李金磊，殷 紅，劉維統(tǒng)，楊景帆*

（1. 昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011；2. 昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650500）

膝骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是1 種普遍的慢性關(guān)節(jié)疾病，是由關(guān)節(jié)軟骨退行性增生引起的骨骼疾病。臨床上表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹或疼痛以及運(yùn)動(dòng)障礙。膝OA 病程長(zhǎng)，發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增加，在老年人群中發(fā)病率較高[1-2]。炎癥被認(rèn)為是促進(jìn)OA 發(fā)展的危險(xiǎn)因素，軟骨損傷與OA 的臨床癥狀發(fā)展密切。目前，非甾體類(lèi)抗炎藥是膝OA 的臨床一線治療藥物[3]。塞來(lái)昔布（celecoxib，Cel）是常用非甾體類(lèi)抗炎藥之一，在緩解疼痛和延緩疾病進(jìn)程中具有良好的效果[3]。但由于Cel 具有胃腸道、心血管疾病副作用以及過(guò)敏反應(yīng)，不可長(zhǎng)期服用。燈盞花素（breviscapine，BE）是傳統(tǒng)中草藥燈盞花的類(lèi)黃酮粗提物，主要活性成分是燈盞花乙素（4，5，6-三羥基黃銅-7-葡萄糖醛酸苷）[4]。最近的研究結(jié)果表明，BE 具有抗氧化應(yīng)激[5]、抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)功能改善[6]和抗炎等作用[7]。但關(guān)于BE 對(duì)OA 的作用尚不清楚。因此，本研究將探索BE 對(duì)膝OA 軟骨損傷的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 180～240 g（5 周齡，共32 只）雄性Sprague Dawley（SD）大鼠購(gòu)自北京維通利華。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度為50%左右，12 h 明暗交替。

1.2 主要試劑 HE 染色試劑盒（貨號(hào)：G1120）、改良番紅O-固綠軟骨染色液（貨號(hào)：G1371）、甲苯胺藍(lán)染色液（貨號(hào)：G2543）購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Collagen-Ⅱ（貨號(hào)：ab34712）和p-JNK（貨號(hào)：ab124956） 抗體購(gòu)自Abcam；大鼠IL-1β（貨號(hào)：ml037361）、TNF-α（貨號(hào)：ml002953）、IL-6（貨號(hào)：ml102828）ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。氯化鈉購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BE（編號(hào)：14002000884，規(guī)格：20 mg×24 s）購(gòu)自廣州彼迪藥業(yè)有限公司。Cel（編號(hào)：14201843485，規(guī)格：0.2 g×6 s）購(gòu)自輝瑞制藥有限公司。

1.3 動(dòng)物模型 32 只雄性大鼠隨機(jī)分為4 組：sham組、OA 組、OA+BE 組、OA+Cel 組，8 只/組。采用內(nèi)側(cè)半月板切除手術(shù)構(gòu)建OA 大鼠模型。大鼠購(gòu)買(mǎi)后飼養(yǎng)4 周，用（2.5±3）%的異氟醚麻醉大鼠。OA 大鼠模型構(gòu)建方法：1 mL/100 g 的戊巴比妥那麻醉大鼠，在髕骨遠(yuǎn)端至脛骨近端平臺(tái)上剪1 個(gè)3 cm 的縱向切口，切開(kāi)緊靠臏腱內(nèi)側(cè)的關(guān)節(jié)囊，用顯微外科剪刀切開(kāi)關(guān)節(jié)囊。髁間區(qū)脂肪墊的鈍性解剖用于暴露髁間區(qū)，手術(shù)切除內(nèi)側(cè)半月板，用可吸收縫線縫合手術(shù)切口。Sham 組大鼠除不進(jìn)行內(nèi)側(cè)半月板切除外，其余操作均與OA 組相同。手術(shù)后，OA+BE 組大鼠每天灌胃40 mg/kg BE，OA+Cel 組 大 鼠 每 天 灌 胃30 mg/kg Cel，OA 組 和sham 組同等劑量的生理鹽水灌胃。灌胃6 周后取材。該研究獲得昆明市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 蘇木精-伊紅（hematoxylin & eosin，HE）染色取各組大鼠的膝關(guān)節(jié)組織，4%多聚甲醛用于固定各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織，48 h 后脫鈣21 d，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片。放入二甲苯中脫蠟以及濃度依次升高的乙醇中復(fù)水，再用蒸餾水浸潤(rùn)5 min。利用蘇木精染液染色，5 min 后通過(guò)流水洗去部分蘇木精染液。0.5%鹽酸乙醇分色至細(xì)胞核和核內(nèi)染色染色質(zhì)清晰。流水洗滌15 min 至細(xì)胞核呈藍(lán)色。蒸餾水沖洗后用0.5%伊紅染色5 min，經(jīng)濃度依次升高的梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，滴加中性樹(shù)膠封片。顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.5 番紅O 固綠染色 各組骨組織固定后，經(jīng)脫鈣、脫水和石蠟包埋處理并切片，再用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脫蠟以及梯度乙醇復(fù)水。經(jīng)流水洗滌后用番紅染液染色1 h，自來(lái)水洗去多余染料，用乙醇脫色。隨后用固綠染液染色60 s，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯溶液透明5 min，封片。顯微鏡采集圖像后進(jìn)行分析。

