徐晨曦 胡瑞斌 高昕妍,4 喬海法,2,3△ 袁 偉,2,3△

（1 陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，咸陽712046；2 陜西省針藥結合重點實驗室，咸陽712046；3 咸陽市神經(jīng)生物學（針灸）重點實驗室，咸陽712046；4 中國中醫(yī)科學院針灸研究所，北京100700）

多囊卵巢綜合征 (polycystic ovary syndrome, PCOS)是育齡期女性中常見的內(nèi)分泌疾病，臨床主要特征為月經(jīng)不調(diào)、持續(xù)無排卵、高雄激素，易引發(fā)不孕、心血管疾病、肥胖等多種并發(fā)癥，對病人的生活質(zhì)量有極大影響[1]。PCOS 發(fā)病機制尚不確定，通常多認為與炎癥、代謝異常、遺傳等多種因素有關[2]。

穴位選擇是針刺干預的核心部分，穴位被認為是一個動態(tài)的功能區(qū)域，當機體遭受損傷或疾病時，相應穴位以壓敏、痛敏、熱敏、感受野擴大等表現(xiàn)形式被激活，隨著健康狀況而動態(tài)改變[3]。瞬時受體電位香草酸亞型1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)，是非選擇性陽離子通道之一，通常被機械痛、熱刺激、辣椒素等傷害性刺激所激活，在傷害性感受感覺的傳遞和調(diào)節(jié)中起重要作用[4]。降鈣素基因相關肽 (calcitonin gene related peptide, CGRP)，是一種感覺神經(jīng)肽，由37 個氨基酸組成，主要存在于外周和中樞感覺神經(jīng)系統(tǒng)中，CGRP 能夠激活其效應細胞受體、增強傷害感受器敏感性[5]。CGRP 在TRPV1 激活后釋放，機體受損時TRPV1、CGRP 在脊髓、背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 中高度表達[6,7]。穴位敏化是一個動態(tài)而復雜的過程，TRPV1、CGRP 在穴位致敏中起著至關重要的作用[8]。

我國早已在針灸臨床中認識到“以痛為輸”選穴理論，干預敏化腧穴具有更好的療效。機械痛閾降低是體表敏化的重要表現(xiàn)形式之一[9]，脊髓、DRG 組織中的CGRP 等痛敏遞質(zhì)釋放，是參與傷害性感受信息調(diào)控與傳遞的重要環(huán)節(jié)[10,11]。本研究借助課題組前期研究，PCOS 小鼠尾靜脈注射伊文思藍(evans blue, EB) 后，選擇神經(jīng)源性滲出點重疊最多處作為針刺部位[12]，與臨床婦科常用任脈經(jīng)穴關元比較針刺效應差異，對針刺治療該疾病的選穴有積極作用，具有一定的臨床意義。針刺穴位選擇區(qū)別于傳統(tǒng)單一定位，更有助于解釋穴位的本態(tài)研究，但其作用機制尚不明確?；诖耍狙芯坷^續(xù)通過雙酚A (bisphenol A, BPA) 灌胃復制PCOS 動物模型，探討PCOS 小鼠模型體表敏化的可能機制，為臨床PCOS 針刺選穴提供參考及科學依據(jù)。

方 法

1.動物與分組

32 只SPF 級7 周 齡 雌 性ICR 小 鼠，體 質(zhì) 量(29±2) g，購自西安交通大學動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2018-001，飼養(yǎng)于陜西省針藥結合重點實驗室，飼養(yǎng)溫度 (22±2)℃，相對濕度 (50±10)%，12 h 晝夜交替循環(huán)照明，自由飲水、攝食。小鼠隨機分為對照組（Con 組）、模型組（PCOS 組）、電針關元組（EA-CV4 組）、電針敏化點組（EA-sensitization 組），每組8 只。實驗過程嚴格按照2006 年科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》及陜西省針藥結合重點實驗室動物相關管理規(guī)定（倫理審批號：SVCMDL20210901003）。

2.主要儀器和試劑

小動物麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司），韓氏電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），華佗牌針灸針（規(guī)格10 mm×0.19 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），vonFrey 測痛儀（美國IITC Life Science），酶標儀（美國Biotek），超聲波細胞粉碎機（寧波新藝超聲設備有限公司），冰凍切片機、臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher），熒光顯微鏡（德國Leica），電泳儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad）。

