顧力行，王斌，潘力

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）也被稱作胞壁質(zhì)因細胞壁裂解而死亡[1,2]，最早由弗萊明在普通感冒酶（Muramidase），能夠?qū)ざ嗵撬鉃樘请模辜毦∪说谋翘檎骋褐邪l(fā)現(xiàn)，并命名為溶菌酶[3]。溶菌酶是一種天然的、性能安全良好的殺菌劑，具有消炎、殺菌、抗病毒等功效，在食品安全、生物醫(yī)藥、飼料制造等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[4-6]。溶菌酶可以被分類為多個糖苷水解酶家族（GH），例如雞蛋清溶菌酶屬于GH22家族，鵝蛋清溶菌酶屬于GH23家族，噬菌體T4溶菌酶屬于GH24家族等（詳情可參看CAZy數(shù)據(jù)庫：http://www.cazy.org/）[7,8]。GH25家族溶菌酶主要存在于微生物中，具有多種功能，例如在細胞分裂期間重塑細菌細胞壁，在噬菌體生命周期結(jié)束時溶解細菌細胞壁，以及在古細菌和真核生物中存在抗菌作用[9-11]。這一系列許多溶菌酶的編碼基因包括了分泌信號肽，所以大多數(shù)溶菌酶可分泌到胞外。目前數(shù)據(jù)庫中共有超過10 000個GH25家族溶菌酶序列，絕大多數(shù)是細菌來源的，只有極少數(shù)來自真核生物[12-15]。

嗜堿頂孢霉（Acremonium alcalophilum，又稱Sodiomyces alcalophilus）是一種最早由日本研究人員從自然環(huán)境中分離出[16]的生長在堿性環(huán)境中的真菌。其基因組序列存在大量編碼生物質(zhì)降解酶的基因，例如脂肪酶、木質(zhì)纖維素酶、溶菌酶等。嗜堿頂孢霉編碼表達的GH25溶菌酶可以有效地降解微生物細胞壁中的肽聚糖，在動物實驗上被證明沒有毒性，動物無不良反應(yīng)，沒有皮膚和眼睛刺激性，可被天然降解[17-20]。根據(jù)測試，該溶菌酶有很好的胃蛋白酶穩(wěn)定性，而目前市面上主要出售的雞蛋清溶菌酶則容易被胃蛋白酶降解。該酶能夠分解腸道中堵塞絨毛的肽聚糖，增加腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，被廣泛應(yīng)用于飼料領(lǐng)域。由于其抗菌譜相比雞蛋清溶菌酶較窄，無生物毒性，所以在提升飼料利用率的同時不會破壞正常的腸道菌群[17]。

黑曲霉（A.niger）作為典型的絲狀真菌，胞外蛋白分泌能力十分優(yōu)秀，且擁有發(fā)酵成本低、菌株能自我修飾翻譯后的蛋白等優(yōu)點，能被用作外源蛋白表達宿主[21-23]。黑曲霉相比大腸桿菌擁有更完備的蛋白分泌和修飾能力，相比甲醇誘導(dǎo)酵母則更具有安全性[24]。黑曲霉是一種安全生產(chǎn)菌株，在實際生產(chǎn)活動中也被用來生產(chǎn)酶制劑[25]。黑曲霉的傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)效率較低，是限制黑曲霉表達技術(shù)發(fā)展的一個重要因素。

近年來，新出現(xiàn)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)得到了進一步發(fā)展[26]，并應(yīng)用于各種絲狀真菌，包括黑曲霉的基因敲除和定向改造[27]。在該系統(tǒng)中，在單導(dǎo)向RNA（sgRNA）的指導(dǎo)下，Cas9被特異性地引導(dǎo)到基因組目標位點，包括sgRNA原間隔區(qū)的20 bp序列互補堿基對和下游3 bp原間隔區(qū)相鄰基序序列，切割基因組 DNA以引入雙鏈斷裂。如果同時提供DNA修復(fù)模板，斷裂處可由菌株自行修復(fù)[28-32]。

