肖陽，王永華，楊博*

（1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州510640）（3.廣東優(yōu)酶生物制造研究院有限公司，廣東佛山 528226）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）具有催化水解、酯化、酯交換等多種功能[1-3]和特異的底物選擇性、高效的催化效率等特性[4]，在造紙、油脂加工、制藥、皮革加工等工業(yè)領(lǐng)域廣泛利用[5]。目前，大多數(shù)已報道的脂肪酶均表現(xiàn)出對sn-1和sn-3位的偏好性，只有極少數(shù)來源于南極假絲酵母（Candida antarctica）、洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）和海洋放線菌（Streptomycessp.）W007[6]的脂肪酶表現(xiàn)出具有非區(qū)域選擇性[7]。來源于海洋放線菌（Streptomycessp.）W007的脂肪酶MAS1具有耐受甲醇及高溫等特點，可高效催化合成富含n-3 PUFA 甘油三酯[8-10]和生物柴油等[11-13]。徐婉莉等[11]利用固定化脂肪酶MAS1在叔丁醇體系中催化黑兵蠅幼蟲油甘油解形成月桂酸單甘酯，其底物轉(zhuǎn)化率最高為97.88%，月桂酸單甘酯的含量最高為70.8%。汪秀妹等[12]在真空環(huán)境下，利用固定化脂肪酶催化多不飽和脂肪酸與 sn-甘油-3-磷脂酰膽堿酯化成對人體具有多種益處的溶血卵磷脂，其sn-甘油-3-磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化率為 93.12%，溶血卵磷脂含量為 90.77 mol%。呂雯等[13]利用固定化脂肪酶MAS1酯化大豆油脫臭餾出物與甲醇形成生物柴油，生物柴油產(chǎn)率為97.08%。

目前，重組脂肪酶MAS1主要在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，藍(lán)東明等[14]通過共表達(dá)PDI、HAC1和免疫球蛋白結(jié)合蛋白的策略成功使 MAS1活力提高了1.7倍，隨后通過發(fā)酵條件優(yōu)化，最終在發(fā)酵144 h時，發(fā)酵液上清中酶活力達(dá)到440 U/mL。瞿曼等[15]通過單因素實驗優(yōu)化了畢赤酵母表達(dá)MAS1的誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)pH，并進(jìn)行了雙碳源流加策略的優(yōu)化，酶活力較原來提高了4.83倍。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有發(fā)酵周期短發(fā)酵成本低等優(yōu)點，以大腸桿菌作為脂肪酶MAS1異源表達(dá)系統(tǒng)有望滿足產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的不同需求，然而通過統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化的研究還鮮有報道。

統(tǒng)計學(xué)方法如響應(yīng)面、正交設(shè)計[16]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、支持向量機(jī)（Support Vector Machines，SVM）應(yīng)用于微生物發(fā)酵條件已證明具有十分重要的價值。名曉東等[17]用響應(yīng)面方法在搖瓶水平優(yōu)化了重組大腸桿菌產(chǎn)鹵代烷脫鹵酶培養(yǎng)基成分，優(yōu)化后的鹵代烷脫鹵酶酶活力比優(yōu)化前提高了 93.78%。Rani等[18]采用正交實驗優(yōu)化了擬根孢霉MTCC 1467產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵參數(shù)，優(yōu)化后木聚糖產(chǎn)率提高了 65.1%。然而微生物發(fā)酵過程是非線性的[19]，響應(yīng)面、正交試驗設(shè)計等得到的線性模型擬合效果較差，而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、SVM等算法因具有較強(qiáng)的非線性擬合能力而在發(fā)酵條件優(yōu)化中更有價值。Sathish等[20]用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法和遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）優(yōu)化了枯草芽孢桿菌RSP-GLU產(chǎn)谷氨酰胺酶發(fā)酵條件，將谷氨酰胺酶的產(chǎn)量提高了47%。