BPA（西安灝洋生物有限公司），TRPV1 抗體（美國abcam），CGRP 抗體（美國cell signaling），β-actin 抗體（武漢博士德生物工程有限公司），正常驢血清、Alexa Fluor 488 驢抗小鼠熒光二抗、Alexa Fluor 647 驢抗兔熒光二抗（上海翊圣生物科技有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），HRP 標記山羊抗鼠/兔二抗（笛醫(yī)生物科技有限公司）。

3.造模方法

采用BPA 灌胃的方式制備PCOS 小鼠模型[12]，除對照組外，各組小鼠按0.1 ml/10 g 劑量灌胃玉米油配置的BPA 溶液，每日1 次，連續(xù)5 天，共干預4 周，對照組以同等條件進行玉米油灌胃。HE 染色中小鼠卵巢組織具有囊性擴張、閉鎖卵泡為模型制備成功的標準[13]。

4.干預方法

電針關元組根據(jù)《實驗針灸學》選取關元穴，電針敏化組根據(jù)前期研究[12]，選取小鼠腹部臍下約8 mm，前正中線旁開約3 mm 兩側敏化點。用韓氏電針儀給予電針刺激，強度2.0 mA，頻率2 Hz。每次20 min，每日1 次，連續(xù)5 天，共治療4 周。對照組、模型組以同等條件進行抓取固定。

5. 觀察指標及檢測方法

（1）電子vonFrey 測定小鼠體表關元穴及腹部敏化點機械痛閾值：電針結束后第3 天，用探針緩慢刺激小鼠腹部針刺敏化點選取部位及關元穴，當小鼠出現(xiàn)甩尾、肢體抖動等躲避行為時，顯示屏數(shù)值即為痛閾值，間隔3 min 重復測量3 次，取平均值。

（2）HE 染色法觀察小鼠卵巢病理形態(tài)：每組取4只小鼠卵巢組織，多聚甲醛固定后蔗糖梯度脫水，OCT 冷凍包埋，冰凍切片機切片（厚度16 μm），HE 染色、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察小鼠的卵巢組織形態(tài)。

（3）Western blot 法檢測小鼠脊髓及DRG 組織中TRPV1、CGRP 蛋白表達：每組取4 只小鼠胸椎 (T)13-腰椎 (L)2節(jié)段脊髓及DRG 組織，RIPA 裂解液中靜置20 min，超聲破碎3 次×6 s，4℃離心提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，將樣品定量至5 μg/ml。用5%濃縮膠、15%分離膠進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉至PVDF 膜后室溫封閉2 h，TRPV1 抗 體(1:2000)、CGRP 抗 體 (1:1000)，4℃孵育過夜，HRP 二抗 (1:10 000) 室溫孵育2 h，TBST 洗膜10 min×3 次，滴加ECL 發(fā)光液，化學發(fā)光成像儀上檢測。Image Pro-Plus 6.0 分析各條帶的灰度值，TRPV1、CGRP 灰度值與β-actin 的比值作為TRPV1、CGRP 相對表達量，每組數(shù)據(jù)以對照組作歸一化處理。

（4）免疫熒光染色法檢測小鼠脊髓及DRG 組織中TRPV1/CGRP 陽性共表達：每組取4 只小鼠T13-L2節(jié)段脊髓及DRG 組織，多聚甲醛固定后蔗糖梯度脫水，OCT 冷凍包埋，冰凍切片機切片(16 μm)。用含3‰ TritonX 100 的驢血清封閉2 h，TRPV1 (1:500)、CGRP 抗體(1:500)一抗4℃孵育過夜，熒光二抗（Alexa Fluor 488 驢抗小鼠，1:400；Alexa Fluor 647 驢抗兔，1:400）避光孵育2 h，DAPI染核5 min，PBS 洗10 min×3 次后封片，熒光顯微鏡閱片，Image Pro-Plus 6.0 統(tǒng)計共表達TRPV1/CGRP細胞個數(shù)。

6.統(tǒng)計學分析

SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料采用均數(shù)±標準誤(±SEM)表示。多組間比較選用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較選用LSD 檢驗，方差不齊時，采用Tamhane's T2 檢驗。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.各組小鼠卵巢組織形態(tài)學比較

對照組小鼠卵巢組織具有不同階段發(fā)育良好的卵泡；模型組小鼠卵泡內(nèi)顆粒細胞層減少，囊性擴張、閉鎖卵泡增加；電針關元組及電針敏化組小鼠對比模型組小鼠卵巢顆粒細胞層數(shù)增多，卵泡及黃體發(fā)育良好（見圖1）。

