蘇鋼，楊光勇，張庚鑫，杜海洋，田維毅，王文佳，王平，涂小華，何光志

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

抗生素相關(guān)性腹瀉（Antibiotic-Associated Diarrhea，AAD）是使用抗生素的過程中引起腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，致病菌過度增殖而導(dǎo)致的腹瀉，其發(fā)病率達(dá)到5%~39%，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克甚至死亡[1,2]。部分臨床醫(yī)生對AAD的治療未重視藥物對腸道微生態(tài)的影響，致使疾病遷延不愈，加重患者的生活負(fù)擔(dān)[3,4]。

中醫(yī)學(xué)注重辨證論治、整體合參的治療理念，中醫(yī)藥對疾病發(fā)展的階段性治療有其內(nèi)在獨(dú)特優(yōu)勢。葛根芩連湯（Gegen Qinlian Decoction，GQD）出自東晉醫(yī)圣張仲景所著的《傷寒雜病論》，其方含有葛根、黃芩、黃連、炙甘草四味藥，具有清熱止瀉的主治功效，主治因表證誤用下法，致表邪內(nèi)陷，利遂不止的病癥。葛根、甘草等是國家認(rèn)證的“藥食同源”物種，具有止痛、抗炎、止瀉、抗菌、降血糖、降血脂、抗病毒和調(diào)節(jié)胃腸功能的作用[5-8]。近年來大量研究證實(shí)GQD治療AAD臨床效果明顯[9-13]，但其作用機(jī)制仍尚不清楚。

中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、多成分等特性與腸道微生態(tài)多樣性具有相似之處[14]。腸道菌群決定著宿主的健康狀況，其數(shù)量龐大、種類繁多，被稱為機(jī)體內(nèi)“第二器官”[15]，具有消化吸收、免疫調(diào)節(jié)、能量代謝等作用。相關(guān)研究報(bào)道，腸道菌群與AAD的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[16]。隨著16S rRNA測序技術(shù)的不斷成熟，第二代基因測序已被廣泛運(yùn)用到各項(xiàng)科研中，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供新的策略[17]。故本研究基于16S rRNA測序技術(shù)探究GQD對AAD的腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期從腸道菌群角度闡釋GQD對AAD的部分作用機(jī)制，為課題前期研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠60只，雌雄各半，體重（200±20）g，周齡6~8周，購自重慶騰鑫華阜實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司（許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理協(xié)會(huì)所規(guī)定的有關(guān)動(dòng)物倫理福利條款進(jìn)行。

1.2 主要藥物與試劑

克林霉素磷酸酯，廣州白云山天心制藥股份有限公司（批號(hào)：210202）；雙歧桿菌活性菌，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司（批號(hào) S10960040）。葛根（批號(hào)201201）；黃芩（批號(hào)200701）；黃連（批號(hào)200301）；炙甘草（批號(hào) 201202），均購自同仁堂貴陽分店；水合氯醛，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)Q/12HB4218-2017）；糞便基因組DNA提取試劑盒，上海索萊寶生物科技有限公司（批號(hào)021-54100800）。

1.3 主要儀器

紫外分光光度計(jì)，Eppendorf；TBS380熒光計(jì)，PROMEGA；瓊脂糖電泳儀，北京六儀；2100生物分析儀，Agilent；PCR擴(kuò)增儀，ABI；MiSeq Sequencing Platform測序平臺(tái)，Illumina。

1.4 葛根芩連湯制備

中藥飲片按照藥物比例8:3:2:3，其中葛根24 g，黃芩9 g，炙甘草6 g，黃連9 g，本方參照《實(shí)用方劑學(xué)》[18]。將所有中藥飲片加9倍量純水浸泡30 min，大火煮沸后調(diào)至小火煎煮2 h，用四層紗布過濾藥液后，再次將中藥中加入9倍純水煎煮方法同上，最后將兩次濾液濃縮至生藥質(zhì)量濃度1 g/mL，將所得中藥湯劑冷卻后保存在4 ℃冰箱備用，煎煮方法參照文獻(xiàn)[19,20]。

