盧波斯，崔丹丹，沈宏

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642）

甲殼素是世界上第二大天然可再生資源，廣泛存在于節(jié)肢類動(dòng)物如貝殼、蝦、蟹和昆蟲殼、真菌及藻類細(xì)胞壁中[1]。殼聚糖是甲殼素脫去部分乙?；蟮漠a(chǎn)物，是由少量N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖之間通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的大分子多糖[2]。殼聚糖因其具有抑菌、抗病毒、抗癌等良好的生物活性及其優(yōu)良的生物相容性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域[3]，殼聚糖同時(shí)也被認(rèn)為是繼軟磷脂和螺旋藻之后的第三代保健品[4]。然而，殼聚糖因C2位連接有氨基基團(tuán)導(dǎo)致其只能溶解于部分酸溶液中，如醋酸、鹽酸、乳酸和檸檬酸等[5]，且其分子量較大不易被生物所吸收，極大的限制了其應(yīng)用范圍[6]。

殼寡糖（Chitosan Oligosaccharide，COS）是殼聚糖的水解產(chǎn)物，一般聚合度為2~10[7]，也是目前自然界中唯一帶正電荷的低聚糖[8]，與殼聚糖相比，殼寡糖具有更好的水溶性及生物活性。谷新晰等[9]發(fā)現(xiàn)在泡菜發(fā)酵時(shí)添加適宜濃度的殼寡糖有利于泡菜中總酸和氨基酸提高，同時(shí)，對(duì)泡菜中的菌群結(jié)構(gòu)和多樣性均具有顯著改變。王曉杰等[10]發(fā)現(xiàn)殼寡糖-糖基化的玉米醇溶蛋白具有更好的抗氧化性能，還可以顯著促進(jìn)小鼠體內(nèi)酒精代謝[11]。莊林等[12]發(fā)現(xiàn)添加殼寡糖的復(fù)合固體飲料能顯著降低小鼠高尿酸血癥。殼寡糖在動(dòng)物飼料領(lǐng)域也具有應(yīng)用價(jià)值，何孟蓮等[13]發(fā)現(xiàn)在泌乳中期奶牛的飼料中添加200 mg/kg的殼寡糖可以顯著降低奶牛血清中一氧化氮濃度。殼寡糖同樣具有良好的抗氧化和抑菌活性，因其水溶液具有成膜性[14]，將其噴灑在水果或者食品上形成透明的保鮮薄膜可以有效延長(zhǎng)食品貯藏期，趙倩等[15]發(fā)現(xiàn)低濃度的殼寡糖與乳酸菌共發(fā)酵的產(chǎn)物表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌顯著的抑制效果。因殼寡糖在食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力巨大，美國(guó)食品藥品監(jiān)督局和我國(guó)已經(jīng)相繼批準(zhǔn)殼寡糖安全無(wú)毒，可以作為食品添加劑使用。

殼聚糖酶（EC.3.2.1.132）可以專一高效的催化水解殼聚糖的β-1,4-糖苷鍵[16]，其主要來(lái)源于真菌和部分細(xì)菌，在某些病毒及植物中也能檢測(cè)到殼聚糖酶活性[17]?；瘜W(xué)法、物理法、生物酶解法均能制備殼寡糖，但酶法制備殼寡糖具有反應(yīng)效率高、條件可控、無(wú)環(huán)境污染等優(yōu)勢(shì)[18]。此外，殼聚糖酶還可以直接應(yīng)用于病原真菌的生物防治[19-21]，是一種多功能酶制劑，但目前市面上的殼聚糖酶存在價(jià)格昂貴、酶活性不穩(wěn)定、酸性條件下半衰期短[22]等問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室從海洋高鹽極端環(huán)境中篩選到一株高產(chǎn)殼聚糖酶菌株Mitsuariasp.SH-50，該菌株產(chǎn)酶速度遠(yuǎn)高于其他殼聚糖酶產(chǎn)生菌，且酶活性相對(duì)較高，因此本文對(duì)其殼聚糖酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)表征，旨在為殼聚糖酶的相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Mitsuariasp.SH-50菌株，本實(shí)驗(yàn)室前期分離得到，保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根層調(diào)控實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱；膠體殼聚糖（脫乙酰度≥85%），青島博智匯力生物科技有限公司；酵母提取物，賽默飛世爾科技公司；氨基葡萄糖鹽酸鹽（分析純），上海阿拉丁生化科技股份公司；蛋白 Marker，生工生物工程股份有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephadex G-75，REBIO有限公司；透析袋70 mm（MD77）[Mw：14 000]，廣州市叢源儀器有限公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

