李曉蕾，李忠華，王鵬

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院實驗中心，貴州 都勻 558000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 都勻 558000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，哈爾濱 大慶 163319）

腦缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷是缺血性腦卒中后一定時間內(nèi)恢復(fù)或重建血液再灌注，使原有的缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象，與缺血性腦卒中后的致殘率和死亡率密切相關(guān)［1］。腦I/R損傷可發(fā)生于缺血后數(shù)小時至數(shù)天，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等相關(guān)［2］。進一步明確腦I/R損傷的發(fā)生機制，制定有效的防治措施，是腦卒中研究有待解決的重要問題。鐵離子廣泛存在于腦組織中，腦缺血時腦組織中鐵離子含量增加，神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化，細胞死亡增多。研究［3］表明，鐵代謝和脂質(zhì)代謝調(diào)控信號異常均能導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生，說明鐵死亡在腦I/R損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）屬 于STEAP家 族，是一種鐵還原酶，在鐵代謝過程中能夠促進Fe3+還原成Fe2+，影響鐵穩(wěn)態(tài)、炎癥、細胞增殖等過程［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，敲除STEAP3表達通過抑制TAK1途徑而減輕肝臟I/R損傷。然而，STEAP3在腦I/R損傷中的表達及其與鐵死亡是否有關(guān)未見報道。本研究基于鐵死亡，分析STEAP3在沙鼠腦I/R損傷中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

48只健康雄性蒙古沙鼠，體質(zhì)量60～80 g，4～5月齡，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)機能實驗室提供。動物飼養(yǎng)實驗室溫度（24±1）℃，濕度45%～70%。將48只沙鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、I/R模型組（I/R組）、I/R模型+STEAP3小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）組（siRNA組）和I/R模型+scramble siRNA組（Control組），每組12只。

1.2 主要試劑

STEAP3和4-HNE購自英國Abcam公司；H2AX購自美國Cell signaling公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）購自美國Santa Cruz公司；GAPDH購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Nissl、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和Fe2+試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。STEAP3 siRNA和scramble siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自美國羅氏公司。

1.3 沙鼠腦I/R損傷模型的建立

沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉。麻醉后仰臥位固定，剪去頸部的毛，再剪開皮膚，分離皮下組織和肌肉，顯示出兩側(cè)頸總動脈，使用無創(chuàng)微動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈5 min。松開動脈夾，使腦血流恢復(fù)。Sham組不夾閉兩側(cè)頸總動脈，其他操作同I/R組。siRNA組和Control組沙鼠在手術(shù)前24 h分別尾靜脈注射STEAP3 siRNA和scramble siRNA，其他操作同I/R組。

1.4 神經(jīng)功能評分

建模后24 h，參考文獻［6］進行神經(jīng)功能評分：無癥狀，0分；身體蜷縮或毛發(fā)凌亂，1分；眼瞼下垂，2分；旋轉(zhuǎn)行為，3分；后肢外翻，4分；痙攣，5分。分值越高，說明沙鼠神經(jīng)功能損傷情況越嚴重。

1.5 Nissl染色

沙鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進行麻醉，斷頭取腦，分離海馬組織，用于后續(xù)實驗。每組隨機選取6只沙鼠的海馬組織，制成石蠟切片。切片脫蠟至水后，滴加Nissl染色液，37 ℃孵育10 min，蒸餾水洗3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次，10 min/次，中性樹脂膠封片。

1.6 Fe2+和MDA水平測定

每組隨機選取6只沙鼠海馬組織，稱重后用生理鹽水制成10%的勻漿，離心后取上清。根據(jù)試劑盒說明書檢測Fe2+和MDA水平。

1.7 Western blotting檢測STEAP3、H2AX、4-HNE、GPX4蛋白的表達

收集沙鼠的海馬組織，提取總蛋白，測定濃度。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用STEAP3（1∶100）、H2AX（1∶100）、4-HNE（1∶200）、GPX4（1∶500）抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育，ECL顯色成像。通過圖像分析軟件進行積分吸光度分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 STEAP3在腦I/R沙鼠海馬組織中的表達

采用Western blotting檢測Sham組和I/R組沙鼠海馬組織中STEAP3蛋白的表達。結(jié)果顯示，I/R組STEAP3蛋白的表達高于Sham組（P＜ 0.05），見圖1。提示STEAP3蛋白高表達可能與腦I/R損傷相關(guān)。

圖1 Western blotting檢測STEAP3蛋白的表達Fig.1 Expression of STEAP3 protein detected using Western blotting