1.5 模型制備及分組給藥

1.5.1 模型制備

抗生素相關(guān)性腹瀉大鼠模型的制備參照文獻(xiàn)[21]。將60只SD大鼠按性別分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成空白組（C）10只、造模組（M）50只，各組大鼠均雌雄各半。造模組SD大鼠每日按劑量進(jìn)行克林霉素250 mg/kg灌胃進(jìn)行造模，空白組給予等量生理鹽水灌胃，兩組均1次/d，連續(xù)7 d。觀察大鼠飲食、精神等一般情況，將糞便形態(tài)分為褐色成形糞便（0分）、淡黃色或淡褐色不成形樣便（2分）、稀水樣便（4分）進(jìn)行糞便評(píng)分，糞便評(píng)分參照文獻(xiàn)[22]，根據(jù)大鼠一般情況及糞便狀態(tài)判斷建模是否成功。

1.5.2 分組及給藥

造模成功后，于第8天早晨9:00將造模組大鼠隨機(jī)分為5組：麗珠腸樂組（P）、模型組（M）、葛根芩連湯高、中、低劑量組（GQD-H、GQD-M、GQD-L），10只/組（雌雄各5只）。隨后空白組及模型組灌胃等體積生理鹽水，GQD-H、GQD-M、GQD-L組、麗珠腸樂組分別給予對應(yīng)藥物，根據(jù)魏教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[23]，大鼠給藥劑量為60 kg成年人的6.3倍換算，灌胃體積1 mL/100 g。

1.6 結(jié)腸HE染色

應(yīng)用m=4%的多聚甲醛溶液浸泡SD大鼠部分結(jié)腸組織數(shù)天后取出，進(jìn)行石蠟切片、脫蠟至水，依次將切片放入二甲苯2次，每次20 min；無水乙醇2次，每次5 min；φ=75%酒精中浸泡5 min，自來水沖洗切片，直至其干凈透明；切片放入蘇木素染色3~5 min，自來水洗，經(jīng)分化液分化，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗；入伊紅染色，切片依次入φ=85%、φ=95%的梯度酒精脫水各5 min，入伊紅染液中染色5 min；無水乙醇I、II、Ⅲ中各脫水5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明5 min；中性樹膠封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察其病理改變。

1.7 16S rRNA擴(kuò)增及測序

從每組中隨機(jī)取6個(gè)SD大鼠結(jié)腸內(nèi)糞便采用Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒進(jìn)行總DNA提取作為模板；采用Q5? High-Fidelity DNA Polymerase對16S rRNA的 V3-V4區(qū)引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，338 F(5'-ACTCCTACGGGAGCAGCA-3')和 806 R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。對擴(kuò)增產(chǎn)物運(yùn)用文庫2100檢測質(zhì)控，運(yùn)用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit試劑盒建庫，通過Illumina MiSeq平臺(tái)上利用雙末端測序（PairedEnd）方法進(jìn)行高通量測序。

1.8 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用QIIME2軟件里DADA2（版本1.12）在質(zhì)控、去噪、連接、嵌合體去除序列后，以完全一樣聚類產(chǎn)生的序列命名為ASVs（Amplicon Sequence Variants）。采用標(biāo)準(zhǔn)的序列號(hào)與最少序列相對應(yīng)，將得到去singleton后的ASV序列量[24-26]。然后利用稀疏曲線圖分析、距離矩陣與PcoA分析、物種組成分析、LEfSe（LDA Effect Size）分析尋找有差異的生物標(biāo)志物[27,28]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 26.00軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，多組間比較采用單因素方差分析（Analysis of Variance,ANOVA）、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)采用 Kruskal-Wallis(H)檢驗(yàn)、Wilcoxon檢驗(yàn)；以p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 一般情況及糞便狀態(tài)

空白組糞便呈褐色成形硬便、被毛整齊光澤、精神及飲食正常；造模組在3 d后上出現(xiàn)淡黃色不成形軟便、被毛粗亂欠光澤、畏寒蜷縮、飲食稍差；7 d后糞便呈淡黃色稀水樣便、被毛暗淡無光澤、精神萎靡不振、飲食下降明顯（見圖1）。通過糞便評(píng)分發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，造模組 SD大鼠糞便出現(xiàn)明顯稀便（p＜0.01），提示造模成功（見表1）。

圖1 臨床癥狀及糞便狀態(tài)Fig.1 Clinical symptoms and fecal status

表1 大鼠糞便狀態(tài)評(píng)分Table 1 Rat fecal status score (xˉ±s)

