方 芳，何雨芯，趙巨堂，胡夢(mèng)偉，聶少平，謝明勇，胡婕倫

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（南昌），江西省生物活性多糖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）又稱(chēng)南美藜、印第安麥、奎藜等，是一種原產(chǎn)于南美的莧科藜亞科藜屬植物，起源于南美洲安第斯山脈地區(qū)，種植歷史悠久，被稱(chēng)為“糧食之母”和“安第斯山的黃金‘谷物’”[1]。藜麥的主要產(chǎn)區(qū)位于秘魯、玻利維亞和厄瓜多爾等中高海拔地區(qū)[2]，我國(guó)藜麥主要種植在青藏高原、云貴高原、西北地區(qū)等[3]。藜麥作為一種全營(yíng)養(yǎng)“偽谷物”，含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)、比例均衡的氨基酸，因此深受消費(fèi)者喜愛(ài)[4]，此外，藜麥還含有膳食纖維、皂苷、植物甾醇、酚類(lèi)物質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素[5-10]，聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織報(bào)告[11]指出藜麥?zhǔn)俏ㄒ灰环N滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的單體植物。

大量研究表明，腸道微生態(tài)失衡將會(huì)導(dǎo)致一系列代謝疾病[12]，如肥胖、糖尿病、炎癥性腸病等，而腸道菌群在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)方面發(fā)揮著無(wú)可替代的作用[13]。腸道菌群是人體胃部以及腸道部位中微生物的總稱(chēng)[14-15]，以厚壁菌門(mén)（60%～80%）和擬桿菌門(mén)（20%～40%）為主[16]。腸道菌群會(huì)隨飲食習(xí)慣而改變，并隨時(shí)間推移穩(wěn)定存活于宿主體內(nèi)[17]。近年來(lái)，眾多研究表明藜麥具有抗氧化[18]、預(yù)防肥胖[19]、緩解炎癥[20]、調(diào)節(jié)血糖水平[21]以及改善腸道菌群[22]等作用，而這與藜麥所含的營(yíng)養(yǎng)成分息息相關(guān)，以干質(zhì)量計(jì)算，藜麥中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為52%～69%[2]，膳食纖維質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為10%[23]，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)22.08%[24]，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為5.5%～7.8%[25]，其中藜麥膳食纖維可以到達(dá)大腸，并作為腸道菌群可利用的碳源影響其生長(zhǎng)，提示通過(guò)藜麥飲食干預(yù)可以調(diào)控腸道微生態(tài)，從而達(dá)到預(yù)防疾病的目的。