活化培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖5.0，硫酸鎂1.0，磷酸二氫鉀0.5，磷酸氫二鉀0.5，酵母提取物0.5，氯化鈉5.0，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖10.0，硫酸鎂1.0，磷酸二氫鉀1.0，磷酸氫二鉀1.0，酵母提取物0.5，氯化鈉5.0，pH值6.5。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本Shimadzu有限公司；Basic 200凝膠電泳儀，廣州四億科學(xué)儀器有限公司；BJ-1CD超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)公司；AKTA FPLC，美國(guó)GE Healthcare Life Science公司；NDJ-1型粘度計(jì)，上海精米科學(xué)儀器有限公司；HC-3618R高速離心機(jī)，中科中佳科學(xué)儀器有限公司；TH-300梯度混合儀，上海青浦滬西有限公司；HWS-5A恒溫水浴鍋，上海百典儀器設(shè)備有限公司；Biotech-5JGH發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 粗酶液的制備

取-80 ℃保藏的SH-50菌液1 mL接種于含活化培養(yǎng)基50/150 mL的三角瓶中，30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.5 mL的上述活化菌液，100/250 mL 三角瓶發(fā)酵12 h，在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min。上清液即為粗酶液。

1.4 殼聚糖酶活力的測(cè)定

采用 3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定粗酶液的酶活[23]。取900 μL 1%（m/m）膠體殼聚糖溶液和1 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH值5.0）于25 mL比色管中，混勻后加入100 μL酶液，在75 ℃下恒溫反應(yīng)10 min后迅速加入1.5 mL DNS溶液，冷卻至室溫后沸水浴5 min，加蒸餾水定容至25 mL；8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液在540 nm處比色測(cè)定酶活。

殼聚糖酶活定義[24]：最適條件下，1 mL酶液在1 min內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U/mL）。

1.5 CsnSH50的分離純化

1.5.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

在磁力攪拌條件下，向粗酶液中緩慢添加硫酸銨晶體，待其完全溶解，使硫酸銨飽和濃度分別在0~30%、30%~50%、50%~70%、70%~90%時(shí)，8 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，收集沉淀。將收集到的沉淀置于pH值7.0、20 mmol/L的磷酸緩沖溶液中完全溶解，使用透析袋在4 ℃透析36 h，并測(cè)定酶活。

1.5.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱層析

將硫酸銨沉淀分離出來(lái)的殼聚糖酶通過(guò)陰離子交換柱層析進(jìn)一步純化，選用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱（2.6 cm×20 cm），用20 mmol/L的pH值7.5 Tris-HCl緩沖液充分平衡，過(guò)夜，取8 mL經(jīng)硫酸銨純化后的CsnSH50酶液入柱，使用同樣的pH值7.5 Tris-HCl緩沖液洗脫至曲線平緩，再用0~1.0 mol/L氯化鈉的緩沖溶液進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，每管收集5 mL，收集每個(gè)洗脫峰，在280 nm處用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)并測(cè)定酶活，繪制洗脫曲線。

1.5.3 Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析

準(zhǔn)確稱取20 g Sephadex G-75，加400 mL雙蒸水100 ℃煮沸3 h，冷卻至室溫后抽真空20 min排除氣泡，沉降后以傾斜法除去上層顆粒，裝柱（1.6 cm×60 cm）后用20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH值7.5）平衡過(guò)夜。上樣1.0~1.5 mL，流速0.8 mL/min，每管收集2 mL。根據(jù)每管的殼聚糖酶活力和蛋白質(zhì)曲線，選擇純度高的收集液于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.5.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

通過(guò)SDS-PAGE對(duì)收集的酶液純度進(jìn)行分析，采用m=4%的濃縮膠和m=12%的分離膠測(cè)定其分子量[25]。

1.6 殼聚糖酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度

取純化后的殼聚糖酶液用20 mmol/L，用pH值7.0的磷酸緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)后，在（20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃）條件下測(cè)定殼聚糖酶活性，以最高活力為 100%計(jì)算相對(duì)酶活性，確定殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度。

1.6.2 殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH

取純化后的殼聚糖酶液用20 mmol/L，用pH值7.0的磷酸緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)后，取少量酶液與不同 pH 值（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的膠體殼聚糖反應(yīng)，以測(cè)定酶活力，以最高活力為 100%計(jì)算相對(duì)酶活性，確定殼聚糖酶的最適反應(yīng)pH。