雖然神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法在發(fā)酵建模領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法仍然無法解決收斂速度慢、易陷入局部最小值等問題[21]；關(guān)于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的神經(jīng)元個數(shù)的選取也沒有特定的標(biāo)準(zhǔn)，因缺乏對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的了解，使得所建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型出現(xiàn)缺乏泛化能力和過擬合的問題[22]；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法對于數(shù)據(jù)樣本的大小也有一定的要求，當(dāng)數(shù)據(jù)樣本比較小時，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法擬合效果較差[19]?；诮Y(jié)構(gòu)風(fēng)險最小化的SVM利用簡單的統(tǒng)計學(xué)理論解決了上述問題，它的非線性擬合性更強(qiáng)，且更加適合小樣本數(shù)據(jù)模型的構(gòu)建[23]，可通過引入最小二乘法提高了模型的訓(xùn)練速度[24]，因而被廣泛應(yīng)用于數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建和自動控制等領(lǐng)域。Zhu等[25]通過粒子群優(yōu)化（Particle Swarm Optimization，PSO）算法優(yōu)化了基于最小二乘支持向量機(jī)（Least Squares Support Vector Machines，LSSVM）構(gòu)建的海洋溶菌酶發(fā)酵模型，將優(yōu)化后的模型進(jìn)行了廣義預(yù)測控制，將酶活性提高了20%，酶產(chǎn)率提高了30%。GA基于自然選擇和遺傳學(xué)的機(jī)制，通過計算機(jī)模擬選擇、交叉和變異的過程以求解優(yōu)化問題的最優(yōu)解，是一種集概率、隨機(jī)和引導(dǎo)搜索機(jī)制的優(yōu)化算法[26]。SVM和GA的結(jié)合，可通過SVM來描述各種因素間復(fù)雜的關(guān)系，在此基礎(chǔ)上用GA找出最優(yōu)解。Gao等[27]將SVM與實數(shù)編碼遺傳算法（Real-code Genetic Algorithm，RGA）相結(jié)合，成功使發(fā)酵過程中的青霉素滴度提高了22.88%。

目前，脂肪酶MAS1已被證明可以合成多種對人體有益的成分，例如具有殺菌功效的月桂酸單甘脂[11]和對人體有多種益處的溶血卵磷脂[12]等；在清潔能源領(lǐng)域，脂肪酶MAS1也可以催化油脂產(chǎn)業(yè)的廢料高效轉(zhuǎn)化成生物柴油[13]。因此脂肪酶MAS1在未來具有十分廣泛的應(yīng)用前景，但已報道的由畢赤酵母發(fā)酵的脂肪酶MAS1產(chǎn)量較低，難以滿足下游應(yīng)用行業(yè)的需求。為了降低生產(chǎn)成本和促進(jìn)脂肪酶MAS1的產(chǎn)業(yè)化，本研究利用大腸桿菌異源表達(dá)脂肪酶 MAS1，基于Box-Behnken實驗設(shè)計得到發(fā)酵數(shù)據(jù)，建立了重組大腸桿菌表達(dá)脂肪酶MAS1發(fā)酵模型。利用GA對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)pH和IPTG濃度等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得重組大腸桿菌高效表達(dá)MAS1的發(fā)酵條件，為重組脂肪酶工業(yè)化應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)，其建模和優(yōu)化流程如圖1所示。

圖1 MAS1發(fā)酵建模與優(yōu)化流程Fig.1 The flow chart of the MAS1 fermentation modeling and optimization

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

重組大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)/pET22b-MAS1由華南理工大學(xué)生物化工實驗室構(gòu)建和保藏。

1.1.2 生化試劑

酵母粉、蛋白胨購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨芐青霉素鈉購自生工生物工程（上海）股份有限公司；橄欖油購自上海麥克林試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

7 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；H1850R臺式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；ZHSY-50WE水浴恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；IS-A疊加式恒溫振蕩器，蘇州捷美電子有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱，中儀國科（北京）科技有限公司；UV-8000型雙光束紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（1 L）：5 g酵母粉、10 g胰蛋白胨、10 g NaCl、18 g瓊脂粉，補加終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素鈉。

搖瓶種子液培養(yǎng)基（1 L）：5 g酵母粉、10 g胰蛋白胨、10 g NaCl，補加終濃度為100 μg/mL氨芐青霉素鈉。

發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：10 g無水葡萄糖（單獨滅菌），11.5 g酵母粉，19.5 g蛋白胨，4 g (NH4)2SO4、0.94 g一水檸檬酸，18 g K2HPO4·3H2O，3 g KH2PO4，1.2 g MgSO4（單獨滅菌），微量元素1 mL。

微量元素溶液（1 L）：2.8 g FeSO4·7H2O、1.71 g MnSO4·H2O、2.8 g CoSO4·7H2O、1.13 g CaCl2、0.2 g CuCl2·2H2O、0.14 g ZnCl2。