藜麥的常見(jiàn)加工處理方式有蒸煮、焙烤、擠壓膨化和發(fā)酵等[26-27]，其中擠壓膨化技術(shù)效率高、連續(xù)性強(qiáng)，在我國(guó)得到迅速的發(fā)展與推廣，并被廣泛應(yīng)用于雜糧加工行業(yè)[28]。當(dāng)前，關(guān)于擠壓膨化加工藜麥的研究主要集中在生產(chǎn)工藝的優(yōu)化方面，鮮見(jiàn)不同加工方式藜麥營(yíng)養(yǎng)成分及其對(duì)人體腸道菌群影響的報(bào)道。目前體外發(fā)酵和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究腸道菌群的主要方法，其中體外發(fā)酵耗時(shí)短、財(cái)力物力投入低，并且容易控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高[29]，是初步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的最佳選擇。在有效時(shí)間內(nèi)，新鮮人類(lèi)糞便具有與人體腸道菌群相似的菌群特性，因此，可通過(guò)藜麥制品在新鮮人類(lèi)糞便培養(yǎng)基中的發(fā)酵行為來(lái)表征其對(duì)腸道菌群的影響。此外，在發(fā)酵過(guò)程中腸道菌群產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生積極的影響[30]，同時(shí)還可以降低結(jié)腸內(nèi)環(huán)境pH值，促進(jìn)部分有益細(xì)菌的生長(zhǎng)[31]。本研究利用擠壓膨化技術(shù)加工藜麥，測(cè)定藜麥在加工前后淀粉、膳食纖維、脂肪以及蛋白質(zhì)含量等，通過(guò)體外酵解模型分析藜麥擠壓膨化樣品在人體糞便培養(yǎng)基中的產(chǎn)氣量、pH值、SCFAs濃度以及腸道菌群組成，為藜麥加工產(chǎn)品改善人體腸道菌群研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥 繁峙縣綠山莊糧油加工有限公司；總淀粉、直鏈淀粉、膳食纖維試劑盒 愛(ài)爾蘭Megazyme公司；無(wú)水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、亞硝酸鈉（均為分析純） 廣州西隴科學(xué)股份有限公司；α-耐熱淀粉酶、胃蛋白酶、胰脂肪酶、沒(méi)食子酸、嗎啉乙磺酸、三羥甲基氨基甲烷 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；豬膽粉 上?？道噬锟萍加邢薰?；蛋白胨、酵母膏粉、L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物、膽鹽、VK1、吐溫-80、血紅素、菊粉以及SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸）標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4、0.01 mol/L）北京索萊寶科技有限公司；糞便DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀、NanoDrop超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；DSH-50A-1水分測(cè)定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；KN680全自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；DFM-1000C高速打粉機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；XL-70雙螺桿擠壓膨化機(jī) 濟(jì)南希朗機(jī)械有限公司；YXQ-100SII高壓滅菌鍋 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FE-28臺(tái)式pH計(jì) 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；VOSHINCOS-100 B數(shù)顯恒溫?fù)u床 無(wú)錫沃信儀器有限公司；厭氧手套箱 美國(guó)COY公司；7890B氣相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；ND200-24A氮?dú)獯祾邇x 上海左樂(lè)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥擠壓膨化樣品的制備

藜麥籽?！鬯椤^(guò)0.150 mm篩→調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為22%→喂料→擠壓膨化（膨化溫度140 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速200 r/min）→粉碎后過(guò)孔徑0.150 mm篩。

1.3.2 基本營(yíng)養(yǎng)成分分析

采用水分測(cè)定儀測(cè)定水分含量；灰分含量測(cè)定參考GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量參照全自動(dòng)凱氏定氮儀說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定；總淀粉、直鏈淀粉、膳食纖維含量參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定；脂肪含量采用GB/T 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》中的索氏抽提法測(cè)定。

1.3.3 體外模擬消化

體外模擬消化參考課題組前期的研究方法[32]，配制口腔模擬消化液（simulated stomatic fluid，SSF）、胃模擬消化液（simulated gastric fluid，SGF）和小腸模擬消化液（simulated intestinal fluid，SIF），用1 mol/L鹽酸或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值（下同）。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.455 g藜麥擠壓膨化樣品置于錐形瓶中，加入4.545 mL蒸餾水復(fù)溶[33]，混勻。向混合樣品中加入等體積SSF，調(diào)節(jié)體系pH 7，將離心管置于搖床（黑暗、180 r/min、37 ℃，下同）中振蕩孵育2 min。將模擬口腔消化后的樣品取出，迅速加入等體積SGF，調(diào)節(jié)體系pH 3，繼續(xù)置于搖床中孵育2 h。取出模擬胃部消化物后，立刻加入等體積SIF，調(diào)節(jié)體系pH 7，繼續(xù)置于搖床中孵育2 h，然后將裝有樣品的錐形瓶置于95 ℃水浴鍋中加熱5 min，得到藜麥擠壓膨化樣品體外消化產(chǎn)物，凍干后常溫保存于干燥器中。

1.3.4 體外酵解實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 培養(yǎng)基配制

根據(jù)課題組前期研究方法[34]配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別將1.3.3節(jié)藜麥體外消化后樣品、菊粉、去離子水以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混勻后調(diào)節(jié)體系pH 6.0，分別記為QUI組、陽(yáng)性對(duì)照（AC）組和空白對(duì)照（CK）組培養(yǎng)基。分別取5 mL各組培養(yǎng)基加入Hungate厭氧管中，使用氮?dú)獯祾邇x排盡空氣，然后用高壓滅菌鍋滅菌（121 ℃、15 min），滅菌完成轉(zhuǎn)移至厭氧培養(yǎng)箱中。