1.6.3 殼聚糖酶的溫度及pH穩(wěn)定性

取純化后的殼聚糖酶液用20 mmol/L，用pH值7.0的磷酸緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)后，將其置于不同溫度（30、40、50、60 ℃）恒溫水浴鍋中保溫一定時(shí)間后，測(cè)定剩余酶活性。取少量純化的殼聚糖酶液，用不同pH值（2.5、4.5、6.5、8.5、10.0）的緩沖溶液稀釋一定倍數(shù)酶液，冰水浴一定時(shí)間，測(cè)定剩余酶活性。

1.6.4 CsnSH50的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

用pH值5.0，20 mmol/L的磷酸緩沖溶液溶解膠體殼聚糖，配制成終濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的殼聚糖溶液，取上述殼聚糖溶液900 μL，75 ℃恒溫水浴，加入100 μL稀釋200倍的CsnSH50酶液，反應(yīng)2 min后加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)。測(cè)定不同底物濃度的反應(yīng)速度。用 Lineweaver-Burk制圖法繪制雙倒數(shù)曲線，求出CsnSH50的Vmax和Km值。

1.6.5 金屬離子對(duì)CsnSH50酶活性的影響

分別向殼聚糖酶液中添加不同終濃度（1、5、10 mmol/L）的金屬鹽 ZnCl2、MgCl2、FeCl3、AlCl3、CaCl2、CuCl2、KCl、NaCl、BaCl2、MnCl2、CoCl2、AgNO3，冰水浴條件下攪拌至金屬鹽完全溶解，靜置30 min后，在pH值4.5，75 ℃條件下，測(cè)定酶活力，以不添加金屬鹽的反應(yīng)體系為對(duì)照，計(jì)算相對(duì)酶活性。

1.7 CsnSH50水解殼聚糖產(chǎn)物的薄層層析（TLC）分析

采用硅膠薄層層析（TLC）分析CsnSH50水解殼聚糖的產(chǎn)物組成。將1%（m/m）的膠體殼聚糖底物緩慢升溫至 75 ℃恒溫?cái)嚢?，后加入少量殼聚糖酶CsnSH50，分別于30、60、90、180 min時(shí)取樣，沸水浴5 min后，8 000 r/min離心10 min。用毛細(xì)管取樣滴于硅膠板上，吹干后置于展開劑（異丙醇:氨水=2:1，V/V）中緩慢展開。待展開劑鋪滿硅膠板后，取出吹干，均勻噴灑1%（m/m）的茚三酮溶液，于110 ℃放置5 min顯色。

1.8 CsnSH50水解殼聚糖產(chǎn)物質(zhì)譜（ESI-MS）分析

采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS）進(jìn)一步分析CsnSH50水解殼聚糖的產(chǎn)物分布，將1%（m/m）膠體殼聚糖水解后的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，條件設(shè)置為：正離子模式，分子量范圍為50~2 000 (m/z)，電壓3.5 kV，溫度180 ℃。

1.9 CsnSH50制備殼寡糖

1.9.1 小試放大試驗(yàn)制備殼寡糖

向5 L發(fā)酵罐中添加膠體殼聚糖粉末200 g，補(bǔ)水至4 L，邊攪拌邊加入冰醋酸調(diào)節(jié)初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5），逐步升溫至75 ℃待底物完全溶脹，添加CsnSH50酶液，反應(yīng)120 min，CsnSH50的添加量為12.5 U/g，持續(xù)反應(yīng)90 min后每10 min取少量反應(yīng)液滴加2 mol/L的NaOH溶液，觀察是否有白色懸浮物，無(wú)沉淀即為反應(yīng)終點(diǎn)。

1.9.2 殼寡糖含量及平均聚合度的測(cè)定

配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的氨基葡萄糖鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，540 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用DNS法測(cè)定降解產(chǎn)物中殼寡糖的濃度并計(jì)算產(chǎn)率。取1 mL殼寡糖溶液于具塞試管中，置于冰水浴中，緩慢加入4 mL濃硫酸，搖勻，在90 ℃反應(yīng)2 h，冷卻后定容至100 mL，用10 mol/L的NaOH溶液中和至中性，定容至25 mL，取2 mL殼寡糖溶液加入 1.5 mL DNS試劑，沸水浴中加熱5 min，冷卻后定容至25 mL，540 nm下測(cè)定吸光度值。結(jié)果計(jì)算：