1.2 方法

1.2.1 OD600檢測

將取得的發(fā)酵液用純水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，于UV-8000紫外分光光度計下測定其吸光度。

1.2.2 種子液制備方法

將保藏于-80 ℃冰箱的BL21(DE3)/pET22b-MAS1活化于含100 μg/mL氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。接種單菌落到5 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。將上述的培養(yǎng)液按1%（V/V）的接種量接種至含有150 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，OD600=3~6。

1.2.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

7 L發(fā)酵罐裝液量為3 L，接種量為5%（V/V），分批培養(yǎng)溫度為37 ℃，通氣量為3 L/min，發(fā)酵過程中溶氧不低于20%，流加氨水調(diào)節(jié)pH值為7.0。分批培養(yǎng) 4 h后開始流加葡萄糖，葡萄糖流速控制在12.5 g/h。在對數(shù)生長期添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），發(fā)酵22 h時停止補料。誘導(dǎo)階段每3 h取樣，測定細(xì)胞濕重和酶活。誘導(dǎo)時間分別設(shè)置為對數(shù)生長前期（2 h）、對數(shù)生長中期（4 h）、對數(shù)生長后期（7 h）；誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為 15、20、25、30和37 ℃；誘導(dǎo)pH值分別設(shè)置為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；IPTG終濃度分別設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L。

1.2.4 細(xì)胞破碎

取15 mL發(fā)酵液，于4 ℃、8 000 r/min下離心5 min，倒掉上清液。菌體用等體積 pH值 7.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液重懸，隨后再次離心，重復(fù)兩次后，用15 mL pH值7.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體，于200 W下超聲破壁15 min。將破碎液于4 ℃、8 000 r/min離心5 min，所得上清液即為MAS1粗酶液。

1.2.5 MAS1水解酶活檢測

稱取4 g橄欖油乳化液于50 mL具塞三角瓶當(dāng)中，隨后加入5 mL 20 mmol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液，設(shè)置一個空白組和三個平行組。向空白組中加入15 mL無水乙醇，與平行組放置于65 ℃、150 r/min的水浴鍋中預(yù)熱 5 min。隨后向反應(yīng)體系中加入稀釋適當(dāng)倍數(shù)的1 mL酶液，反應(yīng)10 min，平行組分別加入15 mL無水乙醇將酶液滅活。待冷卻到室溫之后，用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定，并記錄滴定體積。水解酶活計算方法如下：

式中：

X：樣品的酶活力，U/mL；

V1：滴定樣品所用NaOH的體積，mL；

V2：滴定空白時所消耗的NaOH的體積，mL；

c：滴定所用NaOH的體積，mL;

50：0.05 mol/L的NaOH溶液1.00 mL相當(dāng)于脂肪酶50微摩爾;

10：反應(yīng)時間，min；

n1：稀釋倍數(shù)。

1.2.6 發(fā)酵液中菌體濕重的測定

取2 mL發(fā)酵過程中的發(fā)酵液于4 ℃、12 000 r/min下離心3 min，去上清，所得菌體于分析天平上稱重，重復(fù)測三次。

1.2.7 實驗設(shè)計與預(yù)測模型的建立

本文采用R語言rsm包設(shè)計Box-Behnken實驗，采用MATLAB 2020a軟件的LIBSVM 和LIBSVMFaruto Ultimate工具箱構(gòu)建SVM模型。在構(gòu)建模型的過程中，以誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)物IPTG終濃度作為自變量，以發(fā)酵液中MAS1酶活力作為因變量構(gòu)建SVM模型，使用從實驗中收集的發(fā)酵數(shù)據(jù)訓(xùn)練出該模型，以獲得BL21(DE3)/pET22b-MAS1的發(fā)酵預(yù)測模型。

1.2.7.1 BL21(DE3)/pET22b-MAS1生長曲線的繪制

將BL21(DE3)/pET22b-MAS1按方法1.2.3于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中不誘導(dǎo)，每隔1 h取發(fā)酵液樣品，按方法1.2.1測OD600。

1.2.7.2 單因素試驗設(shè)計

以BL21(DE3)/pET22b-MAS1為出發(fā)菌株，以誘導(dǎo)溫度（15、20、25、30、37 ℃）、誘導(dǎo)pH值（6、6.5、7、7.5、8）和 IPTG 濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）為單因素進(jìn)行試驗。