1.3.4.2 擠壓膨化藜麥體外酵解

招募身體健康、無(wú)胃腸道病史、具有良好的飲食習(xí)慣且3 個(gè)月內(nèi)未服用抗生素等藥物及含有益生菌的食品或藥品的志愿者。分別收集6 名志愿者（年齡在22～26 歲，3 名女性和3 名男性）的新鮮糞便：在約定時(shí)間內(nèi)同時(shí)采集6 名志愿者糞便，采集后立即將糞便轉(zhuǎn)移至厭氧手套箱，按照25 g/100 mL加入含有0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）L-半胱氨酸鹽酸的磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)瑴u旋均勻后靜置5 min，將上清液經(jīng)4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾，得糞便濾液，等體積混合6 名志愿者的糞便濾液。

厭氧環(huán)境（5%（體積分?jǐn)?shù)，后同）H2、5% CO2、90% N2）下用1 mL注射器將0.1 mL混合糞便濾液加入Hungate厭氧管中（糞便從收集到接種的間隔時(shí)間不應(yīng)超過(guò)2 h），置于37 ℃的黑暗厭氧環(huán)境下振蕩（180 r/min）培養(yǎng)，在0、6、12、24、48 h分別取出厭氧管，將發(fā)酵液迅速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌EP管中，隨后立即凍存于－80 ℃冰箱。每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.4.3 發(fā)酵液中pH值的測(cè)定

采用臺(tái)式pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。

1.3.4.4 發(fā)酵液中產(chǎn)氣量的測(cè)定

將一次性注射器活塞推至0刻度處，將注射器針尖刺入?yún)捬豕軆?nèi)，注射器活塞在厭氧管內(nèi)氣壓作用下自由移動(dòng)，活塞指示體積的變化量即為產(chǎn)氣量，單位為mL。

1.3.4.5 SCFAs濃度的測(cè)定

采用氣相色譜法[35]測(cè)定發(fā)酵液中SCFAs濃度。取發(fā)酵液12000hg、4 ℃離心10 min，取0.5 mL上清液分別加入1.2 mL無(wú)水乙醇、1 mL正己烷和0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%濃硫酸酯化萃取SCFAs，置于60 ℃搖床（250 r/min）中振蕩，充分反應(yīng) 1 h后靜置分層，取有機(jī)相（上層溶液）經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，采用氣相色譜測(cè)定SCFAs濃度。

氣相色譜條件：7890 B氣相色譜儀配備19091J-413 HP-5色譜柱（0.32 mmh 30 m，0.25 μm）；載氣為N2；分流比為1∶40；火焰離子化檢測(cè)器；升溫程序?yàn)?0 ℃、3.5 min，5 ℃/min升至40 ℃，15 ℃/min升至180 ℃，保持10 min；進(jìn)樣量為1 μL；進(jìn)樣口溫度200 ℃。

1.3.4.6 腸道菌群組成的鑒定

將1.3.4.2節(jié)凍存于－80 ℃下發(fā)酵48 h所得的樣品進(jìn)行腸道菌群分析。采用糞便DNA提取試劑盒提取DNA，采用NanoDrop 2000對(duì)DNA樣本進(jìn)行質(zhì)量分析。利用引物515F（5’-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對(duì)16S rRNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收，采用DNA回收試劑盒回收純化DNA，采用2100生物分析儀系統(tǒng)（高靈敏度DNA芯片）檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。最后通過(guò)Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)獲得的DNA片段進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序，將得到的數(shù)據(jù)通過(guò)QIIME軟件進(jìn)行物種鑒定分析[36]，利用派森諾基因云網(wǎng)站（https://www.genescloud.cn）對(duì)腸道菌群進(jìn)行α-多樣性分析、β-多樣性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA），并繪制腸道菌群門(mén)、屬相對(duì)豐度柱狀圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置以3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05則認(rèn)為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擠壓膨化處理前后藜麥基本營(yíng)養(yǎng)成分含量