本研究使用無孢黑曲霉（A.niger）HL-1作為表達宿主，利用黑曲霉的雜合啟動子（PnaII）和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的溶菌酶LyAa基因進行載體構(gòu)建，使用雙拷貝表達載體和CRISPR/Cas9工具提高溶菌酶基因表達和整合效率，篩選得到高表達菌株。通過在溶菌酶的C端添加6×His標簽來進行純化，研究了純化后溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨在為真菌來源GH25溶菌酶的規(guī)模化制備和應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）Match1 T1購自美國Invitrogen公司；黑曲霉表達宿主A.nigerHL-1（ΔpyrG）為本實驗室構(gòu)建并保存；抑菌試驗所使用的細菌：溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus，ATCC 4698）購自廣州市微生物研究所；曲霉 UEV表達載體（雜合啟動子PnaⅡ、終止子Ttef、營養(yǎng)缺陷型篩選標記pyrG和淀粉酶amyA下游同源臂）為本實驗室構(gòu)建并保存。

1.1.2 試劑

快速核酸內(nèi)切酶（如XbaⅠ）購于美國 Thermo Fisher Scientific公司；UDP（尿苷二磷酸）及UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）均購于上海穎心實驗室設(shè)備有限公司；氨芐青霉素（Amp）和胃蛋白酶購于北京普博欣生物科技有限公司；Prime STAR Max DNA Polymerase、Protein Marker 26630和DNA Marker（1 kb DNA Ladder和DL 10000TM）購于日本TaKaRa公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（m/m）：1%氯化鈉，1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物（固體加2%瓊脂粉）。

察氏（CD）培養(yǎng)基（m/m）：2%葡萄糖，0.3% NaNO3，0.2% KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001%FeSO4·7H2O，瓊脂粉（液體 0.05%，固體 2%），pH值5.5。

DPY培養(yǎng)基（m/m）：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O。

蔗糖高滲培養(yǎng)基（上層培養(yǎng)基0.5%瓊脂，下層培養(yǎng)基2%瓊脂，m/m）：40%蔗糖，0.3% NaNO3，0.2%KCl，0.05% MgSO4·7H2O，0.1% KH2PO4，0.001%FeSO4·7H2O，pH 值 5.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米粉，3%玉米漿，2%黃豆粕粉。

1.1.4 引物

引物（表1）用于PCR擴增片段和曲霉基因組驗證。

表1 引物Table 1 Primer

1.2 儀器與設(shè)備

梯度聚合酶鏈式反應(yīng)儀 Veriti 96-Well Thermal Cycler購于美國Applied Biosystems公司；M200多功能微孔板檢測器購自美國Thermo Fisher Scientific公司；浸入式水平電泳槽系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司；離心機、移液槍購于德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 目的基因序列的優(yōu)化與克隆

1.3.3 溶菌酶表達菌株的構(gòu)建與篩選

在GenBank可搜索到嗜堿頂孢霉GH25溶菌酶氨基酸序列（GenBank Accession id：MN603156），將基因序列根據(jù)黑曲霉密碼子偏好進行優(yōu)化，將序列發(fā)送至生物公司合成并連接至通用載體。以合成的目的質(zhì)粒為模板，使用引物L(fēng)yAa-F和LyAa-R擴增溶菌酶基因LyAa（在目的基因的C端加入6×His標簽）。PCR過程中使用不易引起突變的高保真酶，將獲得的產(chǎn)物進行電泳驗證無誤后回收，保存于-20 ℃冰箱備用。

將溶菌酶表達載體經(jīng)過質(zhì)粒大量提取，用核酸內(nèi)切酶Apa I反應(yīng)6 h后，純化并濃縮。使用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化宿主（黑曲霉A.nigerHL-1）原生質(zhì)體，將含有原生質(zhì)體的蔗糖軟瓊脂分散涂布于三個培養(yǎng)基平板上，30 ℃放置7 d后長出菌落。挑選轉(zhuǎn)化子于固體CD平板上繼續(xù)培養(yǎng)，并挑取部分轉(zhuǎn)化子在 DPY培養(yǎng)基提取基因組。以轉(zhuǎn)化子基因組模板，PCR驗證目的基因表達框是否已整合到轉(zhuǎn)化子的基因組上，篩選出正確的溶菌酶表達菌株，將正確的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過低速研磨后接種液體CD培養(yǎng)基。