1.2.7.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計

采用R語言rsm包設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面實驗，以1.2.7.2三因素得到最優(yōu)水平為基礎(chǔ)，設(shè)計三因素三水平試驗設(shè)計表。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.2.7.4 SVM最優(yōu)c值和g值的確定

在SVM模型構(gòu)建過程中，有兩個參數(shù)的選擇會影響到SVM模型的精度，一個是懲罰系數(shù)c值，另一個參數(shù)為SVM徑向基核函數(shù)g值。c值過大或過小會造成模型泛化能力的減弱，g值的大小會影響到支持向量的數(shù)目，進(jìn)而影響到支持向量機(jī)的訓(xùn)練與預(yù)測的速度[28]。本研究采用了 MATLAB 2020a的LIBSVM-FarutoUltimate工具箱的SVMcgForClass函數(shù)對SVM模型的c值和g值求最優(yōu)解。為了約束尋優(yōu)范圍，將c值和g值的范圍約束在-2~2之間。

1.2.7.5 SVM模型的構(gòu)建

使用MATLAB 2020a的LIBSVM工具箱進(jìn)行模型的構(gòu)建。將Box-Behnken實驗得到的數(shù)據(jù)隨機(jī)劃分為2組，分為訓(xùn)練集和測試集。訓(xùn)練集包含12組數(shù)據(jù)用以訓(xùn)練SVM模型，測試集包含3組數(shù)據(jù)用以驗證SVM模型。其關(guān)鍵參數(shù)c和g值采用1.2.7.4得到的最優(yōu)結(jié)果。由于本研究構(gòu)建的模型為支持向量回歸模型，因此”-S”參數(shù)選擇3，p設(shè)為0.1，考慮到變量較多，故核函數(shù)選擇了徑向基核函數(shù)。

1.3 GA求解SVM模型的最優(yōu)解

采用MATLAB 2020a的GA工具箱對上述構(gòu)建好的SVM 模型求其最優(yōu)解。遺傳算法的初始種群設(shè)置為50，交叉概率為0.8，終止代數(shù)為100，以1.2.7.5得到的SVM模型作為適應(yīng)度函數(shù)，以1.2.7.2得到的單因素實驗數(shù)據(jù)所確定的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo) pH值及IPTG濃度的水平作為變量范圍，其余為默認(rèn)參數(shù)，通過選擇、變異、交叉操作進(jìn)行參數(shù)尋優(yōu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上實驗均設(shè)置3組平行，采用Microsoft Excel 2019軟件計算所有數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 2018軟件作圖，R語言進(jìn)行分析，顯著性水平p＜0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 BL21(DE3)/pET22b-MAS1生長曲線的繪制

由圖2可知，BL21(DE3)/pET22b-MAS1的對數(shù)生長前期、中期、后期分別為發(fā)酵2 h、4 h、7 h左右。

圖2 BL21(DE3)/pET22b-MAS1的生長曲線Fig.2 Growth curve of BL21(DE3)/pET22b-MAS1

2.2 誘導(dǎo)時間對BL21(DE3)/pET22b-MAS1產(chǎn)MAS1的影響

Seyfi等[29]在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中用大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)生產(chǎn)重組蝎蛋白時，分別在對數(shù)生長前期、對數(shù)生長中期和對數(shù)生長后期進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在對數(shù)生長前期和中期蛋白含量表達(dá)不高，但在對數(shù)生長后期進(jìn)行誘導(dǎo)時，重組蝎蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大，為 3.5 g/L。因此分別選擇了在BL21(DE3)/pET22b-MAS1的對數(shù)生長前期（2 h）、對數(shù)生長中期（4 h）和對數(shù)生長后期（7 h）添加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以探究不同對數(shù)生長時期誘導(dǎo)對BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵表達(dá)MAS1的影響。