式中：

W——?dú)す烟呛康馁|(zhì)量百分?jǐn)?shù)，%；

m——由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的鹽酸氨基葡萄糖的質(zhì)量，mg；

f——測(cè)定過(guò)程中樣品溶液稀釋倍數(shù)；

M——每毫升殼寡糖溶液中殼寡糖樣品的質(zhì)量，mg；

0.994 ——單糖折成多糖的系數(shù)。

平均聚合度采用乙酰丙酮分光光度法[26]。

1.10 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)均在自然條件下重復(fù)3次，采用 SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's檢驗(yàn)計(jì)算差異顯著性，p＜0.05為顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 CsnSH50的分離純化

2.1.1 硫酸銨分級(jí)沉淀

微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌大量胞外蛋白，硫酸銨分級(jí)沉淀可以去除粗酶液中的一些雜蛋白[27]，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的初步純化。硫酸銨分級(jí)沉淀提取CsnSH50的結(jié)果見表1，當(dāng)硫酸銨飽和濃度低于30%時(shí)，沉淀中有少量蛋白析出，但幾乎檢測(cè)不到殼聚糖酶活性。在30%~50%硫酸銨濃度范圍內(nèi)，沉淀中有少量殼聚糖酶析出，在硫酸銨飽和濃度50%~70%之間，存在大量殼聚糖酶析出，且雜蛋白相對(duì)較少。經(jīng)透析后測(cè)定，比酶活力為2 833.40 U/mg。因此，選用硫酸銨飽和濃度在50%~70%范圍沉淀粗酶液，此條件下的目標(biāo)蛋白純化倍數(shù)為2.27倍。

表1 不同硫酸銨飽和濃度對(duì)CsnSH50鹽析影響Table 1 Influence of different saturation concentrations of ammonium sulfate on salting out of CsnSH50

2.1.2 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱

用硫酸銨沉淀透析初步提純粗酶液中的目標(biāo)蛋白后，采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進(jìn)一步進(jìn)行分離，洗脫曲線如圖1所示。在NaCl濃度為0.37 mol/L和0.68 mol/L時(shí)有兩個(gè)峰被洗脫，第一個(gè)洗脫峰的殼聚糖酶活性可忽略不計(jì)，第二個(gè)洗脫峰表現(xiàn)出明顯的殼聚糖酶活性，對(duì)應(yīng)的29~38號(hào)管殼聚糖酶活性較高。因此，將活性組分進(jìn)行 Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析。為336.20 U/mg的重組酶；王杉杉[31]通過(guò)基因克隆得到產(chǎn)酶活性為1 500 U/mL的工程菌。表2為CsnSH50提純工藝概要，與粗酶液相比，通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Fast Flow、Sephadex G-75層析純化后的CsnSH50比酶活力為7 462.50 U/mg，回收率為6.62%，純化倍數(shù)為5.99。

圖1 CsnSH50的離子交換柱層析Fig.1 Ion exchange column chromatography of CsnSH50

表2 CsnSH50純化結(jié)果Table 2 Purification results of CsnSH50

2.1.3 Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析

將離子交換柱層析的殼聚糖酶樣品收集后，使用Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖2所示。樣品分離后得到兩個(gè)較為明顯的洗脫峰，第一個(gè)洗脫峰檢測(cè)不到明顯的殼聚糖酶活性，第二個(gè)洗脫峰具有較高的殼聚糖酶活性，將收集純化的殼聚糖酶命名為CsnSH50。

圖2 CsnSH50的凝膠過(guò)濾層析Fig.2 Gel filtration chromatography of CsnSH50

已有報(bào)道的高產(chǎn)殼聚糖酶菌株有Renibacteriumsp.QD1，Bacillussp.KCTC0377BP，比酶活力分別為1 575 U/mg[28]和1 700 U/mg[29]。重組殼聚糖酶中，Guo等[30]通過(guò)大腸桿菌超表達(dá)殼聚糖酶基因得到了酶活

2.2 SDS-PAGE

大多數(shù)細(xì)菌產(chǎn)的殼聚糖酶分子量范圍在20~75 ku，只有少數(shù)高分子量殼聚糖酶，來(lái)自Penicilliumsp.ZD-Z1的殼聚糖酶的分子量為115 ku[32]。將經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析收集到的殼聚糖酶溶液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，分析結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀后的凝膠電泳條帶明顯得到了初步純化，但目標(biāo)蛋白顏色較淡，有少許雜蛋白條帶，經(jīng)過(guò)離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析收集到的酶液顯示為明亮單一蛋白條帶，與Marker中相對(duì)應(yīng)蛋白分子量進(jìn)行比較，CsnSH50的分子量在41 ku左右。

