李想，畢佳璇，孫秋霞，于潤澤，賈斯祺，付秀美，2

（1.承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學院人體解剖學教研室，河北 承德 067000；2.河北省神經損傷與修復重點實驗室，河北 承德 067000）

周圍神經損傷（peripheral nerve injury，PNI）常因切割、牽拉、壓迫等外力損傷所致，造成神經干連續(xù)性受損和神經細胞脫髓鞘等壞死性損傷，主要表現為遠端效應器發(fā)生萎縮，近端神經元發(fā)生凋亡、壞死等一系列的改變［1-2］。目前，臨床上短距離的神經缺失可在兩斷端間行神經吻合術，而長距離的神經缺失則需要借助神經導管或神經移植物［3］。脫細胞神經移植物（acellular nerve graft，ANA）去除了具有抗原性的細胞及髓鞘部分，保存了完整的通道結構，具有較低的免疫原性和較好的組織相容性。前期動物實驗證明應用ANA所構建的組織工程神經可通過搭建細胞再生通道、促進施萬細胞（Schwann cells，SCs）分泌神經營養(yǎng)因子、引導軸突再生等發(fā)揮促進神經再生修復的作用［4-5］。

腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一種具有神經營養(yǎng)作用的蛋白質，在維持神經元存活以及促進損傷神經修復再生方面發(fā)揮著不可替代的作用［6-7］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號通路參與細胞增殖分化和生長的調節(jié)，在PNI的修復再生中扮演著重要的角色［8］。MA等［9］在坐骨神經橫斷損傷模型中證實PI3K/Akt信號通路參與了SCs增殖和遷移的過程。MAO等［10］發(fā)現在背根神經節(jié)細胞軸突再生過程中，PI3K/Akt信號通路起到了關鍵作用。BDNF的作用機制目前尚不明確，本研究通過測定運動神經傳導速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）和脛前肌濕重比率，觀察脊髓細胞形態(tài)結構，檢測脊髓內BDNF和磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B，p-Akt）蛋白的表達，進一步闡明BDNF促進損傷神經再生修復的作用及其機制，為長距離神經損傷的康復治療提供新的治療靶點和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

LY294002（M1925）購自美國Abmole公司；兔抗BDNF（A4873）、兔抗Akt1（A11016）、兔抗p-Akt1（phospho-Akt1-S473，AP0098）、HRP 標記 山羊 抗兔IgG、兔抗ACTB（AC026）抗體購自美國ABclonal公司；尼氏染色液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、快速凝膠試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司。Tanon-6100全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；生物顯微鏡（BX43、DP27）、熒光顯微鏡（BX43、DP73）和圖像采集分析系統(tǒng)購自日本Olympus公司；BL-420I信息化集成化信號采集與處理系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司。

1.2 實驗動物分組和處理

SPF級雄性SD大鼠35只，體質量（200±20）g，購自北京華阜康生物科技有限公司，動物合格證編號SCXK（京）2019-0008。將大鼠置于12 h黑白交替、溫度22～24 ℃、相對濕度65%～75%的飼養(yǎng)環(huán)境中。隨機選取10只大鼠用于ANA制備，5只作為正常（N）組。其余20只大鼠先建立坐骨神經損傷模型：仔細分離、顯露右側坐骨神經，于梨狀肌下緣約5 mm處用顯微手術剪切除右側坐骨神經10 mm。將模型大鼠隨機分為模型（M）組、ANA組、抑制劑LY294002（LY）組、溶劑對照（LYC）組，每組5只。M組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，無任何操作；其余3組采用顯微縫合技術將制備好的ANA與損傷神經的兩斷端進行端-端吻合；LY組在術后2 d腹腔注射LY294002（2.0 ng·mL-1·kg-1），連續(xù)注射4周。LYC組腹腔注射DMSO，操作、劑量和時間均同LY組。本研究獲得承德醫(yī)學院實驗動物管理和倫理委員會批準（CDMCLAC-20201001-001），實驗過程及操作均符合國家有關實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.3 ANA制備