由圖3a和圖3c可知，在對數(shù)生長前期和中期進(jìn)行誘導(dǎo)，最大細(xì)胞濕重分別只能達(dá)到76.31和95.33 g/L，均低于在對數(shù)生長后期誘導(dǎo)達(dá)到的最大細(xì)胞濕重141.27 g/L。同時葡萄糖的積累量隨著發(fā)酵時間的延長也在快速增長，在發(fā)酵至22 h時，在對數(shù)生長前期誘導(dǎo)和對數(shù)生長中期誘導(dǎo)時葡萄糖分別積累至38.61 g/L和28.93 g/L，可能是在對數(shù)生長前期和中期進(jìn)行誘導(dǎo)時，細(xì)胞生物量未達(dá)到足夠高的密度，部分細(xì)胞未形成完整的碳鏈骨架，此時添加IPTG會影響細(xì)胞正常的生理功能，造成細(xì)胞代謝活力下降，對葡萄糖的利用率降低，造成未代謝的葡萄糖在發(fā)酵液中大量積累。如圖3b，在對數(shù)生長后期進(jìn)行誘導(dǎo)，有利于BL21(DE3)/pET22b-MAS1細(xì)胞的生長和目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)發(fā)酵至13 h，此時酶活力達(dá)到了1 733.33 U/mL，比對數(shù)生長前期和對數(shù)生長中期誘導(dǎo)分別提高了153.66%和77.47%。結(jié)果表明，在BL21(DE3)/pET22b-MAS1對數(shù)生長后期進(jìn)行誘導(dǎo)可以提高M(jìn)AS1的表達(dá)水平。

圖3 誘導(dǎo)時間對BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵過程的影響Fig.3 The effect of induction time on the fermentation process of BL21(DE3)/pET22b-MAS1

2.3 誘導(dǎo)物 IPTG濃度對于 BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)MAS1的影響

IPTG作為乳糖的類似物，在重組大腸桿菌表達(dá)外源蛋白過程當(dāng)中具有十分重要的作用。其濃度的高低可以影響到重組大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的效率。舒暢等[30]利用大腸桿菌 BL21(DE3)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶時，分別添加終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度為0.6 mmol/L時，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶比酶活達(dá)到最大，為1.32 U/mg。本實驗在25 ℃、pH值7.0、對數(shù)生長后期誘導(dǎo)的條件下，分別添加終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L的 IPTG，探究了不同誘導(dǎo)濃度對 BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)MAS1的影響。由圖4a、4b和4c可知，隨著IPTG濃度的增大，對細(xì)胞生長的抑制作用增強(qiáng)，當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol/L時，最大細(xì)胞濕重只達(dá)到99.81 g/L，葡萄糖積累量也隨時間的增加而迅速增長至31.41 g/L。而在0.2 mmol/L條件下，最大細(xì)胞濕重可達(dá)122.51 g/L，酶活力最高為936.67 U/mL，葡萄糖積累量呈現(xiàn)平穩(wěn)增長趨勢，發(fā)酵至22 h時，殘?zhí)橇繛?0.36 g/L。當(dāng)IPTG濃度為0.6 mmol/L時，發(fā)酵13 h酶活力達(dá)到了最大，為2 063.47 U/mL。這一結(jié)果表明IPTG誘導(dǎo)物為0.6 mmol/L有利于MAS1的表達(dá)。

圖4 IPTG濃度對于BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵過程的影響Fig.4 The influence of IPTG concentration on the fermentation process of BL21(DE3)/pET22b-MAS1

2.4 誘導(dǎo)pH值對于BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)MAS1的影響

pH值作為發(fā)酵過程當(dāng)中重要的參數(shù)，它可以影響到重組大腸桿菌細(xì)胞的生長和蛋白的表達(dá)。當(dāng)外部環(huán)境的pH值發(fā)生變化時會造成細(xì)胞內(nèi)部的pH值也發(fā)生改變，從而影響到細(xì)胞內(nèi)部分代謝酶的活性進(jìn)而造成細(xì)胞內(nèi)部生理狀態(tài)的改變，因此維持發(fā)酵過程當(dāng)中的pH值恒定對于發(fā)酵具有十分重要的意義[31]。Shahzadi等[32]在優(yōu)化大腸桿菌產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵條件時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)pH值大于或小于7時，重組纖維素酶表達(dá)量都會降低，可見誘導(dǎo)pH值對重組菌表達(dá)蛋白具有重要的影響。分別控制誘導(dǎo)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，探究了不同pH值下BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵表達(dá)MAS1的影響。由圖5a、5b和5c可知，當(dāng)誘導(dǎo)pH值為6.5時，細(xì)胞濕重和酶活力均達(dá)到最大，分別為 146.83和2 103.69 U/mL，葡萄糖的積累速率顯著慢于其他誘導(dǎo)pH值下葡萄糖的積累速率，發(fā)酵至22 h時，葡萄糖殘余含量僅為11.63 g/L。當(dāng)pH值為6.0和7.0時，最大細(xì)胞濕重分別為93.5 g/L和113.5 g/L，最大酶活力分別為688.42 U/mL和1 909.58 U/mL，均顯著低于pH值6.5條件下的最大細(xì)胞濕重和最大酶活力。于此同時pH值6.0條件下，葡萄糖快速積累，發(fā)酵至22 h時葡萄糖殘余含量為31.34 g/L。這一結(jié)果說明誘導(dǎo)pH值為6.5時更有利于BL21(DE3)/ pET22b-MAS1表達(dá)MAS1。