圖3 CsnSH50的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.3 SDS-PAGE of CsnSH50

2.3 溫度對(duì)CsnSH50的影響及溫度穩(wěn)定性

溫度是酶活性最重要的指標(biāo)之一，大多數(shù)報(bào)道的殼聚糖酶是不耐熱的，熱穩(wěn)定較好的殼聚糖酶較少，高溫條件下，反應(yīng)進(jìn)程加快，殼聚糖溶液的粘度下降，雜菌污染率低，產(chǎn)品純度更高[33]。已有報(bào)道中，反應(yīng)溫度相對(duì)較高的有Streptomyces roseolusDH[34]和Penicilliumsp.D-1[35]來(lái)源的殼聚糖酶，最適反應(yīng)溫度分別為50 ℃和48 ℃。由圖4a可知，CsnSH50的酶活性在一定范圍內(nèi)隨著溫度升高逐漸升高，酶活性在75 ℃時(shí)達(dá)到峰值，之后隨溫度繼續(xù)升高，酶活性迅速下降，這可能與溫度過(guò)高酶蛋白變性有關(guān)。由圖4b可知，CsnSH50在50 ℃以下具有較好的溫度穩(wěn)定性，50 ℃時(shí)CsnSH50的酶活性開始隨著時(shí)間逐步下降。CsnSH50最適溫度為75 ℃，證明其是一種嗜熱性殼聚糖酶，且CsnSH50具備良好的熱穩(wěn)定性，更易儲(chǔ)存。

2.4 pH值對(duì)CsnSH50的影響及pH值穩(wěn)定性

pH值不僅影響蛋白的溶解性，還會(huì)影響酶活性中心必需基團(tuán)的解離狀態(tài)，過(guò)酸或過(guò)堿均會(huì)改變酶的空間結(jié)構(gòu)從而改變酶蛋白的構(gòu)象[36]。殼聚糖酶在水解殼聚糖時(shí)的解離pH值在3.5左右，但大多數(shù)殼聚糖酶在酸性條件下半衰期較短。由圖5a可知，CsnSH50在pH值3.0~7.0范圍內(nèi)具有較好的酶活性，pH值＞7.0時(shí)，隨pH值升高，CsnSH50的酶活性逐漸下降，這可能是因?yàn)閜H值較高時(shí)殼聚糖的溶解性下降導(dǎo)致的。由圖5b可知，CsnSH50在pH值2.5~8.5之間較穩(wěn)定，120 min后相對(duì)酶活性依然在80%以上。這些結(jié)果表明，CsnSH50能較長(zhǎng)時(shí)間適應(yīng)寬范圍的pH值變動(dòng)，且活性不受太大影響，具有很好的工業(yè)化應(yīng)用能力。

圖5 CsnSH50的最適pH（a）及pH穩(wěn)定性（b）Fig.5 Optimum pH (a) and pH stability (b) of CsnSH50

2.5 CsnSH50的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

將純化后的CsnSH50稀釋200倍，在75 ℃和pH值4.5條件下，以1、2、4、6、8、10 mg/mL的膠體殼聚糖（脫乙酰度≥85）作為反應(yīng)底物，分別測(cè)定CsnSH50的酶活性，以底物濃度的倒數(shù)和反應(yīng)速率的倒數(shù)為X、Y軸繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線。線性回歸方程為y=0.058x+0.034（R2=0.999 2），該曲線擬合較好，經(jīng)過(guò)計(jì)算得到CsnSH50的Vmax=29.41 U/mL，Km=1.71 mg/mL。不同酶的Km存在一定差異，同時(shí)Km值越小表明酶與底物的親和度越高。

圖6 CsnSH50的酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fig.6 Kinetic parameters of CsnSH50