麻醉大鼠（2%戊巴比妥鈉40 mg/kg，腹腔注射），于兩側股部行斜切口顯露并分離雙側坐骨神經。用顯微手術剪取雙側坐骨神經15 mm，置于專用容器內行如下脫細胞處理：于蒸餾水中浸泡12 h后，置于4.0%TritonX-100溶液中浸泡洗滌12 h；蒸餾水漂洗3 h；浸入3%脫氧膽酸鈉溶液，于脫色搖床上持續(xù)振蕩12 h（100次/min）；上述步驟重復1次；蒸餾水漂洗過夜；置于含抗生素的0.01 mol/L PBS中，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠坐骨神經MNCV測定

采用BL-420I信息化集成化信號采集與處理系統(tǒng)檢測各組大鼠坐骨神經MNCV。刺激參數如下：頻率l Hz、強度10 mA、時間0.1 ms。麻醉大鼠，顯露、分離坐骨神經至其分為腓總神經和脛神經處。于ANA兩端分別放置鉤形銀針電極，近端施加刺激、遠端進行記錄，最后采用游標卡尺（精度為0.2 mm）測量2個電極之間的距離，依據MNCV（m/s）=兩電極之間距離（mm）/動作電位潛伏期的差值（ms），計算各組大鼠坐骨神經MNCV。

1.5 脛前肌濕重比率計算

麻醉大鼠，灌注取材。切開大鼠小腿后緣皮膚，從跟骨結節(jié)游離至股骨內、外髁處，取下完整的脛前肌。將同一只大鼠健側和患側脛前肌分別放于分析天平上稱量，根據脛前肌濕重比率=患側脛前肌質量/健側脛前肌質量，計算各組大鼠脛前肌濕重比率。

1.6 尼氏染色觀察脊髓前角運動神經元的形態(tài)結構

取各組大鼠L4～6脊髓，脫水處理后行OCT包埋，制成厚度約40 μm的冰凍切片。依次經梯度乙醇水化后放入尼氏染色液中浸染25 min，再經過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，于鏡下觀察并采集圖像。應用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對每個視野下著色尼氏體進行計數。每個脊髓組織隨機選取3張切片，每張切片隨機選擇3個視野，取平均值。

1.7 檢測脊髓內BDNF和p-Akt1蛋白的表達

1.7.1 免疫熒光染色：取各組大鼠L4～6脊髓組織進行切片（處理同1.6）。切片經0.01 mol/L PBS洗滌3次，10 min/次，應用0.2% Triton-100透膜處理25 min，再經0.01 mol/L PBS 洗滌3次，10 min/次，滴加山羊血清，于37℃恒溫水浴箱內封閉1 h，甩去血清，分別加入兔抗BDNF抗體（1 ∶200）和兔抗p-Akt1抗體（1 ∶100），4 ℃冰箱孵育過夜。第2天，取出切片復溫后，先用0.01 mol/L PBS 洗滌3次，10 min/次，后滴加Cy3標記的山羊抗兔IgG（1 ∶400），37 ℃恒溫水浴箱內孵育1 h，0.01 mol/L PBS 洗滌3次，10 min/次，應用熒光防淬滅劑封片，置于熒光顯微鏡下觀察、采集圖像。

1.7.2 Western blotting：采用RIPA蛋白裂解液提取各組大鼠L4～6脊髓組織蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，配置40 μg上樣體系，經電泳、轉膜、封閉后加入兔抗BDNF（1∶1 000）、兔抗Akt1（1∶1 000）、兔抗p-Akt1（1∶1 000）、兔抗ACTB（1∶10 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，時間為15、10、10 min。加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（1∶8 000），室溫孵育1 h，經TBST漂洗3次，10 min/次。ECL發(fā)光，用Tanon-6100全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，以目的蛋白條帶與標準蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用 GraphPad Prism5軟件對數據行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，各組間比較采用單因素方差分析，進一步2組間比較應用Bonferroni-t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài)