空白組造模組3 d造模組7 d。

2.2 結(jié)腸組織病理變化

空白組結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層上皮完整，細(xì)胞形態(tài)正常，腸腺數(shù)量豐富、形態(tài)正常、排列緊密，未見明顯病理損傷。模型組腸管各層結(jié)構(gòu)欠清晰，黏膜層可見上皮細(xì)胞脫落，腸腺之間固有層水腫變寬，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層組織排列疏松，隱窩基底部間距增寬，存在少許炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比，麗珠腸樂組及GQD組結(jié)構(gòu)清晰，單層柱狀上皮完好，組織結(jié)構(gòu)排列整齊，均未見炎癥細(xì)胞浸潤（見圖2）。提示經(jīng)過GQD治療后，大鼠結(jié)腸病理變化明顯好轉(zhuǎn)。

圖2 結(jié)腸HE染色Fig.2 Colonic HE staining

2.3 測序結(jié)果

本次試驗(yàn)共使用36個(gè)糞便樣本進(jìn)行測序，序列經(jīng)過雙端拼接去冗余后共獲得3 275 140對序列，經(jīng)DADA2去噪后各樣本平均含有有效序列64 316條。使用gg_13數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行注釋，其序列范圍為50~434 bp，序列平均含有423 bp符合16S rDNA V3~V4區(qū)。

2.4 稀疏曲線分析

ASV表的抽平深度反映Alpha多樣性指數(shù)的大小，通過繪制稀疏曲線，比較各組樣本在相同的測序深度下中 ASV數(shù)量多少，從而展示各組的多樣性高低。當(dāng)曲線隨著橫坐標(biāo)測序列數(shù)目的增加趨于平坦時(shí)，縱坐標(biāo)的 ASV數(shù)目不會(huì)隨著測序深度的增加而升高。提示目前測序深度已經(jīng)足以反映出樣本生境內(nèi)的物種數(shù)量（見圖3）。

圖3 稀疏曲線圖Fig.3 Sparse graph

2.5 腸道菌群多樣性分析

韋恩圖（Venn）被用于計(jì)算各組樣品中所共有和獨(dú)有的ASV數(shù)目，可以量化表現(xiàn)各組樣品中ASV數(shù)目組成相似及不同的情況。本試驗(yàn)以在樣品中 100%出現(xiàn)的ASV為過濾值繪制花瓣圖。各組共含有ASV數(shù)目分別為C組125個(gè)，M組16個(gè)，P組6個(gè)，GQD-H組22個(gè)、GQD-M組25個(gè)、GQD-L組50個(gè)。六個(gè)組中始終存在10個(gè)ASV作為核心物種，獨(dú)有ASV數(shù)目分別為C組115個(gè)，M組6個(gè)，P組26個(gè)，GQD-H組12個(gè)，GQD-M組15個(gè)，GQD-L組40個(gè)。（見圖4）。提示各組間 ASV物種差異巨大，GQD-H組與GQD-M組對腸道菌種影響相似，GQD-L組對菌種的影響優(yōu)于麗珠腸樂。

Alpha多樣性常用Chao1指數(shù)是生境內(nèi)的觀察指標(biāo)，其指數(shù)越高代表菌群數(shù)量越豐富。與C組比，M組物種數(shù)量具有顯著性差異（p＜0.05）；結(jié)合花瓣圖發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GQD治療后菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，在物種數(shù)量方面，與C組比較，M組相對減少ASV數(shù)目；與M組相比，各治療組獨(dú)有物種均相對較多（見圖4、5）。提示GQD改善腸道菌群多樣性。