1.3.2 溶菌酶表達載體構(gòu)建

1.3.2.1 溶菌酶傳統(tǒng)單拷貝表達載體構(gòu)建

將溶菌酶基因LyAa、雜合啟動子PnaⅡ和經(jīng)過酶切線性化的通用載體 UEV（包含Ttef終止子、pyrG篩選標記和amyA下游同源臂）使用HiFi DNA連接酶將各個片段連接成質(zhì)粒載體，與大腸桿菌感受態(tài)細胞在42 ℃熱激90 s，加入適量液體LB進行培養(yǎng)后，涂布氨芐抗性平板37 ℃放置12 h。將長出的單菌落挑至孔板培養(yǎng)，經(jīng)過菌液電泳、提質(zhì)?？焖倜盖序炞C、測序驗證后，根據(jù)結(jié)果篩選出與圖譜相符的表達載體。將構(gòu)建成功的表達載體命名為pUEV- LyAa。

1.3.2.2 溶菌酶雙拷貝表達載體構(gòu)建

在黑曲霉中，同向相連的重復(fù)片段由于同源重組的原因，會導(dǎo)致其中一個片段的丟失。構(gòu)建雙拷貝載體時，在溶菌酶單拷貝表達載體的基礎(chǔ)上，在Ttef終止子與pyrG篩選標記之間插入一段包含雜合啟動子PnaⅡ、溶菌酶基因LyAa和糖化酶終止子TglaA的反向片段，兩終止子末端相連處含有20 bp的酶切位點。以1.3.2.1節(jié)中描述的構(gòu)建方法，篩選出正確的表達載體命名為pUEV-LyAaD。

1.3.4 使用雙拷貝表達載體和CRISPR/Cas9工具提高溶菌酶的表達量

雙拷貝表達載體同樣經(jīng)過核酸內(nèi)切酶Apa I處理后與質(zhì)粒Cas9-H進行共轉(zhuǎn)化。質(zhì)粒Cas9-H能夠使黑曲霉合成出Cas9蛋白和sgRNA，切割位點位于淀粉酶amyA基因內(nèi)，帶有hyg潮霉素篩選標記。使用1.3.3節(jié)方法篩選，但需要在蔗糖高滲培養(yǎng)基中加入潮霉素（2 μL/mL），可得到相應(yīng)的陽性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化時僅使用雙拷貝表達載體可得另一組陽性轉(zhuǎn)化子。

1.3.5 溶菌酶重組表達菌株的搖瓶發(fā)酵及酶活測定

1.3.5.1 比濁法

溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus，ATCC4698）的細胞壁富含肽聚糖，可以被用作實驗菌，溶菌酶可使細菌裂解而讓菌懸液的 450 nm吸光度降低。在550 mL容量瓶中加入20.125 mL的1.0 mol/L磷酸氫鉀溶液、7.375 mL的1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，加入超純水定容，使用1 mol/L KOH或1 mol/L HCl在25 ℃下將pH值調(diào)節(jié)至6.24，緩沖液在常溫下保存。將20 mg菌粉與100 mL緩沖液混合均勻，于30 ℃培養(yǎng)30 min，菌懸液的A450nm保持在0.70±0.1內(nèi)。將鑒定正確的溶菌酶菌株在液體淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d（30 ℃，250 r/min），10 000×g離心10 min，收集上清液。吸取100 μL上清液液與2.5 mL菌懸液混合均勻，觀察和記錄A450 nm的下降值，根據(jù)下列公式計算酶活。

式中：

B——酶活，U/mL；

ΔA1測試樣品在450 nm處每分鐘吸光度下降值；

ΔA0空白樣品在450 nm處每分鐘吸光度下降值；

df——稀釋因子；

0.001 ——單位定義中的吸光度（ΔA）變化；

0.1——酶溶液的體積（以毫升計）[33]。

1.3.5.2 平板涂布法

將溶壁微球菌接種LB培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)至450 nm吸光度為0.5左右，用LB培養(yǎng)基稀釋100倍，取1 μL與100 μL發(fā)酵上清液充分混合后在30 ℃培養(yǎng)2 h，取30 μL涂布LB固體平板，30 ℃放置12 h后計算菌落數(shù)量。將宿主發(fā)酵上清液與細菌混合后進行相同處理，作為陰性對照[34]。