除N 組外，其他4組大鼠術后患肢均出現嚴重的運動障礙，并出現舔舐、懸空等肢體保護動作，患肢無嚴重感染，個別出現潰爛、缺趾等現象。M組大鼠患肢運動障礙至4周時仍未改善，跛行嚴重；ANA組大鼠患肢運動障礙逐漸恢復，步態(tài)明顯好于M組；LY組大鼠患肢運動障礙改善不明顯。

2.2 坐骨神經MNCV

N組大鼠坐骨神經MNCV ［（50.29±3.564）m/s］明顯高于ANA組［（35.99±2.191）m/s］、LY組［（23.49±2.219）m/s］和LYC組［（32.13±2.832）m/s］（P＜ 0.05）；與ANA組比較，LY組大鼠坐骨神經MNCV明顯降低（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 ANA增加大鼠坐骨神經MNCVFig.1 ANA increased the MNCV of sciatic nerve in rats

2.3 脛前肌濕重比率

M組、ANA組、LY組和LYC組脛前肌濕重比率分別為0.187 2±0.026 30、0.331 6±0.067 28、0.249 7±0.017 89、0.366 2±0.050 94，差異有統(tǒng)計學意義（F=19.25，P＜ 0.05）；Bonferroni-t檢驗結果顯示，ANA組脛前肌濕重比率明顯高于M組（P＜ 0.05），LY組脛前肌濕重比率低于ANA組（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 ANA促進大鼠脛前肌濕重比率提高Fig.2 ANA promoted the wet weight ratio of the anterior tibia muscles of rats in each group

2.4 脊髓前角運動神經元形態(tài)結構

尼氏染色結果顯示，脊髓前角運動神經元中的尼氏體呈虎斑狀、藍紫色。M組大鼠脊髓前角運動神經元胞體腫脹，尼氏體溶解、形態(tài)結構不完整，虎斑狀結構少見，染色較淺且不均勻；ANA組具有斑塊狀結構的尼氏體清晰可見，尼氏體著色較深且均勻，胞核多居于中央，偶見核移位現象；LY組尼氏體結構模糊、不完整，染色深淺不一。Image Pro Plus 6.0圖像分析結果顯示，ANA組尼氏體數量明顯多于M組（P＜ 0.05），LY組尼氏體數量顯著低于ANA組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠脊髓前角運動神經元尼氏染色結果 ×400Fig.3 Nissl staining of motor neurons in the anterior horn of the spinal cord of rats in each group ×400

2.5 脊髓內BDNF和p-Akt1蛋白的表達

免疫熒光染色可見各組大鼠脊髓內BDNF和p-Akt1蛋白均被標記為紅色熒光，陽性產物主要位于脊髓前角運動神經元的細胞質。Western blotting半定量分析結果顯示，M組BDNF和p-Akt1蛋白的表達水平明顯低于N組（P＜ 0.05），ANA組顯著高于M組（P＜ 0.05），LY組顯著低于ANA組（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 ANA增強大鼠脊髓內BDNF和p-Akt1蛋白的表達Fig.4 ANA enhance the expression of BDNF and p-Akt1 protein of spinal cord of rats

3 討論

PNI后的再生和修復是一個緩慢且復雜的過程。電生理檢測是判斷神經損傷程度及評估神經功能恢復情況的客觀指標［11］。神經纖維具有興奮性和傳導性，當神經損傷后，其傳導性也會受到嚴重的影響，因此神經傳導速度可準確反映周圍神經的功能狀態(tài)［12］。本研究結果顯示，ANA組MNCV明顯高于M組，說明ANA起到了較好的橋接作用，使損傷部位的軸索得到了恢復，神經沖動得以傳導。脛前肌是坐骨神經運動纖維支配的重要靶器官，其濕重比率增高也表明坐骨神經功能得到了改善。研究［13］顯示，PNI后約1/3的患者存在肌肉萎縮和肌無力現象。SHIMADA等［14］發(fā)現抑制局部M1巨噬細胞的浸潤可改善神經損傷所致肌肉萎縮，有助于神經功能的恢復。本研究結果顯示，ANA組脛前肌濕重比率明顯升高，表明ANA組坐骨神經功能得到了明顯改善。分析其原因可能是在ANA所建立的再生通道下，神經的連續(xù)性得以恢復，從而維持了坐骨神經對脛前肌的營養(yǎng)支持，因此脛前肌的濕重比率明顯增加。