圖4 腸道微生物維恩圖Fig.4 Venn of intestinal microflora

圖5 Alpha多樣性分析Fig.5 Alpha diversity analysis

Beta多樣性指數(shù)聚焦于不同生境間多樣性的比較。應(yīng)用距離矩陣與 PcoA（Principal Coordinate Analysis）分析，Jaccard距離算法降維，繪制95%的置信橢圓。每個(gè)彩色的點(diǎn)代表一個(gè)樣本，當(dāng)樣本距離越近證明其菌群結(jié)構(gòu)相似度越高。當(dāng)樣本投射到縱坐標(biāo)PCo2對其組間菌群解釋度是6.4%，當(dāng)樣本投射到橫坐標(biāo)PCo1對其距離解釋度為8.8%。與C組比，M組與其距離較遠(yuǎn)，提示M組與C組間腸道菌群存在明顯差異。與M組比，GQD-M組、GQD-L組與其距離較遠(yuǎn)，以縱軸為參照且有向C組靠近的趨勢，說明經(jīng)GQD治療AAD后腸道菌群結(jié)構(gòu)改善。組間差異分析通過R語言調(diào)用Adonis分析得出，組間相關(guān)差異R2=0.436，p=0.001說明該方案分組成立，組間差異優(yōu)于組內(nèi)差異。結(jié)果提示，GQD改善AAD大鼠腸道中菌群結(jié)構(gòu)（見圖6）。因此，可以假設(shè)GQD通過對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響來維持AAD大鼠腸道菌群的平衡。

圖6 Beta多樣性Fig.6 Beta diversity analysis

2.6 物種組成分析

在門水平，各組大鼠腸道糞便主要含有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes），變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）且占總菌群的95%。各組中厚壁菌門相對豐度從高到低依次為 P（96.73%）、GQD-H（93.57%）、GQD-L（89.02%），M（83.46%）、GQD-M（80.69%）、C（61.36%）。擬桿菌門相對豐度從高到低依次為C（16.53%）、GQD-M（13.62%）、M（8.01%）、GQD-L（7.87%）、GQD-H（4.72%）、P（2.10%）。放線菌門相對豐度從高到低依次為C（14.72%）、M（1.75%）、GQD-H（0.52%）、GQD-M（0.47%）、GQD-L（0.47%）、P（0.36%）。變形菌門相對豐度從高到低依次為M（6.36%）、GQD-M（4.77%）、C（2.60%）、GQD-L（2.06%）、GQD-H（0.80%）、P（0.32%）。擬桿菌門與厚壁菌門相對豐度比值（B/F）從高到低依次排序：C（26.94%）、GQD-M（16.87%）、M（9.59%）、GQD-L（8.85%）、GQD-H（5.04%）、P（2.18%）。運(yùn)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）、軟壁菌門（Tenericutes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、TM7均具有顯著性差異（p＜0.01），綠彎菌門（Chloroflexi）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），梭桿菌門（Fusobacteria）無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），見圖7a。綜上所述，GQD能夠增加腸道內(nèi)厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度，同時(shí)改善擬桿菌門與厚壁菌門的比值（B/F），降低變形菌門、放線菌門相對豐度。

變形菌門以革蘭氏陰性菌為主，該菌門下細(xì)菌形狀多樣，其中包含大量病原菌。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，炎性腸病的腸道微生物多樣性具有相似性，均伴有腸道菌群多樣性降低，其內(nèi)在原因與變形菌門的相對增加密切相關(guān)[29,30]。當(dāng)腸道發(fā)生炎癥時(shí)，使用抗生素治療會(huì)引起腸道內(nèi)菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞氧化，促使變形菌門數(shù)量大量增多[31]。厚壁菌門與擬桿菌門作為腸道微生物中優(yōu)勢菌門，兩者相對比例較為穩(wěn)定，當(dāng)它們比例失衡時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致糖尿病、肥胖、胃腸道等疾病的發(fā)生[32]。近年來擬桿菌門與厚壁菌門的比值（B/F）常被作為腸道菌群平衡的基準(zhǔn)[33]，其比值（B/F）高低與腸道菌群多樣性存在強(qiáng)相關(guān)性[34]。提示GQD可能通過改善厚壁菌門與擬桿菌門的比例，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡。