1.3.5.3 牛津杯法

將10 mL LB培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，凝固后充當下層板，再加入5 mL與一定濃度菌懸液混合的LB培養(yǎng)基，凝固后充當上層版。用鑷子把牛津杯放到培養(yǎng)基表面，杯口朝上，并且牛津杯與培養(yǎng)基之間無空隙，在杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，37 ℃培養(yǎng)12 h。發(fā)酵上清液以牛津杯為中心進行擴散，離杯越近溶菌酶濃度越高，在高濃度溶菌酶下細菌會裂解死亡。經(jīng)過一段時間后可明顯看到抑菌圈，用尺量出透明圈的大小，范圍越大說明活性越強[35]。

1.3.6 溶菌酶蛋白純化和SDS-PAGE分析

構(gòu)建載體時溶菌酶LyAa帶有6×His標簽，可使用鎳柱通過親和層析的方式純化溶菌酶蛋白。在發(fā)酵培養(yǎng)基中將目的菌株培養(yǎng)6 d，將發(fā)酵培養(yǎng)基高速離心取上清，重復(fù)兩次后，用0.45 μm的濾膜過濾。使用HisTrapTMHP層析柱進行親和層析，進樣量為30 mL，流速設(shè)置1 mL/min。使用不同濃度的咪唑buffer進行洗脫，將各個不同濃度的洗脫峰收集至15 mL離心管。離心管中取40 μL 與 10 μL 5×loading buffer混合后，煮沸10 min，取10 μL反應(yīng)液進行SDS-PAGE檢測。根據(jù)每個洗脫峰的檢測結(jié)果，得到單一的溶菌酶溶液。

1.3.7 溶菌酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.7.1 溫度對溶菌酶的影響

最適溫度的測定：在pH值4.0的條件下，配置不同溫度梯度 20、25、30、35、40、45、50、60、70、80 ℃的菌懸液與酶液混合反應(yīng)，根據(jù)450 nm吸光度的降低值來確定溶菌酶的最適溫度，以450 nm吸光度最大降低值為100%。溫度穩(wěn)定性測定：配置65、70、75、80 ℃的菌懸液進行相同操作，以各組加熱0 min時所得的450 nm吸光度降低值為100%。

1.3.7.2 pH值對溶菌酶的影響

最適pH值的測定：在pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0的菌懸液中，根據(jù)反應(yīng)時450 nm吸光度的降低值來確定溶菌酶的最適pH值，以450 nm吸光度最大降低值為100%。pH值穩(wěn)定性測定：酶液在相應(yīng)pH值下孵育3 h，進行相同操作，以各組孵育0 min時所得的450 nm吸光度降低值為100%。

1.3.7.3 溶菌酶的胃蛋白酶穩(wěn)定性

將溶菌酶LyAa與母雞蛋白溶菌酶在胃蛋白酶緩沖液（100 mmol/L甘氨酸-HCl，pH值4.0）中處理0、15、30、60 min后，在37 ℃下根據(jù)450 nm吸光度的下降來確定溶菌酶的殘留活性。在胃蛋白酶緩沖液中孵育結(jié)束后添加終止液使胃蛋白酶失活。以在處理0 min時的活性為100%。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，取平均值后進行數(shù)據(jù)分析與處理，圖表制作使用誤差線，并使用Origin軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶LyAa的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

溶菌酶LyAa的基因（Genbank：MN603156）編碼包含208個氨基酸的GH25溶菌酶成熟肽（不包含信號肽）。SWISS MODEL蛋白質(zhì)三維建模服務(wù)器預(yù)測后（模板 PDB：6zm8），結(jié)果（圖1）顯示，溶菌酶LyAa含有α-螺旋和β-折疊（使用不同顏色標注），擁有包括Asp95和Glu97兩個殘基形成活性中心（由單獨的球棍模型標注）。在結(jié)構(gòu)模型中，最后三股β鏈以無螺旋的環(huán)狀相連接，而最后的β鏈以平行相反的方向連接，在活性位點殘基所在的位置形成一個經(jīng)典的桶狀褶皺，活性位點殘基位于桶狀褶皺的前半部分。這種結(jié)構(gòu)是一種特異性βα折疊，也是GH25溶菌酶的特色結(jié)構(gòu)，最早被發(fā)現(xiàn)于天藍色鏈霉菌的溶菌酶[36]。雖然溶菌酶LyAa擁有N -糖基化位點，但溶菌酶LyAa沒有在這些結(jié)構(gòu)位點發(fā)生糖基化[20]。經(jīng)預(yù)測，該多肽的理論分子量為24.9 ku、等電點為8.4。

