié)果顯示KRAS、NRAS 和BRAF 的突變率分別為45.93%（113/246）、6.10%（15/246）和4.87%（12/246），其突變頻率與國內(nèi)外研究報(bào)道相似[11-13]，且均以KRAS 基因的突變頻率最高。目前一些相關(guān)研究認(rèn)為KRAS/NRAS 與BRAF 突變是互斥的[14]，但本研究檢出KRAS/BRAF 雙突變以及NRAS/BRAF 雙突變各1 例，此外，Guo[7]等和白楊等[11]也檢出KRAS/BRAF 雙突變或NRAS/BRAF 雙突變，提示KRAS 及NRAS 與BRAF 突變并非完全互斥，其共同突變可存在于少數(shù)病例中。

肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移最主要的靶器官，CRLM 是CRC 預(yù)后不良和死亡的主要原因，如何盡早確診或預(yù)測CRLM，仍面臨重要挑戰(zhàn)，KRAS、NRAS 和BRAF 能否作為CRLM 診斷指標(biāo)目前鮮有相關(guān)研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示NRAS 基因突變與synCRLM 相關(guān)，synCRLM 在NRAS 突變組發(fā)生頻率較高（P=0.005），但隨著病程時(shí)間延長，1 a 內(nèi)發(fā)生CRLM 在NRAS 突變組和野生組未見明顯差異（P=0.155）。二元Logistic 回歸模型結(jié)果顯示NRAS 突變是synCRLM 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示NRAS 基因突變患者早期較易出現(xiàn)CRLM。在與CRC 確診時(shí)TNM 分期分析中，NRAS 基因突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，其突變更易出現(xiàn)在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或Ⅳ期的CRC 患者，進(jìn)一步提示NRAS基因可能參與CRC 的早期轉(zhuǎn)移。RAS 基因是機(jī)體腫瘤中常發(fā)生差異突變的主要驅(qū)動(dòng)致癌基因，其致瘤潛能主要?dú)w因于自主促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和存活，但最近的證據(jù)表明RAS 原癌基因通過向內(nèi)皮細(xì)胞和髓細(xì)胞發(fā)出的不同趨化因子集信號介導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移[15-16]。尤其是NRAS 基因，其突變在高度轉(zhuǎn)移性癌癥中較為常見，如原發(fā)部位不明的轉(zhuǎn)移性腫瘤和黑色素瘤。Adler 等[17]報(bào)道NRAS 突變的皮膚黑色素瘤患者肝轉(zhuǎn)移、中樞神經(jīng)體統(tǒng)、肺轉(zhuǎn)移的幾率增加。Giannou 等[16]研究發(fā)現(xiàn)突變或過表達(dá)NRAS 通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-8 相關(guān)趨化因子的表達(dá)促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞肺定植，并認(rèn)為白細(xì)胞介素-8 相關(guān)趨化因子可能是對抗其他器官癌癥肺轉(zhuǎn)移的重要治療靶點(diǎn)。因此筆者推測，NRAS基因可能通過調(diào)節(jié)趨化因子的表達(dá)促進(jìn)CRC 的早期肝轉(zhuǎn)移或其他遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

盡管KRAS 與NRAS 同屬RAS 基因，但本研究結(jié)果顯示KRAS 突變與CRLM 無明顯相關(guān)性（P均 ＞ 0.05）?？赡芘c其在CRC 中涉及的轉(zhuǎn)移機(jī)制不同相關(guān)。Tie 等[18]研究發(fā)現(xiàn)CRC 肝轉(zhuǎn)移率在KRAS 突變型與KRAS 野生型組無顯著差別，與本研究相符，但該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)KRAS 突變的晚期CRC 患者肺轉(zhuǎn)移率及腦轉(zhuǎn)移率更高。此外，本研究結(jié)果顯示BRAF 突變與CRLM 不具有相關(guān)性；CRC 大體類型與早期CRLM 相關(guān)，浸潤型CRC患者發(fā)生synCRLM 頻率相對較高。

綜上所述，NRAS 突變與synCRLM 相關(guān)，NRAS 突變的CRC 患者早期較易出現(xiàn)CRLM，且NRAS 突變是synCRLM 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。KRAS和BRAF 突變與CRLM 不具有相關(guān)性。對NRAS進(jìn)行檢測不僅在靶向治療中具有重要的指導(dǎo)作用，在早期CRLM 評估中也具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值。