在屬水平，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對豐度含量從高到低依次為P（78.36%），GQD-H（63.73%），GQD-L（55.31%），GQD-M（50.30%），M（33.68%），C（25.21%）。異芽孢桿菌（Allobaculum）相對豐度含量從高到低依次為C（17.73%），M（6.98%），GQD-H（2.55%），GQD-M（1.24%），GQD-L（0.64%），P（0.55%）。布勞特氏菌（Blautia）相對豐度含量從高到低依次為 M（7.30%），GQD-H（5.79%），GQD-L（3.86%），GQD-M（2.40%），P1.21%），C0.05%）。擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度含量從高到低依次為 GQD-M（7.91%），GQD-L（2.94%），GQD-H（2.85%），C（1.25%），P（0.61%），M（0.35%）。雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）相對豐度含量從高到低依次為 C（13.44%），M（0.34%），P（0.06%），GQD-L（0.05%），GQD-M（0.03%），GQD-H（0.01%）。顫螺菌屬（Oscillospira）相對豐度含量從高到低依次為GQD-L（2.20%），P（2.17%），C（1.87%），M（1.56%），GQD-H（1.38%），GQD-M（1.08%）。志賀氏桿菌（Shigella）相對豐度含量從高到低依次為 GQD-M（4.28%），M（1.77%），GQD-L（1.59%），C（1.40%），GQD-H（0.47%），P（0.23%）。瘤胃球菌（Ruminococcus）相對豐度含量從高到低依次為 M（4.28%），GQD-M（2.62%），GQD-H（1.17%），P（0.65%），GQD-L（0.56%），C（0.16%）。嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）相對豐度含量從高到低依次為M（4.19%），C（0.64%），GQD-H（0.24%），GQD-L（0.15%），GQD-M（0.04%），P（0.00%）。多爾氏菌屬（Dorea）相對豐度含量從高到低依次為M（2.35%），GQD-M（1.68%），GQD-H（1.64%），P（0.92%），GQD-L（0.68%），C（0.09%）。運(yùn)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌屬、異芽孢桿菌、布勞特氏菌、擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、嗜冷桿菌屬、多爾氏菌屬具有顯著性差異（p＜0.01），瘤胃球菌屬具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），顫螺菌屬、志賀氏桿菌均（p＞0.05）無顯著性差異，見圖7b。提示：GQD顯著增加乳酸桿菌屬和擬桿菌屬相對豐度（p＜0.01），減少異芽孢桿菌、雙歧桿菌屬、嗜冷桿菌屬、布勞特氏菌屬、多爾氏菌屬相對豐度含（p＜0.01）及瘤胃球菌屬相對豐度（p＜0.05），見圖7b。

圖7 葛根芩連湯在門屬水平對AAD腸道菌群物種組成分析Fig.7 Analysis of species composition of AAD intestinal flora in GegenQinlian decoction at phylum and genus level

腸道菌群寄于宿主體內(nèi)參與機(jī)體生理病理的整個(gè)過程。乳酸桿菌及擬桿菌是腸道常見益生菌，具有保護(hù)腸道黏膜、防治腹瀉、調(diào)節(jié)腸道菌群等作用。據(jù)報(bào)道，GQD能促進(jìn)腸道濕熱綜合征腹瀉小鼠腸道中乳酸桿菌的增殖，而乳酸桿菌屬形成生物膜抑制致病菌繁殖[35]。多爾氏菌通過發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生丁酸修復(fù)腸道黏膜，在炎性腸病患者腸道菌群中發(fā)現(xiàn)多爾氏菌顯著降低[36]。瘤胃球菌和布勞氏菌作為AAD的潛在生物標(biāo)志物已被報(bào)道[37]。故推測GQD通過增加腸道菌群中優(yōu)勢菌種的相對數(shù)量，減少致病菌的增殖而發(fā)揮對AAD治療的作用。雖然能通過物種百分比堆積圖發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的菌種，但是仍不能清楚各組間菌種標(biāo)志物。

2.7 LEfSe分析

通過Lefse分析，設(shè)置LAD值＞3，差異物種過濾閾值=0.001，運(yùn)用Wilcoxon檢驗(yàn)分析找到各組間有顯著差異的生物標(biāo)記物。

在門水平與C對比，M中變形菌門、疣微菌門豐度降低，見圖8a；與M比，GQD-H和P中放線菌門、變形菌門豐度降低，見圖8c；其余各組未見差異變化。放線菌門是細(xì)菌結(jié)構(gòu)域中四大類群之一，在腸道菌群穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用[38]。但放線菌門中也含有大量腐生菌，多導(dǎo)致肺結(jié)核、膿腫及麻風(fēng)病等[39]。變形菌門除了與炎性腸病有關(guān)，據(jù)報(bào)道還參與慢性胃炎、十二指腸炎和胃癌的發(fā)生與發(fā)展[40]。提示GQD能降低腸道中致病菌豐度。

圖8 LEfSe分析葛根芩連湯對AAD腸道菌群的影響Fig.8 LEfSe analysis of the effect of GegenQinlian decoction on intestinal flora of AAD