神經再生的前提條件是存在可行使再生功能的胞體，因此脊髓前角運動神經元的形態(tài)結構、數量以及功能狀態(tài)是影響神經再生的重要因素。神經元內的尼氏體是一種特異性的嗜色質，主要由平行排列的糙面內質網構成，其間散在游離的核糖體，光學顯微鏡下觀察似“虎斑狀”。神經元內尼氏體的形態(tài)結構越完整、數量越多，提示神經元中蛋白質的合成功能越活躍［15］。FEI等［16］發(fā)現，面神經損傷后運動核內尼氏體明顯減少，經電針治療后尼氏體數量明顯增加，面神經的功能也逐步恢復。本研究中，尼氏染色顯示坐骨神經損傷大鼠患側脊髓前角外側核中運動神經元發(fā)生了退行性變化，不僅神經元數目減少，尼氏體結構也變得模糊、甚至溶解/消失。經ANA處理后，神經元的形態(tài)結構逐漸恢復，尼氏體數量增多，虎斑小體清晰可見。提示ANA的橋接不僅起搭建再生通道的作用，還恢復了軸漿流動，使由靶組織所產生的神經營養(yǎng)因子可逆行運輸到神經元胞體，從而減弱了神經元的壞死或凋亡。

研究［17-18］表明，BDNF與其受體TrkB結合后，可發(fā)揮促進髓鞘再生以及運動和感覺功能恢復等作用。PI3K是一種膜蛋白，活化后使其下游因子Akt發(fā)生磷酸化，參與調控細胞的增殖、自噬、凋亡等多種病理生理過程［19］。YIN等［20］研究揭示BDNF表達增加的同時，PI3K/Akt信號通路的生物活性也增強，導致坐骨神經橫斷小鼠感覺和運動功能顯著改善。另有研究［21］顯示，益母草總堿通過上調BDNF表達水平而調控PI3K/Akt通路，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經保護作用。王秀敏等［22］發(fā)現，PI3K/Akt信號通路抑制劑可使BDNF合成減少，而該通路激動劑則可提高BDNF、p-Akt表達水平。本研究采用Western blotting和免疫熒光染色檢測了脊髓內BDNF和p-Akt1蛋白的表達情況，發(fā)現ANA組脊髓內不僅BDNF表達升高，p-Akt1蛋白表達也呈上升趨勢，提示表達升高的BDNF可能激活了PI3K/Akt信號通路。為了驗證這一假說是否成立，本研究設置了LY組，即在ANA橋接術后腹腔注射PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002，結果發(fā)現LY組BDNF表達低于ANA組，且p-Akt1蛋白表達呈下降趨勢。同時還發(fā)現LY組MNCV和脛前肌濕重比率明顯低于ANA組，且脊髓前角外側核中神經元的形態(tài)結構恢復及神經功能恢復也落后于ANA組。因此，推測高表達的BDNF可能部分地通過PI3K/Akt信號轉導通路發(fā)揮了促進神經再生修復的作用。其機制可能為增加的BDNF與跨膜受體TrkB結合，使后者發(fā)生磷酸化，募集并激活PI3K，活化的PI3K進一步激活下游Akt，使其轉化為p-Akt，繼續(xù)激活下游的Bcl-2、Bax、NF-κB、mTOR等多種靶點分子，從而發(fā)揮促進損傷神經再生和修復的作用，但其具體機制有待進一步深入研究。