錢海珊，普津姣，王 娟，李紅芳，陳 帥，李紹花，李寶晶，3*，何紅平，3*

（1. 云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2. 西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，云南 西雙版納 666100；3. 云南中醫(yī)藥大學云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500）

白背葉楤木（Aralia chinensis L. var. nuda Nakai）傈僳語稱為“里俄籽”，為五加科楤木屬藥食兩用植物，味甘、微苦，性平，歸肝、胃、腎經，具有活血化瘀、祛風利濕之功，用于治療風熱咳喘、痢疾、黃疸、風濕痹痛等[1]。楤木屬多分布于亞洲，少數分布于北美洲。我國楤木屬植物資源較為豐富，有29 種，尤以云南和四川的種類最多，約占全國種類總數的三分之二[2]。楤木屬植物的化學成分主要為三萜皂苷、三萜、二萜、黃酮、有機酸及其衍生物等[3]，并顯示良好的抗炎、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、心肌保護以及中樞抑制等作用[4-8]。近年來，白背葉楤木在怒江傈僳族地區(qū)推廣種植，但其化學成分研究較少，課題組前期對白背葉楤木化學成分進行了初步探索[9-10]，為了進一步研究開發(fā)具有民族特色的藥用資源白背葉楤木，我們對其乙酸乙酯部位中有機酸衍生物及甾醇類化學成分進行研究，從中分離并鑒定了14 個有機酸衍生物及甾醇類化合物。

1 儀器與材料

Bruker Avance 400 和600 MHz 型核磁共振儀（德國Bruker 公司）；Agilent 1260 infinity 液相色譜儀（美國Agilent 公司）；IKA 旋轉蒸發(fā)儀（艾卡（廣州）儀器設備有限公司）；薄層硅膠G254 和柱色譜硅膠（100～200 目、200～300 目）（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國GE 公司）；RPC18 色譜填料（美國EMD Millipore 公司）；石油醚、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、乙酸（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（中科院上海細胞庫）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自BI 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、Griess 試劑、N-單甲基-L-精氨酸單乙酸酯（NG-monomethyl-L-arginine acetate，LNMMA）、MTS 試劑均購自美國Sigma 公司；NO 檢測試劑盒（032519190612，碧云天生物技術有限公司）；細胞CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺（賽默飛世爾科技有限公司）。

白背葉楤木樣品于2019 年4 月采集于云南省怒江傈僳族自治州瀘水縣魯掌鎮(zhèn)，由怒江瀘水縣河新楤木種植農民專業(yè)合作社種植提供，憑證標本（201904SM）存放于云南中醫(yī)藥大學云南省高校中藥民族藥質量標準研究重點實驗室。由云南中醫(yī)藥大學中藥學院李艷平教授鑒定為白背葉楤木A. chinensis L. var. nuda Nakai 的干燥芽苞部位。

2 提取與分離

將20 kg 白背葉楤木芽苞粉碎，70%乙醇浸提3次，合并濾液后減壓干燥得到4.7 kg 提取物浸膏，用水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮干燥后得到乙酸乙酯部位600 g。乙酸乙酯部位經100～200 目硅膠柱層析，以石油醚-丙酮（100 ∶1，v/v）梯度洗脫，TLC 檢測，合并后得到10 個流分Fr.A～J。

流分A（31.0 g）經200～300 目硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（1 ∶0，v/v）梯度洗脫，TLC 檢測合并得到5 個流分Fr.A1～A5。Fr.A1 經RP-C18 反相色譜柱甲醇-水（8 ∶2，v/v）洗脫后重結晶得到化合物1（22.8 mg），2（6.5 mg），9（6.0 mg），11（68.5 mg）。Fr.A2 經RP-18 反相色譜柱甲醇-水（1 ∶9，v/v）梯度洗脫后重結晶得到化合物3（4.4 mg）、4（13.9 mg）、5（110.0 mg）、10（19.6 mg）、12（34.3 mg）。Fr.A3 經硅膠柱層析，以石油醚洗脫得到化合物8（11.1 mg）。Fr.A4 經RP-C18 反相色譜柱甲醇-水（9 ∶1，v/v）洗脫后得到化合物6（9.9 mg）。

流分D（89.8 g）經200～300 目硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，TLC 檢測合并得到5 個流分Fr.D1～D5。Fr.D1 經硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯（600 ∶1，v/v）洗脫得到化合物7（4.0 mg）。Fr.D2 經硅膠柱層析，以二氯甲烷-甲醇（18 ∶1，v/v）洗脫得到化合物13（22.9 mg）和14（20.8 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：白色粉末，C15H32O，ESI-MS m/z：227[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.64（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），1.56（2H，m，H-2），1.26～1.34（24H，m，H-3～14），0.88（3H，t，J=6.8 Hz，H-15）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：63.2（C-1），33.0（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.9（C-5），29.9（C-6），29.9（C-7），29.8（C-8），29.8（C-9），29.8（C-10），29.6（C-11），29.5（C-12），25.9（C-13），22.8（C-14），14.3（C-15）。上述數據與文獻報道[11]一致，因此鑒定化合物1 為十五烷醇。