如表1所示，與未處理的藜麥相比，擠壓膨化后的藜麥灰分、總淀粉以及蛋白質(zhì)含量并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與李敏等[37]的研究結(jié)果一致。相比未處理的藜麥，擠壓膨化后藜麥中直鏈淀粉含量顯著下降（P＜0.05），同時(shí)脂肪含量也顯著降低（P＜0.05），這可能是由于脂肪酸在高溫加熱的過(guò)程中發(fā)生氧化和氫化作用，與直鏈淀粉形成復(fù)合物，最終導(dǎo)致含量下降[38]。與未加工藜麥相比，加工后藜麥的總膳食纖維含量顯著下降（P＜0.05），值得注意的是，不可溶性膳食纖維含量顯著下降的同時(shí)可溶性膳食纖維含量顯著上升。相似地，燕麥、大豆、玉米經(jīng)過(guò)擠壓膨化后，可溶性膳食纖維含量均顯著上升[39-40]，該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是擠壓膨化的加熱過(guò)程使不可溶性膳食纖維裂解，轉(zhuǎn)化為可溶性成分[41]。

表1 擠壓膨化處理前后藜麥的基本營(yíng)養(yǎng)成分含量Table 1 Nutritional components of quinoa before and after extrusion treatment

2.2 體外酵解過(guò)程中pH值、產(chǎn)氣量的變化

pH值從一定程度上可以反映發(fā)酵培養(yǎng)基中碳水化合物的消耗程度以及SCFAs的產(chǎn)生情況[42]。從圖1A可以看出，CK和AC組pH值在發(fā)酵0～12 h明顯下降，并在12 h時(shí)pH值最低（分別為6.78、4.18），而QUI組在發(fā)酵6 h時(shí)pH值（5.48）最低。之后，各組pH值均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在發(fā)酵24～48 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定并持續(xù)至酵解結(jié)束。研究表明，pH值上升的情況可能是由于腸道微生物利用二氧化碳產(chǎn)生甲烷，或培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生NH3，NH3與酸反應(yīng)生成NH4＋[43]。體外酵解到達(dá)48 h時(shí)，pH值依次為CK組（7.18）＞QUI組（5.99）＞AC組（4.78），各組pH值相較于初始值均有所下降。

腸道菌群能利用碳水化合物、蛋白質(zhì)、多酚等物質(zhì)酵解產(chǎn)生二氧化碳，氫氣、硫化氫和甲烷等氣體，產(chǎn)氣量一定程度上可以反映菌群的代謝情況。由圖1B可知，各組的產(chǎn)氣量在0～48 h體外發(fā)酵期間一直保持上升，QUI組和AC組在0～12 h產(chǎn)氣量大幅增加，產(chǎn)氣速率也最快，表明在該階段腸道微生物代謝旺盛，這可能是由于藜麥擠壓膨化樣品和菊粉含有大量的不可消化淀粉（抗性淀粉、膳食纖維、低聚糖等）[44-45]，在酵解前期淀粉類(lèi)物質(zhì)的發(fā)酵速率比其他物質(zhì)更快[46]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)氣量仍在不斷增加但氣體產(chǎn)生速率在逐漸下降，可能是菌群發(fā)酵后期主要消耗二氧化碳產(chǎn)生甲烷氣體，或菌群發(fā)酵利用蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的氨氣與酸性氣體發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致產(chǎn)氣速率下降[43]。在發(fā)酵48 h時(shí)各組產(chǎn)氣量最高，依次為AC組（4.57 mL）＞QUI組（3.63 mL）＞CK組（3.03 mL）。

圖1 體外發(fā)酵過(guò)程中pH值（A）、產(chǎn)氣量（B）的變化Fig.1 Changes in pH (A) and gas production (B) during in vitro fermentation