圖1 小鼠卵巢組織形態(tài)比較小鼠卵巢組織HE 染色圖，藍色箭頭所示為正常卵泡，黃色箭頭所示為黃體，紅色箭頭所示為閉鎖卵泡，黑色箭頭所示為顆粒細胞層，標尺= 100 μmFig. 1 Comparison of histological morphology of mouse ovarian tissue HE staining of mouse ovarian tissue, blue arrows indicate normal follicles, yellow arrows indicate corpus luteum, red arrows indicate atresia follicles, and black arrows indicate the granulosa cell layer. Scale bar = 100 μm

2.各組小鼠機械痛閾值比較

與對照組比較，模型組關元穴、敏化點痛閾值顯著下降(P< 0.01)；與模型組比較，電針關元組關元穴及敏化點痛閾值顯著升高(P< 0.05)、電針敏化組關元穴及敏化點痛閾值顯著升高(P< 0.05、P<0.01)；電針關元組和電針敏化組比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖2）。

圖2 小鼠機械痛閾值比較(n = 8,±SEM)(A)各組小鼠關元穴痛閾值比較；(B)各組小鼠敏化點痛閾值比較**P< 0.01，與對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與模型組相比Fig. 2 Comparison of mechanical pain threshold in mice (n = 8,±SEM)(A) Comparison of pain threshold at CV4 acupoint in each group; (B) Comparison of pain threshold at sensitization point in eachgroup.**P<0.01,compared with group control; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group model.

3. 各組小鼠T13-L2 節(jié)段脊髓、DRG 組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達比較

與對照組比較，模型組脊髓組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達顯著升高(P< 0.05、P< 0.01)、DRG組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，電針關元組和電針敏化組脊髓、DRG 組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達顯著降低(P< 0.05)；電針關元組與電針敏化組比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖3、4）。

圖3 小鼠脊髓組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達比較(n = 4,±SEM)(A) TRPV1、CGRP 和β-actin Western blot 條帶例圖；(B)各組小鼠脊髓組織中TRPV1 蛋白表達比較；(C) 各組小鼠脊髓組織中CGRP 蛋白表達比較*P < 0.05，**P < 0.01，與對照組相比；#P < 0.05，與模型組相比Fig. 3 Comparison of TRPV1 and CGRP protein expression in mice spinal cord tissue (n = 4,±SEM)(A) Representative bands of TRPV1, CGRP and β-actin in Western blot; (B) Comparison of TRPV1 protein expression in spinal cord tissue of mice in each group; (C) Comparison of CGRP protein expression in spinal cord tissue of mice in each group.*P < 0.05, **P < 0.01, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

4. 各組小鼠T13-L2 節(jié)段脊髓、DRG 組織中TRPV1/CGRP 陽性共表達比較

與對照組比較，模型組脊髓、DRG 組織中TRPV1/CGRP 陽性共表達顯著升高(P< 0.01、P<0.05)；與模型組比較，電針關元組及電針敏化組脊髓、DRG 組織中TRPV1/CGRP 陽性共表達顯著降低(P< 0.01、P< 0.05)；電針關元組和電針敏化組比較差異無統(tǒng)計學意義（見圖5、6）。

圖5 小鼠脊髓組織中TRPV1/CGRP 共表達光密度比較(n = 4,±SEM)(A)小鼠脊髓組織中TRPV1 及CGRP 陽性表達圖（免疫熒光染色法），標尺 = 100 μm，綠色標記TRPV1，紅色標記CGRP，細胞核用藍色標記，白色箭頭示為TRPV1/CGRP 陽性共表達；(B) 各組小鼠TRPV1/CGRP 共表達光密度比較**P < 0.01，與對照組相比；#P < 0.05，##P < 0.01，與模型組相比Fig. 5 Comparison of the optical density of TRPV1/CGRP co-expression in mice spinal cord tissue (n = 4,±SEM)(A) Positive expression of TRPV1 and CGRP in mice spinal cord tissue (immunofluorescence staining method), Scale bar = 100 μm, TRPV1 is marked in green, and CGRP is denoted in red, the nuclei are marked with blue, and white arrows indicate the positive co-expression of TRPV1/CGRP; (B) Optical density comparison of TRPV1/CGRP co-expression in each group of mice.**P < 0.01, compared with group control; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group model.