化合物2：白色片狀結晶，C34H70O，ESI-MS m/z：493[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ 3.64（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），2.33 （1H，t，J=7.5 Hz，-OH），1.56（2H，m，H-2），1.18～1.42（62H，m，H-3～33），0.87（3H，t，J=6.8 Hz，H-34）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：63.3（C-1），33.0（C-2），32.2（C-3），29.3～29.9（C-4～30），26.0（C-31），24.9（C-32），22.9（C-33），14.3（C-34）。上述數據與文獻報道[12]一致，因此鑒定化合物2 為三十四烷醇。

化合物3：白色粉末，C15H30O2，ESI-MS m/z：241[M-H]-。1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.62（2H，m，H-3），1.20～1.35（22H，m，H-4～12），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-15）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），32.1（C-3），29.2～29.9（C-4～12），24.8（C-13），22.9（C-14），14.3（C-15）。上述數據與文獻報道[13]一致，因此鑒定化合物3 為十五烷酸。

化合物4：白色粉末，C17H34O2，ESI-MS m/z：269[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.64（2H，q，J=7.5 Hz，H-3），1.16～1.45（26H，m，H-4～14），0.88（3H，t，J=6.6 Hz，H-17）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：180.8（C-1），34.3（C-2），32.1（C-3），29.2～29.9（C-4～14），24.8（C-15），22.9（C-16），14.3（C-17）。上述數據與文獻報道[14]一致，因此鑒定化合物4 為十七烷酸。

化合物5：白色片狀結晶，C20H40O2，ESI-MS m/z：311[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.35（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.64（2H，m，H-3），1.20～1.34（32H，m，H-4～19），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-20）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：179.8（C-1），34.1（C-2），32.1（C-3），29.2 ～29.9（C-4 ～17），24.8（C-18），22.9（C-19），14.3（C-20）。上述數據與文獻報道[15]一致，因此鑒定化合物5 為二十烷酸。

化合物6：無色油狀物，C32H62O2，ESI-MS m/z：477[M-H]-。1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.33（1H，tq，J=7.1，1.3 Hz，H-2'），4.59（1H，d，J=7.1 Hz，H-1'），2.27（2H，t，J=7.1 Hz，H-2），2.00（2H，t，J=7.1 Hz，H-4'），1.62（2H，t，J=7.1 Hz，H-7），1.50（1H，m，H-11），1.41（2H，m，H-9），1.38（2H，m，H-6，H-8），1.28（2H，m，H-3），1.25～1.26（20H，m，H-5'～14'），1.22（2H，m，H-4），1.15（2H，m，H-5），1.08（2H，m，H-10），0.88（3H，d，J=6.4 Hz，CH3-6），0.86（6H，d，J=6.8 Hz，CH3-11×2），0.86（3H，t，J=6.8 Hz，H-16'），0.84（3H，d，J=6.8 Hz，CH3-8）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.1（C-1），142.8（C-3'），118.3（C-2'），61.4（C-1'），40.0（C-4'），39.5（C-15'），37.6（C-9），37.5（C-14'），37.5（C-13'），36.8（C-10），34.6（C-2），33.0（C-8），32.8（C-6），32.1（C-4），29.9（C-12'），29.8（C-11'），29.8（C-10'），29.6（C-9'），29.5（C-8'），29.4（C-7'），29.3（C-6'），28.1（C-11），25.2（C-7），25.0（C-3），24.6（C-5'），22.9（C-6），22.8（C-5），19.9（C-11），19.9（C-12），16.5（C-3'），14.3（C-8）。上述數據與文獻報道[16]一致，因此鑒定化合物6 為balansenate Ⅰ。

化合物7：無色油狀物，C11H20O4，ESI-MS m/z：215[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CD3OD）δ：3.65（6H，s，-OCH3×2），2.32 （4H，t，J=7.4 Hz，H-2，H-8），1.60（4H，p，J=7.3 Hz，H-3，H-7），1.32（6H，q，J=4.0 Hz，H-4～6）；13C NMR（125 MHz，CD3OD）δ：176.0（C-1，C-9），52.0（-OCH3×2），34.7（C-2，C-8），30.0（C-4～6），26.0（C-3，C-7）。上述數據與文獻報道[17]一致，因此鑒定化合物7 為壬二酸二甲酯。