2.3 體外酵解過(guò)程中SCFAs的產(chǎn)生情況

如圖2A所示，各組總SCFAs濃度隨時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)上升，其中QUI組在發(fā)酵24 h后基本保持穩(wěn)定。AC組和QUI組在0～6 h內(nèi)SCFAs產(chǎn)生速率最快，而CK組直至發(fā)酵12 h后SCFAs產(chǎn)生速率才有所降低，這與2.2節(jié)產(chǎn)氣量以及pH值的變化趨勢(shì)相印證。發(fā)酵48 h時(shí)，總SCFAs濃度依次為：AC組（49.70 mmol/L）＞QUI組（37.08 mmol/L）＞CK組（23.78 mmol/L）。AC組和CK組乙酸濃度呈增加趨勢(shì)（圖2B），QUI組在發(fā)酵24～48 h期間基本保持不變。發(fā)酵48 h時(shí)，AC組、QUI組和CK組乙酸濃度分別為27.06、18.68、12.11 mmol/L。如圖2C所示，QUI組產(chǎn)丙酸情況與AC組相近，在48 h時(shí)兩組丙酸濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而CK組顯著低于其余兩組（P＜0.05）。從圖2D可以看出，QUI組發(fā)酵期間產(chǎn)丁酸濃度明顯低于AC組，同時(shí)明顯高于CK組。各組戊酸濃度隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而持續(xù)增加（圖2E），AC組增長(zhǎng)速率幾乎不變并且發(fā)酵48 h后顯著高于其他兩組（P＜0.05），QUI組和CK組在發(fā)酵24 h后速率降低。如圖2F、G所示，發(fā)酵前期（0～6 h）各組均產(chǎn)生較少的異丁酸、異戊酸，約在6 h后各組異丁酸、異戊酸濃度出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，QUI組產(chǎn)異丁酸、異戊酸能力均最強(qiáng)，其次是CK組，AC組最弱。此外，發(fā)酵48 h后QUI組不同SCFAs濃度均高于CK組。

圖2 體外發(fā)酵過(guò)程中SCFAs濃度的變化Fig.2 Changes in the concentrations of SCFAs during in vitro fermentation

作為主要的SCFAs，乙酸、丙酸、丁酸發(fā)揮的功能各異。研究表明，乙酸能被大腦、心臟和外周組織氧化利用，是宿主吸收利用能量的主要來(lái)源；丁酸作為結(jié)腸上皮細(xì)胞的重要能量來(lái)源，具有抗炎特性并能預(yù)防、抑制癌癥的發(fā)生，同時(shí)還可以促進(jìn)細(xì)胞分泌胰島素；丙酸能抑制內(nèi)源性膽固醇的合成[47-50]。各組酵解樣品產(chǎn)生SCFAs的情況表明，QUI組的產(chǎn)酸能力總體介于CK和AC組之間，且由發(fā)酵48 h后SCFAs濃度分析結(jié)果可知乙酸產(chǎn)量＞丙酸產(chǎn)量＞丁酸產(chǎn)量，這與前期研究結(jié)果[51]一致，表明藜麥擠壓膨化樣品能一定程度影響腸道菌群代謝物的產(chǎn)生，在腸道和肝臟代謝中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)宿主的健康。

2.4 體外發(fā)酵液腸道菌群的多樣性分析結(jié)果

在α-多樣性分析中，常采用Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)表征菌群多樣性，Chao 1指數(shù)越大，菌群豐度越高；Shannon指數(shù)越大，則表明菌群多樣性越高。從圖3A、B可以看出，各組Chao 1指數(shù)依次為CK（440.48）＞QUI（368.91）＞AC（365.50）；各組Shannon指數(shù)依次為QUI（5.41）＞AC（4.92）＞CK（4.87）；相較于CK組，QUI組腸道微生物豐度顯著降低但多樣性顯著提高。在β-多樣性分析中，PCA可以表征不同菌群結(jié)構(gòu)組成的差異性，樣本之間距離越遠(yuǎn)說(shuō)明菌群結(jié)構(gòu)差異越大。從圖3C中可以看出，3 組發(fā)酵液中腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性較大，其中AC組與CK組差異性最大，而QUI組與AC組之間的菌群差異性小于與CK組的差異性，說(shuō)明藜麥擠壓膨化樣品培養(yǎng)發(fā)酵會(huì)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的影響。

圖3 體外發(fā)酵48 h腸道菌群的多樣性分析結(jié)果Fig.3 Diversity analysis of gut microbiota after 48 h of in vitro fermentation