在屬水平與C對比，M中共有12個(gè)菌種發(fā)生改變，豐度升高的是布勞特氏菌屬（Blautia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、多爾氏菌屬（Dorea）、SMB53、糞芽孢菌屬（Coprobacillus）、Lactonifactor、真桿菌屬（Eubacterium）、丹毒菌科梭菌屬（Erysipelotrichaceae Clostridium）。豐度降低的為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、阿克曼菌屬（Akkermansia）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、梭菌科梭菌屬（Clostridiaceae Clostridium），見圖8a。與M相比，P中菌種豐度增多的為乳酸菌屬（Lactobacillus），減少的菌種為異芽孢桿菌屬（Allobaculum）、多爾氏菌屬（Dorea）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、志賀氏菌屬（Shigella），見圖8b；GQD-H中擬桿菌屬（Bacteroides）豐度上調(diào)，嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）豐度下調(diào)，見圖8c；GQD-M中菌種豐度增多的是擬桿菌屬（Bacteroides），豐度減少的菌種是異芽孢桿菌屬（Allobaculum）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），見圖8d；GQD-L中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）豐度上調(diào)，芽孢桿菌屬（Allobaculum）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、多爾氏菌屬（Dorea）豐度下調(diào)，見圖8e。提示在屬水平GQD能增加腸道中乳酸桿菌、擬桿菌豐度，減少瘤胃球菌、多爾氏菌等豐度。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GQD干預(yù)后乳酸桿菌屬與擬桿菌屬相對豐度增多，然而經(jīng)麗珠腸樂治療后僅有乳酸桿菌屬增加。研究報(bào)道，乳酸桿菌形成的生物膜具有抵抗溫度、胃酸及膽汁等因素的作用，但雙歧桿菌對酸堿環(huán)境、溫度等因素的抵抗力差[41]。不同菌株在腸道中定植結(jié)果表現(xiàn)出不同，大部分益生菌在成人體內(nèi)的定植是短期的，只有少數(shù)菌種例外[42]。其次，菌株是自身攜帶還是外來攝入，是決定其定植的關(guān)鍵因素，菌株可以通過代謝產(chǎn)物加速腸道對競爭對手的定植抵抗[43]。腸道菌群之間為了適應(yīng)腸道微環(huán)境進(jìn)行交叉喂養(yǎng)相互依賴，雙歧桿菌通過發(fā)酵食物產(chǎn)生乳酸，為乳酸桿菌的定植提供生存環(huán)境[44]。這些都可能是麗珠腸樂組中乳酸桿菌豐度增多的原因，但仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Lv等[45]發(fā)現(xiàn)GQD與細(xì)胞死亡蛋白PD-1進(jìn)行聯(lián)合治療，可作為治療結(jié)直腸癌的一種新策略。Shao等[46]報(bào)道腸道中脆弱擬桿菌可改善炎癥引起的腸上皮損傷，預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)展。綜其所述表明GQD可能具有抗結(jié)直腸癌的作用，且GQD對腸道優(yōu)勢菌種的恢復(fù)能力明顯好于麗珠腸樂。該結(jié)果為本試驗(yàn)進(jìn)一步個(gè)性化研究標(biāo)記菌種指明了方向，以及為微生物制劑研發(fā)提供新思路。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過病理學(xué)及16S rRNA測序探討GQD治療 AAD的作用機(jī)制，通過腸道組織病理觀察發(fā)現(xiàn)GQD干預(yù)后結(jié)腸黏膜損傷好轉(zhuǎn)，表明GQD對AAD有明顯的療效。結(jié)合腸道菌群多樣性分析發(fā)現(xiàn) GQD能影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，在門水平，GQD可以改善厚壁菌門與擬桿菌門比例，顯著降低AAD大鼠腸道變形菌門相對豐度p<0.01），在屬水平顯著增加腸道中乳酸桿菌、擬桿菌相對豐度（p<0.01），提示GQD可能通過促進(jìn)腸道中優(yōu)勢菌種定植而抑制致病菌的繁殖，而該微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)的變化可能是GQD治療AAD的部分機(jī)制，其結(jié)果為該復(fù)方在臨床的合理應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步探索基于“中醫(yī)藥-腸道菌群”途徑治療疾病積累研究基礎(chǔ)。