圖5 誘導(dǎo)pH對BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵過程的影響Fig.5 The effect of induced pH on the fermentation process of BL21(DE3)/pET22b-MAS1

2.5 誘導(dǎo)溫度對于 BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)MAS1的影響

溫度對于大腸桿菌的生長和外源蛋白的表達(dá)具有重要的影響，較高的溫度有利于大腸桿菌的生長，較低的溫度有利于大腸桿菌表達(dá)外源蛋白[33]。因此，常見的大腸桿菌發(fā)酵控溫工藝，多采用在生長階段維持較高的溫度，而在誘導(dǎo)階段維持較低的溫度。另外，低溫條件下誘導(dǎo)可以提高質(zhì)粒在大腸桿菌中的穩(wěn)定性[31]。Liang等[34]在探究重組大腸桿菌產(chǎn)丙酮酸氧化酶變溫發(fā)酵策略時，發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)溫度為 37 ℃時，大腸桿菌生長速度最快，但丙酮酸氧化酶活性僅為890 U/L，而誘導(dǎo)溫度分別為28 ℃和32 ℃時，丙酮酸氧化酶活性達(dá)到1 099 U/L和1 189 U/L。本研究在對數(shù)生長后期添加0.6 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)pH維持6.5條件下，分別維持誘導(dǎo)溫度為15、20、25、30、37 ℃。由圖6b可知，最佳誘導(dǎo)溫度為20 ℃，酶活達(dá)到最高為2 011.56 U/mL。如圖6a和6c，當(dāng)溫度逐漸升高時，BL21(DE3)/pET22b-MAS1最大濕重是逐漸增長的，在25 ℃下培養(yǎng)時細(xì)胞濕重最大為126.67 g/L，但是超過 25 ℃時，最大濕重呈現(xiàn)下降的趨勢；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37 ℃時，最大細(xì)胞濕重僅為88.36 g/L，且葡萄糖積累的速率開始加快，發(fā)酵至22 h時，發(fā)酵液中的葡萄糖含量積累至 44.5 g/L，同時最大酶活力也僅為110.6 U/mL，可能是因為在高于 25 ℃誘導(dǎo)時BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)蛋白質(zhì)和生長速度快，這增加了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)。Paul等[35]發(fā)現(xiàn)較高溫度下誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)麥芽糊精葡萄糖苷酶會產(chǎn)生較多包涵體，從而導(dǎo)致大腸肝菌生長速率的下降。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為15 ℃時，最大濕重僅為85.61 g/L，僅為20 ℃誘導(dǎo)下最大濕重的72.55%，說明誘導(dǎo)溫度過低時不利于BL21(DE3)/pET22b-MAS1的生長，發(fā)酵至22 h時，發(fā)酵液中的葡萄糖殘余含量為44.2 g/L，且最大酶活為 873.74 U/mL。這一結(jié)果說明，低溫有利于BL21(DE3)/pET22b-MAS1表達(dá)MAS1，但是溫度過低則會導(dǎo)致BL21(DE3)/pET22b-MAS1生長受到抑制并且影響到MAS1的表達(dá)。

圖6 誘導(dǎo)溫度對BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵過程的影響Fig.6 The influence of induction temperature on the fermentation process of BL21(DE3)/pET22b-MAS1

