張益萌，楊瀚毅，寧佳怡，閆小龍，韓 靜

0 引言

作為成人最常見的眼內(nèi)腫瘤，脈絡膜黑色素瘤(choroidal melanoma, CM)的發(fā)病率僅低于視網(wǎng)膜母細胞瘤，是位居眼內(nèi)腫瘤發(fā)病率第二位的惡性腫瘤[1]。CM病情復雜，惡性程度高，預后極差，易通過血行轉(zhuǎn)移累及肝臟，由于缺乏特異的治療手段，導致患者的長期生存率較低[2-4]。目前臨床上針對CM患者的主要治療手段包括激光療法、放射治療、眼球摘除術等[4-5]。值得指出的是，出于降低腫瘤細胞轉(zhuǎn)移率和提高患者生存率等方面的考慮，過去對CM的治療常采用眼球摘除術，但并未明顯降低CM轉(zhuǎn)移率以及患者生存率[6-8]，并且其作為一種破壞性手術，給患者帶來了極大的身心影響。因此，在保留眼球和視力的前提下，探尋有效提高CM患者生存率，且無創(chuàng)傷的治療方法成為了目前亟需解決的問題。組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)是一種酰胺水解酶，通過調(diào)控組蛋白賴氨酸位點的乙?；腿ヒ阴；瘎討B(tài)平衡參與染色質(zhì)結構修飾和基因表達。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞中HDAC過度激活，使組蛋白去乙?；鰪?，在腫瘤細胞凋亡、增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用[9-10]。因此，HDAC成為了研究抗癌藥物的重要靶點。HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitors, HDACi)通過改變組蛋白和非組蛋白的乙酰化狀態(tài)，誘導腫瘤細胞的凋亡、分化、抑制細胞增殖，從而表現(xiàn)出抗癌活性[11-15]。作為HDACi的重要代表之一，辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA)已經(jīng)在臨床用于治療皮膚T細胞淋巴瘤[10]。同時，研究表明SAHA在多種腫瘤模型中都能夠通過單一或聯(lián)合用藥發(fā)揮有效的抗腫瘤作用[11]。成纖維細胞生長因子18(fibroblast growth factor 18，F(xiàn)GF18)參與了細胞分化，血管形成，關節(jié)軟骨的修復，同時已有證據(jù)表明，F(xiàn)GF18在腫瘤細胞增殖以及促遷移和侵襲能力方面發(fā)揮重要作用[16]。本研究旨在探討SAHA對CM細胞系C918細胞增殖的影響以及對FGF18的調(diào)控作用，進一步闡明CM的發(fā)病機制，并為SAHA治療CM提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞培養(yǎng)C918細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10U/mL青、鏈霉素雙抗的DMEM高糖(Corning, USA)培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞(細胞增殖至85%左右)，棄舊培養(yǎng)基，PBS涮洗3遍，加入胰蛋白酶進行消化傳代。

1.1.2主要試劑脈絡膜黑色素瘤細胞系C918購自湖南豐暉生物科技有限公司；青鏈霉素購自上海格來賽生命科技有限公司；胎牛血清購自以色列Biond Biologics公司；β-actin單克隆抗體、c-Myc抗體、CDK2抗體、CyclinA2抗體和FGF18抗體購自CST公司；SAHA購自MedChemExpress(Monmouth Junction, NJ, USA)；BeyoClickTMEdU-594試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；增強型細胞活力檢測試劑盒(CCK-8)購自上海七星復泰生物科技有限公司；DMSO購自天津市富宇精細化工有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞形態(tài)學觀察將C918細胞接種于培養(yǎng)皿中，隨機分為空白對照組、SAHA 0.625、1.25、2.5μmol/L組。觀察細胞的貼壁率及細胞形態(tài)，當細胞貼壁后按照藥物梯度分別處理48h，利用倒置熒光顯微鏡觀察各培養(yǎng)皿內(nèi)細胞形態(tài)的變化。

1.2.3細胞平板克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力用胰蛋白酶消化C918細胞，低速常溫離心收集細胞沉淀，加入培養(yǎng)基吹打混勻，進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，倍比稀釋至1×103/mL，將混勻的細胞懸液接種于培養(yǎng)板中。待細胞生長穩(wěn)定后，加入SAHA 1.25μmol/L處理48h，空白對照組加入同等量的DMSO。48h后，換用新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞14d。每孔加入4%多聚甲醛1mL，固定細胞15min，去除固定液，加入適量結晶紫染液30min，然后用水沖洗，放置常溫干燥。用Image J計克隆數(shù)，計算克隆形成率。