2.2 STEAP3干擾后對腦I/R沙鼠神經(jīng)功能評分的影響

腦I/R后24 h進行神經(jīng)功能評分。Sham組沙鼠無神經(jīng)功能缺損的癥狀，神經(jīng)功能評分為0分；I/R組沙鼠神經(jīng)功能受到不同程度損傷，出現(xiàn)身體蜷縮、眼瞼下垂、旋轉(zhuǎn)行為、后肢外翻及痙攣等，神經(jīng)功能評分為（3.58±1.24）分；siRNA組沙鼠主要表現(xiàn)為身體蜷縮、毛發(fā)凌亂和眼瞼下垂等，神經(jīng)功能評分為（2.58±0.90）分；Control組沙鼠表現(xiàn)與I/R組相同，神經(jīng)功能評分為（3.50±1.09）分。I/R組神經(jīng)功能評分明顯高于Sham組（P＜ 0.01），與Control組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；siRNA組神經(jīng)功能評分低于I/R組（P＜ 0.01）和Control組（P＜ 0.05）。

2.3 STEAP3干擾后腦I/R沙鼠海馬組織中STEAP3和H2AX的表達

Western blotting檢測沙鼠海馬組織中STEAP3蛋白和細胞DNA損傷指標H2AX蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，I/R組STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表達明顯高 于Sham組（P＜ 0.05，P＜ 0.01），siRNA組STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表達明顯低于I/R組（均P＜ 0.01）和Control組（P＜ 0.05，P＜ 0.01），I/R組 與Control組 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞ 0.05）。見圖2。

圖2 Western blotting檢測STEAP3蛋白和H2AX蛋白的表達水平Fig.2 Expression of STEAP3 and H2AX proteins detected using Western blotting

2.4 STEAP3干擾后對腦I/R沙鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響

Nissl染色（圖3A）顯示各組沙鼠海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元損傷情況：Sham組神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；I/R組和Control組神經(jīng)元輪廓模糊，部分神經(jīng)元丟失；siRNA組與I/R組比較，神經(jīng)元數(shù)量增多，結(jié)構(gòu)輪廓比較清晰。顯微鏡下計數(shù)各組海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，結(jié)果（圖3B）顯示，I/R組神經(jīng)元數(shù)量明顯低于Sham組（P＜ 0.01），siRNA組神經(jīng)元數(shù)量明顯增多于I/R組和Control組（P＜ 0.01），Control組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖3 STEAP3對腦I/R沙鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響Fig.3 Effects of STEAP3 on hippocampal neuron injury of gerbils with cerebral I/R

2.5 STEAP3干擾后對腦I/R沙鼠海馬組織中GPX4蛋白表達的影響

GPX4為鐵死亡相關(guān)蛋白，應(yīng)用Western blotting檢測各組沙鼠海馬組織中GPX4的表達情況，結(jié)果（圖4）顯示，I/R組與Sham組比較GPX4蛋白表達明顯減少（P＜ 0.01），siRNA組GPX4蛋白表達明顯高于I/R組（P＜ 0.05）和Control組（P＜ 0.01），Control組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖4 STEAP3對腦I/R沙鼠海馬組織中GPX4蛋白表達的影響Fig.4 Effects of STEAP3 on the expression of GPX4 protein in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

2.6 STEAP3干擾后對腦I/R沙鼠海馬組織中Fe2+的影響

應(yīng)用Fe2+試劑盒檢測沙鼠海馬組織中的Fe2+，結(jié)果（圖5）顯示，I/R組與Sham組比較Fe2+水平明顯升高（P＜ 0.01），siRNA組Fe2+水平明顯下降，明顯低于I/R組和Control組（P＜ 0.01），Control組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖5 STEAP3對腦I/R沙鼠海馬組織中Fe2+水平的影響Fig.5 Effects of STEAP3 on the Fe2+ levels in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

2.7 STEAP3干擾后對腦I/R沙鼠海馬組織中4-HNE表達和MDA含量的影響

為了分析STEAP3對細胞脂質(zhì)氧化的影響，首先應(yīng)用Western blotting檢測4-HNE蛋白的表達，結(jié)果（圖6A）顯示，I/R組4-HNE蛋白表達明顯高于Sham組（P＜ 0.05），而敲除STEAP3后siRNA組4-HNE蛋白表達低于I/R組和Control組（P＜ 0.05），Control組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。接下來應(yīng)用MDA試劑盒檢測MDA含量，結(jié)果（圖6B）顯示，I/R組腦組織MDA含量明顯高于Sham組（P＜ 0.01），而siRNA組MDA含量明顯低于I/R組和Control組（P＜0.01），Control組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 STEAP3對腦I/R沙鼠海馬組織中4-HNE蛋白表達和MDA含量的影響Fig.6 Effects of STEAP3 on the expression of 4-HNE protein and MDA content in the hippocampus of gerbils with cerebral I/R