討 論

PCOS 是一種常見的女性生殖系統(tǒng)疾病，占排卵障礙病人的70%～80%，在不孕癥的病因學中起重要作用[14]。無排卵、多囊樣卵巢是PCOS 的典型特征，PCOS 小鼠多表現(xiàn)為囊性卵泡數(shù)量顯著增加、黃體減少[15]。本研究通過對小鼠卵巢組織進行HE染色，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠卵巢組織囊性擴張、閉鎖卵泡明顯增加，電針關元組及電針敏化組小鼠卵巢組織顆粒細胞層數(shù)增多，卵泡及黃體發(fā)育良好。提示成功建立PCOS 小鼠模型，且電針能夠改善PCOS小鼠卵巢組織病理形態(tài)。

圖4 小鼠DRG 組織中TRPV1 及CGRP 蛋白表達比較(n = 4,±SEM)(A) TRPV1、CGRP 和β-actin Western blot 條帶例圖；(B) 各組小鼠DRG 組織中TRPV1 蛋白表達比較；(C)各組小鼠DRG 組織中CGRP 蛋白表達比較*P < 0.05，與對照組相比；#P < 0.05，與模型組相比Fig. 4 Comparison of TRPV1 and CGRP protein expression in mice DRG tissue (n = 4,±SEM)(A) Representative bands of TRPV1, CGRP and β-actin in Western blot; (B) Comparison of TRPV1 protein expression in DRG tissues of mice in each group; (C) Comparison of CGRP protein expression in DRG tissues of mice in each group.*P < 0.05, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

圖6 小鼠DRG 組織中共表達TRPV1/CGRP 細胞個數(shù)比較(n = 4,±SEM)(A) 小鼠DRG 組織中TRPV1 及CGRP 陽性表達圖（免疫熒光染色法），標尺 = 100 μm，綠色標記TRPV1，紅色標記CGRP，細胞核用藍色標記，白色箭頭示為TRPV1/CGRP 共表達細胞；(B) 各組小鼠共表達TRPV1/CGRP細胞數(shù)量比較*P < 0.05，與對照組相比；#P < 0.05，與模型組相比Fig. 6 Comparison of the number of cells co-expressing TRPV1/CGRP in mice DRG tissues (n = 4,±SEM)(A) Positive expression of TRPV1 and CGRP in mice DRG tissue (immunofluorescence staining method), Scale bar =100 μm, TRPV1 is marked in green, CGRP is marked in red, nuclei are marked in blue, and white arrows indicate cells that co-express TRPV1/CGRP; (B) Comparison of the number of co-expressing TRPV1/CGRP cells in each group of mice.*P < 0.05, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

中醫(yī)認為，腧穴既是針刺治療疾病的刺激部位，也是疾病的反應部位，具有“按而痛止”“按之快然”的特點?！秱浼鼻Ы鹨健ぞ睦酚涊d：“有阿是之法，言人有病痛，即令捏其上，若理當其處，不問孔穴……灸刺皆驗”，表明針刺痛敏點可以明顯的緩解病痛。臨床研究表明，機體病理狀態(tài)下，與疾病相關的體表反射區(qū)存在痛覺敏化現(xiàn)象，按壓這些特殊區(qū)域具有疼痛、酸脹等感覺，且壓痛點多位于與臟腑相關的體表經(jīng)絡、穴位，具有相對特定聯(lián)系[16,17]。在動物實驗中同樣可以觀察到內(nèi)臟疾病引發(fā)的痛覺敏化現(xiàn)象[18]。吳強等[19]采用觸診法對143 名卵巢相關疾病病人體表進行按壓探查壓痛點，發(fā)現(xiàn)壓痛區(qū)域主要分布在下腹部、腰骶、下肢內(nèi)側等，與經(jīng)穴、經(jīng)脈存在高度相關性。以上研究表明，體表壓痛是穴位敏化的主要表現(xiàn)形式之一，疾病狀態(tài)下腧穴痛閾降低。我們的前期研究[12]發(fā)現(xiàn)PCOS 小鼠尾靜脈注射EB 后，雙下肢內(nèi)側、下腹部、腰骶部體表可見藍色的EB 滲出點，電針EB點重合最多處與同一脊髓節(jié)段體表區(qū)域的關元穴具有相似效應。為進一步驗證穴位敏化現(xiàn)象，本研究對PCOS 小鼠關元穴及敏化點進行痛閾測定，發(fā)現(xiàn)機械痛閾值顯著低于對照組，PCOS 小鼠關元穴及敏化點具有痛覺敏化。電針能夠顯著提高其機械痛閾值，進一步驗證了穴位的開/合功能是“活的”，并伴隨內(nèi)臟病理生理變化而動態(tài)改變。