1.2.4EdU染色法檢測細胞增殖取對數(shù)生長周期的C918細胞，常規(guī)操作，消化細胞，制成單細胞懸液，以8×104個/皿接種于共聚焦皿中。細胞培養(yǎng)過夜或狀態(tài)穩(wěn)定后，加入SAHA 1.25μmol/L處理48h，空白對照組加入同等量的DMSO。稀釋EdU原液，每孔加100μL 50μmol/L EdU培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中孵育2h，棄舊培養(yǎng)基，PBS洗細胞3次。加入4%多聚甲醛固定，30min后棄固定液。每孔加入0.3% Triton X-100 100μL，室溫處理15min。配制Click反應液，室溫避光孵育35min。棄反應液，1mL的PBS洗3次。制備適量1000×Hoechst 33342反應液，避光保存。每孔加入100μL 1× Hoechst 33342反應液，避光、室溫、孵育35min后，棄結晶紫染色反應液，每孔加入1mL的PBS洗3次。

1.2.5細胞蛋白質(zhì)提取和定量收集培養(yǎng)48h的各組C918細胞，冰板上操作，倒干培養(yǎng)基，預冷的PBS洗3遍，用負壓吸引器將PBS吸凈。每皿加入約200μL裂解液，收集細胞裂解液于1.5mL離心管中，4℃裂解20min，在低溫高速離心機中4℃ 12 000r/min離心20min，取上清液用BCA法行蛋白定量，加入5×loading buffer煮沸8min。

1.2.6Westernblot檢測蛋白表達每孔上樣相同蛋白量，置于電泳緩沖液中電泳，電泳結束后，采用恒壓90V濕轉(zhuǎn)90min，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫下?lián)u床慢速封閉2h，將目的條帶切下，置于相應一抗中并在4℃下孵育過夜。第2d用TBS緩沖液(TBST)漂洗PVDF膜3次，每次10min。室溫下?lián)u床孵育二抗120min，采用Bio-Rad ChemiDocXRS+化學發(fā)光儀進行灰度值檢測，用Image Lab軟件統(tǒng)計各目的蛋白的相對表達。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。

2 結果

2.1SAHA呈濃度依賴性降低C918細胞活力空白對照組C918細胞形態(tài)呈梭形，48h后細胞密度達到90%(圖1A)。給予不同濃度SAHA藥物處理48h后，C918細胞表現(xiàn)出不同程度的形態(tài)學改變，表現(xiàn)為細胞皺縮變形，且細胞貼壁不良、生長顯著受到抑制，細胞密度逐漸減小，該作用隨藥物濃度的升高更為明顯(圖1B～D)。當藥物濃度增加到2.5μmol/L時，細胞出現(xiàn)明顯死亡(圖1D)。CCK-8檢測結果顯示，空白對照組、SAHA 0.625μmol/L組、SAHA 1.25μmol/L組、SAHA 2.5μmol/L組C918細胞存活率分別為(100±7)%、(77±10)%、(58±12)%、(22±14)%。與空白對照組相比，SAHA呈濃度依賴性地抑制C918細胞活力(均P<0.05)，藥物濃度為2.5μmol/L時抑制率達80%。

圖1 不同濃度SAHA對C918細胞形態(tài)和活力的影響 A：空白對照組；B：SAHA 0.625μmol/L組；C：SAHA 1.25μmol/L組；D：SAHA 2.5μmol/L組。

2.2SAHA呈濃度依賴性降低C918細胞增殖相關蛋白的表達SAHA可呈濃度依賴性地降低C918細胞中增殖相關蛋白c-Myc以及細胞周期蛋白CyclinA2和CDK2的表達(圖2)，與空白對照組(100.00±0.00)%相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當SAHA濃度為0.625μmol/L時，將c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對表達量分別降低到(67.33±2.08)%、(71.66±1.52)%和(75.00±5.00)%；當SAHA濃度為1.25μmol/L時，c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對表達量分別降低到(45.67±1.52)%、(42.67±4.04)%和(52.33±2.52)%；而當SAHA濃度為2.5μmol/L時，其抑制作用最明顯，c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白相對表達量分別降低到(29.00±2.53)%、(28.00±6.69)%和(35.00±5.00)%。

圖2 SAHA作用下C918中細胞增殖相關蛋白的表達 c-Myc、CyclinA2和CDK2的蛋白表達檢測條帶。

2.3SAHA可降低C918細胞EdU染色和細胞集落形成能力SAHA濃度為1.25μmol/L時，可將EdU染色陽性細胞數(shù)比例降低到(13.80±4.50)%，與空白對照組的陽性比例(34.80±1.64)%相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3A。同時，細胞克隆實驗顯示，與空白對照組(142.67±8.74)%相比，1.25μmol/L SAHA組(49.33±14.76)%細胞克隆數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3B。