圖1 LyAa溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.1 Three-dimensional structure prediction of LyAa protein

2.2 溶菌酶LyAa的系統(tǒng)進化分析

將LyAa與其它真菌來源的GH25溶菌酶進行多序列比對，并采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果顯示（圖2），嗜堿頂孢霉（Acremonium alcalophilum）與毛霉菌亞門（Mucoromycotinasp.）和擬青霉（Paecilomycessp.）等聚為一支，綠僵菌屬（Metarhiziumsp.）等聚為另一小支，羅斯曼枝穗菌（Clonostachys rossmaniae）等聚為第三小支。

圖2 不同真菌來源GH25溶菌酶的系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of GH25 lysozyme from different fungal sources

2.3 溶菌酶LyAa的載體構(gòu)建與表達菌株的篩選

將溶菌酶基因在SignalP 5.0服務(wù)器上預(yù)測信號肽，發(fā)現(xiàn)其N端含有分泌信號肽，用黑曲霉中高表達的glaA糖化酶信號肽進行替換。按照1.3.2節(jié)的方法構(gòu)建溶菌酶 LyAa單拷貝和雙拷貝表達載體（圖3a、3b）。質(zhì)粒載體經(jīng)過內(nèi)切酶Apa I處理后，進行電泳驗證，pUEV-LyAa應(yīng)有4 200 bp與2 800 bp條帶，pUEV-LyAa應(yīng)有6 200 bp與2 800 bp條帶，結(jié)果顯示符合預(yù)期（圖3c、3d）。測序結(jié)果顯示，兩個表達載體未發(fā)現(xiàn)突變，已成功構(gòu)建。按照1.3.3節(jié)的方法篩選得到重組菌株，經(jīng)提取基因組PCR驗證正確后獲得陽性轉(zhuǎn)化子。

圖3 溶菌酶LyAa的載體構(gòu)建與表達菌株的篩選Fig.3 Vector construction of lysozyme LyAa and screening of expression strain

2.4 溶菌酶LyAa表達量的提升

為了進一步提高LyAa的表達水平，使用雙拷貝質(zhì)粒pUEV-LyAaD與CRISPR/Cas9工具進行共轉(zhuǎn)化作為表達策略。將雙拷貝片段整合到表達菌株淀粉酶的多個位點，得到不同拷貝數(shù)的表達菌株。結(jié)果表明（圖4A、4B），使用雙拷貝表達載體pUEV-LyAaD與CRISPR/Cas9工具進行共轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子（LyAa-C）的蛋白條帶最濃，僅使用雙拷貝表達載體 pUEV-LyAaD的轉(zhuǎn)化子（LyAa-F）的蛋白條帶濃度次之，僅使用傳統(tǒng)單拷貝表達載體pUEV-LyAa的轉(zhuǎn)化子（LyAa-T）蛋白條帶濃度最淡。各表達菌株酶活力均在6 d達到最高，LyAa-T的酶活力最高為358.41 U/mL，LyAa-F的酶活力最高為869.74 U/mL，約為LyAa-T的2.43倍。LyAa-C的酶活力最高為2 291.37 U/mL，約為LyAa-F的2.63倍，約為LyAa-T的6.39倍。宿主對照幾乎檢測不到酶活力。平板涂布法檢測酶活力，結(jié)果顯示（圖4C），LyAa-C發(fā)酵上清液形成的菌落數(shù)最少，約為20個；LyAa-F發(fā)酵上清液形成的菌落數(shù)約為50個；LyAa-T發(fā)酵上清液形成的菌落數(shù)約為90個；宿主對照菌落數(shù)約為160個。牛津杯法檢測酶活力，結(jié)果顯示（圖4D），LyAa-C發(fā)酵上清液形成的溶菌圈直徑約為7.9 mm，LyAa-F發(fā)酵上清液形成的溶菌圈直徑約為6.8 mm。