2.6 SVM模型的構(gòu)建

利用R語言的rsm包設(shè)計了Box-Behnken實驗方案，隨后依據(jù)Box-Behnken實驗方案得到了對應(yīng)的數(shù)據(jù)。利用MATLAB 2020a軟件的Mapminmax函數(shù)對Box-Behnken實驗方案結(jié)果進(jìn)行歸一化處理，然后用randperm隨機(jī)函數(shù)將數(shù)據(jù)集隨機(jī)分為兩組，其中測試集函數(shù)由12組實驗數(shù)據(jù)構(gòu)成，測試集由3組實驗數(shù)據(jù)構(gòu)成。通過 MATLAB 2020a軟件的 LIBSVMFarutoUltimate工具箱的SVMcgForClass函數(shù)對SVM模型的c值和g值進(jìn)行尋優(yōu)，確定c值和g值分別為1.5157和0.33。隨后使用MATLAB 2020a的Libsvm工具箱構(gòu)建 BL21(DE3)/pET22b-MAS1產(chǎn) MAS1的SVM模型。由表2和表3可知，訓(xùn)練集的平均相對誤差為4.26%，測試集的平均相對誤差為3.32%，綜合訓(xùn)練集和測試集誤差來看，SVM模型預(yù)測結(jié)果與實驗結(jié)果平均相對誤差為4.07%，擬合效果較好。

表2 SVM模型訓(xùn)練數(shù)據(jù)樣本設(shè)計與實驗結(jié)果Table 2 SVM model training data sample design and experimental results

表3 SVM模型測試數(shù)據(jù)樣本設(shè)計與實驗結(jié)果Table 3 SVM model testing data sample design and experimental results

2.7 GA尋優(yōu)

從MATLAB 2020a軟件的GA工具箱對SVM模型尋優(yōu)結(jié)果（如圖7）來看，當(dāng)?shù)?6代時，GA找到了最優(yōu)結(jié)果：BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵產(chǎn)MAS1的最佳發(fā)酵條件為誘導(dǎo)pH值6.73、誘導(dǎo)溫度22.923 ℃、誘導(dǎo)物IPTG濃度0.648 mmol/L，預(yù)測此時MAS1的酶活達(dá)到了最大為2 276.99 U/mL。

圖7 遺傳算法尋優(yōu)結(jié)果圖Fig.7 Genetic algorithm optimization result graph

2.8 模擬結(jié)果的驗證

對SVM和GA得到的BL21(DE3)/pET22b-MAS1發(fā)酵產(chǎn)MAS1的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵驗證，設(shè)置誘導(dǎo)pH值6.7、誘導(dǎo)溫度23 ℃、誘導(dǎo)物IPTG濃度為0.65 mmol/L，重復(fù)三次，實驗結(jié)果分別為2 310.32、2 307.44、2 330.29 U/mL。圖8的電泳結(jié)果表明了該策略具有可行性。王鮮芳等[36]將用SVM建立了谷氨酸動態(tài)時變發(fā)酵模型，用免疫遺傳算法（Immune Genetic Algorithm，IGA）對一些關(guān)鍵操作變量進(jìn)行了優(yōu)化，在發(fā)酵28 h時谷氨酸濃度達(dá)到了12.05 g/L，比未優(yōu)化前提高了29.57%。Zhang等[37]用SVM建立了以纖維素乙醇廢水為原料紅酵母發(fā)酵模型，采用 GA對SVM模型尋優(yōu)，最終將生物量和脂質(zhì)分別提升至11.87和2.18 g/L。說明了SVM-GA算法可在發(fā)酵條件優(yōu)化中良好應(yīng)用。

圖8 MAS1的SDS-PAGE檢測Fig.8 SDS-PAGE detection of MAS1

3 結(jié)論

本研究通過對BL21(DE3)/pET22b-MAS1產(chǎn)MAS1的發(fā)酵條件進(jìn)行模型構(gòu)建，使用 GA對三個重要的發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明，通過SVM-GA優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為誘導(dǎo)pH值6.7、誘導(dǎo)溫度23 ℃、誘導(dǎo)物IPTG濃度為0.65 mmol/L，優(yōu)化后MAS1酶活力達(dá)到了2 316.02 U/mL，較優(yōu)化前提高了33.61%。本研究通過一系列的發(fā)酵條件優(yōu)化，MAS1的發(fā)酵表達(dá)水平有了明顯的提高，豐富了MAS1發(fā)酵條件優(yōu)化的手段。目前在發(fā)酵罐進(jìn)行的發(fā)酵條件優(yōu)化限于誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)物IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度，后續(xù)可進(jìn)行補料策略的優(yōu)化以進(jìn)一步提升MAS1的表達(dá)水平，為實現(xiàn)MAS1的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。