2.6 不同金屬離子對(duì)CsnSH50的影響

不同的金屬離子可能會(huì)影響酶蛋白的中心構(gòu)象，從而影響酶活性。已有報(bào)道中，大多數(shù)殼聚糖酶受到Cu2+和Fe3+的抑制，受到Mn2+的正向激活作用[37]。本文分別比較了 1、5、10 mmol/L的不同金屬離子對(duì)CsnSH50酶活性的影響，結(jié)果如圖7所示。Ca2+、Cu2+、Fe3+、K+、Mn2+表現(xiàn)出較強(qiáng)的正向激活作用，Zn2+、Mg2+、Ba2+、Ag+對(duì)CsnSH50酶活性影響不大，Al3+、Co2+則表現(xiàn)出抑制作用。1 mmol/L的K+表現(xiàn)出正向激活作用，但隨著K+濃度的逐漸升高，反而會(huì)逐漸抑制酶活性。值得注意的是，尚未見到10 mmol/L的Mn2+對(duì)殼聚糖酶正向激活作用達(dá)到412%的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。這些結(jié)果表明，CsnSH50的酶活性容易受到金屬離子的影響，且其效果與金屬離子的濃度密不可分，同時(shí)也說(shuō)明CsnSH50極有可能是一種新型殼聚糖酶。

圖7 不同金屬離子對(duì)CsnSH50活性的影響Fig.7 Effects of different metal ions on the activity of CsnSH50

2.7 CsnSH50水解殼聚糖的產(chǎn)物分析

利用薄層層析色譜法（TLC）和電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI-MS）分析CsnSH50水解殼聚糖產(chǎn)物中的寡糖分布，結(jié)果如圖8所示。由圖8a可知，降解30 min時(shí)，產(chǎn)物中主要是二糖、三糖、四糖和五糖，隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，五糖逐漸增加，隨后被降解成二糖和三糖；當(dāng)降解時(shí)間為180 min時(shí)，主要產(chǎn)物是二糖、三糖、四糖，無(wú)單糖產(chǎn)生。電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）結(jié)果顯示，361m/z、521m/z、682m/z處分別代表不飽和二糖、三糖、四糖（圖8b），這與薄層層析結(jié)果一致。由此可以看出，CsnSH50通過(guò)內(nèi)切的方式作用于底物，是一種內(nèi)切酶。

圖8 CsnSH50水解膠體殼聚糖的產(chǎn)物分析Fig.8 Product analysis of CsnSH50 hydrolyzed colloidal chitosan

2.8 CsnSH50制備殼寡糖

當(dāng)殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò) 5%時(shí)，其粘度往往超過(guò)800 mPa·s，因此利用殼聚糖酶工業(yè)化制備殼寡糖時(shí)應(yīng)不高于該值。殼聚糖在水解時(shí)會(huì)導(dǎo)致體系的pH值逐漸升高，不利于反應(yīng)，且反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致殼聚糖酶逐漸失活。因此根據(jù)CsnSH50的最適反應(yīng)pH值范圍調(diào)節(jié)反應(yīng)底物的初始pH值，選用120 min作為反應(yīng)時(shí)間。小試放大試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，處理2的反應(yīng)初始pH值為3.5，反應(yīng)120 min，產(chǎn)物最終pH值為5.5，殼寡糖產(chǎn)率達(dá)到92.1%，較其他處理具有顯著性差異，產(chǎn)物中的灰分率較處理1無(wú)顯著差異，但產(chǎn)物的平均聚合度為10.20，達(dá)到顯著性差異。因此，利用CsnSH50規(guī)模化制備殼寡糖時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)初始pH值為3.5左右。

表3 不同初始pH值對(duì)殼寡糖產(chǎn)物的影響Table 3 Effects of different initial pH on chitosan oligosaccharide products

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Mitsuariasp.SH-50所產(chǎn)的殼聚糖酶粗酶液，經(jīng) 50%~70%硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠過(guò)濾層析，純化后的CsnSH50比酶活力為7 462.50 U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到5.99，回收率6.62%。殼聚糖酶CsnSH50的分子量約為41 ku，最適反應(yīng)溫度為75 ℃，最適pH值為4.5，在pH值2.5~8.5及50 ℃下穩(wěn)定性較好。最適條件下，稀釋200倍后的CsnSH50的Vmax=29.41 U/mL，米式常數(shù)Km=1.71 mg/mL。Ca2+、K+、Cu2+、Fe3+、Mn2+均表現(xiàn)出對(duì)CsnSH50的較強(qiáng)正向激活作用，10 mmol/L的Mn2+對(duì)CsnSH50酶活性的增強(qiáng)作用達(dá)到412%。CsnSH50水解殼聚糖產(chǎn)物中無(wú)單糖產(chǎn)生，表明CsnSH50是一種內(nèi)切型殼聚糖酶。制備4 L含5%殼寡糖溶液時(shí)，用冰醋酸調(diào)節(jié)初始pH值為3.5，CsnSH50添加量為12.5 U/g，水解120 min，寡糖產(chǎn)率可達(dá)90%以上，產(chǎn)物平均聚合度為10.2。