圖3 SAHA對C918細胞EdU染色和細胞克隆的影響 A：EdU染色圖；B：細胞克隆實驗圖。

2.4SAHA呈濃度依賴性抑制C918細胞中HDAC7和FGF18表達Western blot結果顯示，與空白對照組相比，隨著SAHA處理濃度的增加，C918細胞中HDAC7和FGF18蛋白相對表達量顯著降低，見圖4。當SAHA濃度為0.625μmol/L時，HDAC7和FGF18蛋白相對表達量分別下降到(75.67±1.53)%和(75.00±4.36)%，與空白對照組(100.00±0.00)%比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當SAHA濃度為1.25μmol/L時，HDAC7和FGF18蛋白相對表達量分別下降到(46.67±3.61)%和(55.67±6.44)%，與空白對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；當SAHA濃度為2.5μmol/L時，HDAC7和FGF18蛋白相對表達量分別下降到(30.33±5.14)%和(41.67±7.97)%，與空白對照組比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖4 不同濃度SAHA對HDAC7和FGF18蛋白表達量的影響HDAC7和FGF18的蛋白表達檢測條帶。

3 討論

作為成人發(fā)病率最高的眼內(nèi)腫瘤，大多數(shù)的CM患者被診斷時已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，其中以肝轉(zhuǎn)移最為常見[17-18]。目前CM治療缺乏特異性強的化療策略[19]，臨床治療采用的腫瘤手術切除常需聯(lián)合眼球摘除，創(chuàng)傷大，但卻很難有效降低其復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率，同時對患者的心理和遠期生存質(zhì)量均會產(chǎn)生極大負面影響。因此，對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)并對其生長進行阻斷是降低腫瘤復發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，以及提高患者生存率的重要因素。

SAHA作為經(jīng)典的HDACi之一，能夠在對正常細胞幾乎沒有毒性作用的濃度下發(fā)揮有效的抗腫瘤效應。同時，研究證明SAHA能抑制耐藥性黑色素瘤生長[20-21]。另外，已有研究指出HDACi能抑制非小細胞肺癌A549、H1299細胞系的增殖。惡性腫瘤細胞最主要的危害是具有無限增殖的潛能。而SAHA在多種惡性腫瘤中都表現(xiàn)出了較強的抑制腫瘤生長的作用[22-24]，然而其在CM細胞中是否具有抑制細胞生長的作用并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，SAHA對C918細胞增殖具有明顯的抑制作用，且SAHA濃度介于0.625～2.5μmol/L，該藥物隨著濃度的增加抑制作用也增強，這與其在肺癌腫瘤中的作用相一致。以上結果表明，SAHA在CM細胞系C918細胞中發(fā)揮明顯的抑制細胞增殖的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，HDAC7在多種腫瘤中均能起到促進腫瘤細胞增殖的作用[25-28]，且該作用與上調(diào)FGF18信號通路相關。而FGF18在細胞分化和生長，炎癥反應，組織修復，血管新生，骨骼生長以及腫瘤細胞增殖中扮演了重要角色[29-34]。作為HDAC家族抑制劑，SAHA抑制C918細胞增殖的作用是否與調(diào)節(jié)HDAC7/FGF18信號有關還不清楚。此外，以往研究表明，在肺癌中SAHA能夠通過抑制HDAC降低c-Myc和CyclinA2的表達，發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。本實驗結果也顯示，SAHA處理的C918細胞中c-Myc和CyclinA2的表達顯著降低；同時，細胞周期蛋白CDK2的表達也隨之降低。更為重要的是，SAHA還能夠濃度依賴性抑制HDAC7和FGF18在C918細胞中的表達。以上實驗結果表明，SAHA能夠通過抑制HDAC7/FGF18信號，降低增殖相關蛋白c-Myc、細胞周期蛋白CyclinA2、CDK2的表達。

綜上所述，本實驗探討了SAHA對C918細胞增殖影響的相關機制，證明SAHA能夠通過調(diào)控HDAC7/FGF18信號抑制C918細胞增殖，這為SAHA應用于CM患者臨床治療提供了一定的理論依據(jù)。需要指出的是本次研究仍有一定的局限性，由于本研究只采用了一種CM細胞系，故此次研究結論對其他CM細胞系是否可以推廣暫不能確定。因此SAHA對其他CM細胞系的增殖、代謝、轉(zhuǎn)移等相關生物學功能的影響及機制研究將是我們要進一步探討的問題。