圖4 溶菌酶LyAa表達量的提升Fig.4 Increasing the expression of lysozyme LyAa

2.5 溶菌酶LyAa的純化

使用鎳柱進行純化，通過不同洗脫峰，得到單一溶菌酶蛋白樣品，并進行SDS-PAGE檢測（圖5），泳道1為純化后的LyAa溶菌酶，蛋白分子量大小約為25.0 ku，與預(yù)測結(jié)果大小相同。

圖5 溶菌酶LyAa的純化Fig.5 SDS-PAGE profile of purified LyAa

2.6 溶菌酶LyAa的酶學(xué)性質(zhì)

2.6.1 溫度對LyAa酶活力的影響

溶菌酶LyAa在30 ℃達到最適溫度，溫度逐漸升高的過程中酶活不斷降低（圖6a）。溶菌酶在溫度25~70 ℃有較好的熱穩(wěn)定性，在此范圍內(nèi)處理60 min后仍能保持80%以上的相對酶活力，超過75 ℃后相對酶活力下降速度較快（圖6b）。

圖6 溫度對LyAa酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on LyAa enzyme activity

2.6.2 pH值對LyAa酶活力的影響

溶菌酶LyAa在pH值為4.0時酶活力達到最高，在pH值為3.5~5.0時保持著80%以上的相對酶活力（圖7a）。同樣在pH值為3.5~5.0時，孵育3 h后仍保持80%以上相對酶活力（圖7b）。

圖7 pH值對LyAa酶活力的影響Fig.7 Effect of pH value on LyAa enzyme activity

2.6.3 胃蛋白酶對LyAa與母雞蛋白溶菌酶酶活力的影響

將 LyAa與母雞蛋白溶菌酶在胃蛋白酶緩沖液中處理后測定剩余活性。結(jié)果顯示（圖8），在15 min后，母雞蛋白溶菌酶的酶活力就大大降低，60 min后相對酶活力已經(jīng)不足10%。而LyAa在處理60 min后的相對酶活力變化很小，顯示出良好的胃蛋白酶穩(wěn)定性。

圖8 胃蛋白酶對LyAa與母雞蛋白溶菌酶酶活力的影響Fig.8 Effects of pepsin on the enzyme activity of LyAa and hen protein lysozyme

3 結(jié)論

黑曲霉的胞外蛋白分泌量大，在菌株內(nèi)部能夠?qū)Φ鞍走M行修飾，且無生物毒性，是表達外源分泌蛋白的優(yōu)良宿主。本研究將來自嗜堿頂孢霉的GH25基因根據(jù)黑曲霉的偏好進行密碼子優(yōu)化后，將基因原有的信號肽替換成黑曲霉的糖化酶信號肽并將其置于雜合啟動子PnaII控制下表達構(gòu)建單拷貝表達載體和雙拷貝表達載體。僅使用單拷貝載體得到的菌株 LyAa-T搖瓶發(fā)酵酶活力為358.41 U/mL，僅使用雙拷貝載體得到的菌株LyAa-F搖瓶發(fā)酵酶活力為869.74 U/mL，是LyAa-T的2.43倍。使用雙拷貝載體并借助CRISPR工具整合獲得多拷貝的菌株LyAa-C搖瓶發(fā)酵酶活力為2 291.37 U/mL，是LyAa-F的2.63倍，是LyAa-T的 6.39倍。使用鎳柱純化得到單一的溶菌酶蛋白，SDS-PAGE結(jié)果表明其分子量大小約為25.0 ku，與預(yù)測結(jié)果24.9 ku相同。測試其酶學(xué)性質(zhì)，酶活力在30 ℃時最高，短時間的高溫處理對酶活力影響不大；最適pH值為4.0，在pH值為3.5~5.0時有較高的酶活力和穩(wěn)定性；溶菌酶LyAa在胃蛋白酶緩沖液中處理后活性變化很小，而母雞蛋白溶菌酶的酶活力大大降低。綜上，溶菌酶LyAa能夠不被胃蛋白酶水解且性質(zhì)穩(wěn)定，且在黑曲霉中成功提升其產(chǎn)量，為后續(xù)的規(guī)?；苽浜蛻?yīng)用提供理論支持。