化合物8：黃色油狀物，C19H32O2，ESI-MS m/z：291 [M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.28～5.43（6H，m，H-9 ～10，H-12 ～13，H-15 ～16），3.66（3H，s，OCH3），0.97（3H，t，J=7.5 Hz，H-18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：174.5（C-1），132.1（C-16），130.4（C-9），128.4（C-12），128.4（C-13），127.9（C-10），127.3（C-15），51.6（-OCH3），34.3（C-2），29.9（C-7），29.3（C-6），29.3（C-5），29.2（C-4），27.4（C-8），25.8（C-11），25.7（C-14），25.1（C-3），20.7（C-17），14.4（C-18）。上述數據與文獻報道[18]一致，因此鑒定化合物8為α-亞麻酸甲酯。

化合物9：白色鱗片狀結晶，C28H58O，ESI-MS m/z：409[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：3.52（2H，t，J=6.8 Hz，H-1），1.47（2H，p，J=6.8 Hz，H-2），1.10～1.37（50H，m，H-3～27），0.81（3H，t，J=6.8 Hz，H-28）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：62.6（C-1），32.6（C-2），31.9（C-26），25.8（C-3），29.4～29.7（C-3～25），22.7（C-27），14.1（C-28）。上述數據與文獻報道[19]一致，因此鑒定化合物9 為二十八烷醇。

化合物10：白色粉末，C16H32O2，ESI-MS m/z：255[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.34（2H，t，J=7.5 Hz，H-2），1.62（2H，p，J=7.5 Hz，H-3），0.87（3H，t，J=6.9 Hz，H-16）；13C NMR （125 MHz，CDCl3）δ：180.4（C-1），34.2（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.8（C-5～9），29.6（C-10），29.5（C-11），29.4（C-12），29.2（C-13），24.8（C-14），22.9（C-15），14.3（C-16）。上述數據與文獻報道[20]一致，因此鑒定化合物10 為十六烷酸。

化合物11：白色針晶，C29H48O，ESI-MS m/z：411[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.34（1H，d，J=5.4 Hz，H-6），5.14（1H，dd，J=15.2，8.7 Hz，H-22），5.01（1H，dd，J=15.2，8.7 Hz，H-23），0.97（3H，d，J=6.5 Hz，H-21），0.87（3H，t，J=7.0 Hz，H-29），0.84（3H，d，J=6.5 Hz，H-26），0.81（3H，d，J=4.4 Hz，H-27），0.80（3H，s，H -19），0.69 （3H，s，H -18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：140.8（C-5），138.3（C-22），129.3（C-23），121.7（C-6），71.8（C-3），56.9（C-14），56.0（C-17），51.3（C-24），50.2（C-9），42.3（C-13），42.2（C-4），40.5（C-20），39.7（C-12），37.3（C-1），36.5（C-10），32.0（C-25），31.9（C-7，C-8），31.6（C-2），28.9（C-16），25.4（C-28），24.4（C-15），21.2（C-21），21.1（C-11，C-26），19.4（C-19），19.0（C-27），12.3（C-29），12.1（C-18）。上述數據與文獻報道[21]一致，因此鑒定化合物11 為豆甾醇。