2.5 體外發(fā)酵液腸道菌群微生物組成分析結(jié)果

體外發(fā)酵結(jié)束后，QUI組、AC組和CK組腸道菌群在門(mén)、屬水平的微生物組成如圖4A、B所示。3 組樣本中相對(duì)豐度較高的4 個(gè)菌門(mén)的分別為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）及放線菌門(mén)（Actinobacteria）。其中，與CK組相比，AC組和QUI組擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度明顯增加，變形菌門(mén)明顯減少，這種變化趨勢(shì)對(duì)于宿主健康有一定的積極意義，因?yàn)樽冃尉T(mén)中包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、幽門(mén)螺桿菌等病原菌，降低該菌門(mén)的菌能對(duì)腸道健康具有一定的積極意義。擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)豐度的增加可能與藜麥擠壓膨化樣品中的膳食纖維含量變化有關(guān)[52]。研究表明，厚壁菌門(mén)能通過(guò)非致病性途徑刺激機(jī)體免疫功能，促進(jìn)宿主對(duì)食物中維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分的吸收與合成；擬桿菌門(mén)主要促進(jìn)上皮細(xì)胞的發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)吸收[53]；放線菌是抗生素、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等多種化合物的次級(jí)代謝產(chǎn)物[54]。

如圖5所示，在科、屬水平上，相較于CK組，QUI組能顯著降低菌群中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）及瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的相對(duì)豐度（P＜0.05），同時(shí)顯著增加普雷沃氏菌（Prevotella）、巨單胞菌（Megamonas）、巨球形菌（Megasphaera）、考拉桿菌（Phascolarctobacterium）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和擬桿菌（Bacteroides）相對(duì)豐度（P＜0.05）。據(jù)報(bào)道，普雷沃氏菌數(shù)量的增加與高膳食纖維飲食有關(guān)，并且該菌屬能有效抑制氨、胺和吲哚等腫瘤誘導(dǎo)因子的產(chǎn)生[55]。巨單胞菌經(jīng)研究證明與非淀粉多糖的降解有關(guān)，在預(yù)防肥胖方面發(fā)揮重要作用[56]，該菌屬可能是亞洲人群的特征菌屬[57]。巨球形菌相對(duì)豐度的增加可能與藜麥擠壓膨化樣品中所含的非消化性淀粉有關(guān)[58]，考拉桿菌能增強(qiáng)胃腸道機(jī)能、降低炎癥水平[59]。雙歧桿菌能幫助宿主吸收營(yíng)養(yǎng)，增強(qiáng)免疫力，如治療腹瀉、便秘、腸易激綜合征等腸道疾病[60]，擬桿菌作為人體重要的共生菌，在人體消化食物以及獲取營(yíng)養(yǎng)和能量方面起關(guān)鍵作用[61]。而腸桿菌科和瘤胃菌科則被大量實(shí)驗(yàn)證明與腫瘤、炎癥等疾病正相關(guān)[62-63]。

圖5 體外發(fā)酵48 h后幾種主要科、屬菌群的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of several major families and genera after 48 h of in vitro fermentation

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)比較擠壓膨化處理前后藜麥的基本營(yíng)養(yǎng)成分含量的變化，并通過(guò)體外酵解實(shí)驗(yàn)發(fā)掘藜麥擠壓膨化后樣品的酵解特性。結(jié)果表明，擠壓膨化加工后，藜麥灰分、總淀粉以及蛋白質(zhì)含量并無(wú)顯著變化（P＞0.05），其直鏈淀粉、脂肪以及總膳食纖維含量、不可溶性膳食纖維含量顯著下降（P＜0.05），且可溶性膳食纖維含量顯著增加（P＜0.05）。藜麥擠壓膨化制品在體外酵解中能一定程度上增加糞便腸道菌群的多樣性，顯著上調(diào)普雷沃氏菌、巨單胞菌、巨球形菌、考拉桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌的相對(duì)豐度（P＜0.05），并顯著下調(diào)瘤胃菌科和腸桿菌科的相對(duì)豐度（P＜0.05）。此外，擠壓膨化處理藜麥酵解48 h后不同SCFAs濃度均高于CK組。本研究結(jié)果可為藜麥擠壓膨化制品及其調(diào)節(jié)腸道功能相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。