3 討論

腦是機體重要的器官之一，對缺氧的耐受能力差，缺血數(shù)分鐘就會造成不可逆性損傷。但在缺血后一定時間內(nèi)恢復(fù)腦血液灌注，會加重缺血腦組織不可逆性損傷［7］。腦缺血再灌注損傷與缺血性腦卒中后的致殘率和死亡率密切相關(guān)，深入闡明腦I/R損傷的發(fā)生機制，能夠為臨床治療提供重要參考，減輕再灌注導(dǎo)致的腦組織損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，鐵還原酶STEAP3在沙鼠腦I/R模型中高表達，敲除其表達可明顯減輕腦組織損傷，說明STEAP3能夠促進腦I/R損傷的發(fā)生；通過檢測鐵死亡相關(guān)指標GPX4、Fe2+、4-HNE、MDA，發(fā)現(xiàn)腦I/R損傷中STEAP3可能通過鐵死亡途徑發(fā)揮作用。

短暫的缺血性低灌注可導(dǎo)致嚴重的急性腦損傷。腦組織再灌注過程中，多種復(fù)雜的機制可誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)損傷。大量研究已經(jīng)證實，在腦I/R引起的神經(jīng)元損傷中，鐵死亡是神經(jīng)元死亡的主要形式之一。鐵死亡是基于細胞內(nèi)亞鐵的細胞死亡方式，在生物化學(xué)、形態(tài)和遺傳上與凋亡、壞死和自噬不同［8］，鐵和氧化還原代謝的多種因素導(dǎo)致了鐵死亡。

STEAP家族包括4個多通道膜蛋白，最初被報道為鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，并已被確定參與許多細胞和分子事件，如細胞命運和炎癥反應(yīng)。STEAP3作為該家族的主要成員之一，已被證實參與了鐵穩(wěn)態(tài)、外泌體的組裝和分泌、炎癥等一些生物學(xué)過程［9］。本研究通過Western blotting檢測沙鼠海馬組織中STEAP3蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)I/R組STEAP3蛋白的表達明顯高于Sham組，提示STEAP3在腦I/R損傷中可能發(fā)揮一定的作用。為探究STEAP3的作用機制，造模前24 h給予沙鼠尾靜脈注射STEAP3 siRNA（siRNA組）。siRNA組沙鼠神經(jīng)功能評分和海馬組織中DNA損傷指標H2AX 蛋白表達明顯低于I/R組，Nissl染色也發(fā)現(xiàn)siRNA組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量多于I/R組。這些結(jié)果說明，敲除STEAP3能夠減輕腦I/R組織的損傷程度。

鐵死亡的主要特點是鐵依賴性，即細胞內(nèi)游離鐵增多，F(xiàn)e2+提供了氧化過程所需的電子。貯鐵蛋白降解釋放和轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)入增多等多種途徑使大量Fe3+進入細胞內(nèi)，細胞內(nèi)Fe3+被還原為Fe2+，構(gòu)成了體內(nèi)不穩(wěn)定鐵池的來源，一方面通過芬頓反應(yīng)直接導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物增多，另一方面參與合成含鐵酶類促發(fā)鐵死亡［10］。STEAP3是一種鐵還原酶，能夠促進Fe3+還原成Fe2+。本研究證實，I/R組Fe2+增多，干擾STEAP3表達，siRNA組與I/R組比較沙鼠海馬組織Fe2+水平明顯降低，說明STEAP3能夠影響腦I/R組織中Fe2+的水平。

GPX4被認為是鐵死亡標志性蛋白，是一種將H2O2分解成水或相應(yīng)醇的酶，GPX4活性降低可提高細胞質(zhì)和脂質(zhì)的活性氧水平，最終導(dǎo)致細胞鐵死亡［11］。4-HNE蛋白表達和MDA含量被用來評價細胞內(nèi)脂質(zhì)氧化的水平。本研究也進一步證實，與Sham組比較I/R組GPX4蛋白表達減少，4-HNE蛋白表達和MDA含量增多；而siRNA組與I/R組比較，GPX4蛋白表達增多，4-HNE蛋白表達和MDA含量減少。以上結(jié)果提示，STEAP3可能通過促進細胞內(nèi)Fe3+還原為Fe2+，介導(dǎo)鐵死亡，從而影響腦I/R損傷的發(fā)生和發(fā)展。

STEAP3是鐵代謝有關(guān)的基因，與腫瘤等多種疾病有關(guān)。在腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，STEAP3通過誘導(dǎo)間質(zhì)轉(zhuǎn)化、促進轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達和激活STAT3-FoxM1信號軸促進膠質(zhì)瘤的進展［12］；STEAP3通過阻滯細胞周期G1期，抑制肝癌細胞增殖［13］。在病理性心肌肥大的研究中發(fā)現(xiàn)，STEAP3可阻斷Rac1依賴性信號級聯(lián)的激活，是病理性心肌肥大的負調(diào)節(jié)因子［14］。STEAP3在肝臟I/R損傷中的作用已被證實，并通過TAK1介導(dǎo)JNK/p38途徑發(fā)揮功能［5］。

綜上所述，本研究證實了STEAP3在沙鼠腦I/R損傷中高表達，并通過介導(dǎo)鐵死亡而影響腦I/R損傷的發(fā)生和發(fā)展，抑制其表達對腦I/R損傷具有保護作用。