化合物12：白色鱗片狀結晶，C35H58O6，ESI-MS m/z：573[M-H]-。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.16（1H，dd，J=15.4，8.4 Hz，H-23），5.11 （1H，s，H-7），5.01（1H，dd，J=15.4，8.4 Hz，H-22），4.93（1H，d，J=8.6 Hz，H-1'），4.45（2H，m，H-3'，H-4'），4.20（1H，d，J=7.7 Hz，H-2'），4.13（1H，m，H-5'），3.63（1H，d，J=11.6 Hz，H-6'），3.16（1H，m，H-3），0.99（3H，d，J=8.5 Hz，21-CH3），0.90（3H，d，J=6.6 Hz，29-CH3），0.82（3H，d，J=6.8 Hz，26-CH3），0.80（3H，d，J=6.8 Hz，27-CH3），0.73（3H，s，19-CH3），0.50（3H，s，18-CH3）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：139.0（C-8），138.3（C-22），130.0（C-23），117.1（C-7），101.4（C-1'），79.5（C-3），76.8（C-5'），76.6（C-3'），76.1（C-2'），73.3（C-4'），62.5（C-6'），56.1（C-17），54.8（C-14），50.5（C-24），49.5（C-9），45.0（C-13），41.7（C-5），38.2（C-12），37.3（C-1），36.7（C-20），36.7（C-4），36.1（C-10），33.7（C-25），31.2（C-20），29.1（C-2），29.1（C-6），28.5（C-16），26.4（C-28），23.8（C-15），22.4（C-11），21.0（C-26），20.8（C-21），19.8（C-27），12.7（C-19），12.0（C-29），11.7（C-18）。上述數據與文獻報道[22]一致，因此鑒定化合物12 為α-菠甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物13：白色粉末，C35H58O6，ESI-MS m/z：573[M-H]-。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ：5.29（1H，s，H-6），4.87（1H，d，J=4.5 Hz，H-23），4.85（1H，d，J=4.5 Hz，H-22），4.19（1H，d，J=7.8 Hz，H-1），3.61（1H，m，H-3），0.97（3H，s，H-18），0.96（3H，s，H-19），0.87（3H，d，J=6.3 Hz，H-21），0.79（6H，d，J=6.7 Hz，H-26，H-27），0.63 （3H，t，J=8.2 Hz，H-29）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ：140.5（C-5），138.1（C-22），128.9（C-23），121.2（C-6），100.9（C-1'），77.0（C-3），76.8（C-3'），73.5（C-2'），70.1（C-4'），61.1（C-6'），56.3（C-14），56.2（C-17），55.4（C-5'），50.7（C-9），49.7（C-24），45.2（C-13），41.8（C-20），41.8（C-12），38.4（C-4），36.9（C-1），36.3（C-10），33.9（C-25），31.4（C-7），31.4（C-8），29.3（C-2），29.3（C-16），25.0（C-28），24.9（C-15），22.7（C-11），21.2（C-21），21.0（C-27），21.0（C-19），19.8（C-26），12.0（C-18），11.8（C-29）。上述數據與文獻報道[23]一致，因此鑒定化合物13 為豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷。

化合物14：白色粉末，C29H50O，ESI-MS m/z：413[M-H]-。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.35（1H，m，H-6），3.51（1H，m，H-3），2.27（1H，m，H-25），2.19（2H，m，H-4），1.71（1H，m，H-17），1.25（1H，m，H-14），1.24（1H，m，H-9），1.21（1H，m，H-8），1.12（1H，m，H-24），0.99（3H，s，H-19），0.91（3H，d，J=6.8 Hz，H-21），0.82（3H，d，J=6.9 Hz，H-26），0.80（3H，d，J=6.9 Hz，H-27），0.67（3H，s，H-18）；13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ：141.1（C-5），122.1（C-6），72.1（C-3），57.2（C-17），56.4（C-14），51.6（C-9），46.1（C-24），42.7（C-13），42.6（C-4），40.1（C-12），37.6（C-1），36.9（C-10），36.5（C-20），34.3（C-22），32.3（C-8），32.2（C-7），32.0（C-2），29.4（C-2），28.6（C-25），28.6（C-16），24.7（C-23），23.4（C-15），21.4（C-28），20.2（C-18），19.8（C-11），19.4（C-26），19.3（C-19），19.2（C-27），12.4（C-21），12.2（C-29）。上述數據與文獻報道[24]一致，因此鑒定化合物14 為β-谷甾醇。

4 抗炎活性篩選

一氧化氮（nitric oxide，NO）具有廣泛而重要的生物學調控功能，當免疫細胞受LPS 等炎癥介質刺激時誘導型NO 合成酶被激活，從而合成大量的NO，進而誘導炎癥損傷。因此，抑制NO 生成是抗炎活性的直接指標。

RAW264.7 細胞使用DMEM 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數生長期的細胞接種至96 孔板（1×105個/孔），設置正常對照組、模型組（LPS）、陽性對照組（L-NMMA）、單體化合物組。加入LPS（1 μg/mL）對細胞進行刺激，同時加入陽性藥或待測單體化合物（50 μM），培養(yǎng)24 h，收集細胞上清液，使用NO 檢測試劑盒，在570 nm 下測定吸光值。以MTS 測定細胞存活率，排除化合物對細胞毒的影響。

結果顯示，在50 μM 濃度下，陽性藥L-NMMA的NO 生成抑制率為（52.01±1.96）%，化合物8、12的NO 生成抑制率分別為（87.46±2.00）%、（1.32±1.30）%。

5 結果與討論

本研究從白背葉楤木乙酸乙酯部位中分離純化得到14 個化合物，化合物1～8、11～14 均為首次從該植物中分離得到，其中，化合物1～8、11～13 為首次從楤木屬植物中分離得到，化合物2～7、12～13 為首次從五加科植物中分離得到。體外抗炎活性篩選發(fā)現，化合物8 在50 μM 濃度下的NO 生成抑制率為（87.46±2.00）%，抗炎效果優(yōu)于陽性對照L-NMMA，但其具體機制還需要進一步探索。文章進一步豐富了白背葉楤木的化學成分，可為后期抗炎藥物的開發(fā)提供基礎。