機體病變時，相應體表多出現(xiàn)神經(jīng)源性炎性病理改變，特殊部位從“靜息態(tài)”到“激活態(tài)”動態(tài)轉變，TRPV1、CGRP 等受體在敏化點的高表達可能是體表敏化的物質(zhì)基礎[20]。TRPV1、CGRP 在神經(jīng)性疼痛中起關鍵作用，不僅參與痛覺過敏，還可調(diào)控疼痛[21]。TRPV1 在機體遭受有害刺激后激活，同時釋放CGRP、P 物質(zhì)等傷害性神經(jīng)肽，引發(fā)神經(jīng)源性炎癥導致外周敏化[22]。CGRP 是對傷害性傳遞至關重要的一種神經(jīng)肽，與神經(jīng)源性炎癥的發(fā)展密切相關[23]。TRPV1 介導的CGRP 釋放可加強TRPV1 在疼痛感覺中的作用，TRPV1 和CGRP之間存在相互作用關系[24]。研究表明PCOS 能顯著增加血漿CGRP 及卵巢中CGRP 陽性神經(jīng)纖維的表達[25]，CGRP 的過量釋放可通過感覺神經(jīng)末梢引起穴位致敏，針灸能夠減少CGRP、腫瘤壞死因子α、白介素6 的釋放進而降低TRPV1 敏感性及表達水平[26]，通過調(diào)節(jié)TRPV1 離子通道降低PCOS病人中性粒細胞的氧化應激和Ca2+濃度，從而改善PCOS 病人炎癥癥狀[27]。以上研究提示CGRP、TRPV1 參與了PCOS 的病理生理過程。PCOS 小鼠EB 點主要集中于T13-L2脊髓節(jié)段支配的體表區(qū)域，具有神經(jīng)源性炎性反應[12]。內(nèi)臟傷害性信息經(jīng)DRG傳入脊髓背角，經(jīng)背根反射傳至外周引發(fā)EB 滲出，TRPV1、CGRP 陽性細胞在敏化穴區(qū)高度表達[28]。神經(jīng)源性炎性反應中最易產(chǎn)生敏化現(xiàn)象，脊髓背角的傷害感受神經(jīng)元隨著機體病理變化而動態(tài)改變，外周傷害性刺激的傳入可引發(fā)可塑性變化[29]。在炎癥疼痛大鼠模型中，DRG 組織中CGRP 陽性神經(jīng)元與TRPV1 部分重疊，TRPV1 激活參與CGRP表達的上調(diào)[30]。在本研究中，與對照組比較，模型組T13-L2節(jié)段脊髓、DRG 組織中TRPV1、CGRP表達水平及TRPV1/CGRP 共表達光密度均顯著升高，表明TRPV1 通道激活、CGRP 釋放增加，引起體表機械痛閾降低，穴位敏化反應。電針可顯著降低脊髓、DRG 組織中TRPV1、CGRP 表達水平及TRPV1/CGRP 陽性共表達，表明TRPV1、CGRP 參與PCOS 小鼠的穴位敏化部分機制，關元穴及敏化點壓痛敏化可能與T13-L2節(jié)段脊髓、DRG中TRPV1、CGRP 表達顯著升高有關；隨著電針改善PCOS 小鼠卵巢組織病理形態(tài)，關元穴及敏化點痛閾值顯著升高，T13-L2節(jié)段脊髓、DRG 組織中TRPV1、CGRP 表達顯著下降，進一步說明穴位敏化和內(nèi)臟功能有關，電針可通過下調(diào)脊髓、DRG 組織中TRPV1、CGRP 的異常高表達，調(diào)節(jié)PCOS 小鼠體表敏化現(xiàn)象。電針EB 點重合最多處與同一脊髓節(jié)段體表區(qū)域的關元穴具有相似效應，穴位不是一個簡單的反應點，而是一塊動態(tài)功能區(qū)域。

綜上所述，電針敏化點與關元可改善PCOS 小鼠卵巢組織病理形態(tài)，降低PCOS 小鼠T13-L2節(jié)段脊髓、DRG 組織中TRPV1、CGRP 的異常高表達，進而提高關元穴及敏化點的機械痛閾值，調(diào)節(jié)穴位痛覺敏化反應，說明TRPV1、CGRP 參與PCOS 小鼠模型的穴位敏化部分機制。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。