1.6 甲苯胺藍(lán)染色 骨組織經(jīng)脫鈣處理，石蠟包埋后切片。用二甲苯脫蠟兩次，梯度乙醇脫蠟至水。切片用甲苯胺藍(lán)染色液染色30 min，隨后經(jīng)自來(lái)水洗滌2 min，濾紙吸去切片表面的水分。加入丙酮分化至切片中的軟骨細(xì)胞呈紫藍(lán)色且清晰可見(jiàn)，再用乙醇逐級(jí)脫水。在切片上滴加二甲苯使切片透明，最后加入中性樹(shù)膠用于封片。顯微鏡觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)骨組織軟骨損傷情況。

1.7 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色4%多聚甲醛固定后的大鼠膝關(guān)節(jié)骨組織經(jīng)脫鈣、脫水、石蠟包埋處理后，采用連續(xù)矢狀切片將膝關(guān)節(jié)組織切成4 μm 厚的切片。切片脫蠟、復(fù)水，用PBS洗滌3 次×5 min。將載玻片浸入修復(fù)液中修復(fù)抗原，10% H2O2用于去除內(nèi)源性過(guò)氧化物，經(jīng)PBS 洗滌后放入10%胎牛血清在室溫中封閉1 h。隨后將切片與一抗在4 ℃條件下孵育過(guò)夜，洗滌后與二抗在室溫中孵育2 h。切片洗滌后將DAB 溶液滴至切片上進(jìn)行顯色反應(yīng)，10 min 后滴加去離子水終止反應(yīng)。為有助于檢測(cè)結(jié)果的判讀用蘇木精對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，切片經(jīng)脫水、中性膠封片后，利用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 灌胃后的第6 周，通過(guò)心內(nèi)穿刺收集各組大鼠的血液，置于不含EDTA 的離心管中。在室溫中靜置1 h 后離心機(jī)離心10 min，將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩４笫驣L-1β、TNF-α 和IL-6 檢測(cè)試劑盒分別用于測(cè)定大鼠血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的濃度。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別檢測(cè)各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并作圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BE 對(duì)OA 模型大鼠軟骨損傷和細(xì)胞免疫浸潤(rùn)的影響 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行HE 染色（圖1），染色顯示sham 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨清晰，表面光滑、完整。OA 組中，軟骨表面粗糙，出現(xiàn)滑膜增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨層與sham 組相比變薄，表明OA大鼠模型成功構(gòu)建。相比較于OA 組，OA+BE 組和OA+Cel 組大鼠軟骨組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，軟骨層增厚，表明BE 可緩解大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷。見(jiàn)圖1。

圖1 HE 染色觀察OA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷情況（10×）

2.2 番紅O-固綠染色觀察大鼠軟骨損傷的情況

番紅O-固綠染色中，嗜酸性的軟骨與堿性染料番紅O 結(jié)合呈紅色，嗜堿性的骨組織與酸性染料固綠結(jié)合被染成綠色或藍(lán)色。染色結(jié)果和Mankin’s 評(píng)分表明，相比較于sham 組，OA 組中大鼠關(guān)節(jié)紅色染色較淺，軟骨減少（P＜0.0001），軟骨下骨增厚，結(jié)構(gòu)紊亂。OA+BE 組和OA+Cel 組中紅色軟骨層明顯厚于OA 組（P＜0.0001），說(shuō)明BE 可一定程度緩解DMM 誘導(dǎo)的大鼠膝OA。見(jiàn)圖2。

圖2 番紅O 固綠染色觀察軟骨損傷情況（10×）

2.3 甲苯胺藍(lán)染色觀察BE 對(duì)OA 模型大鼠的軟骨損傷情況的影響 甲苯胺藍(lán)染色可使軟骨呈紫色，其他為淺藍(lán)色。染色結(jié)果表示，OA 組中大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層厚度與sham 組相比明顯變薄（P＜0.0001）。OA+BE 組和OA+Cel 組中的軟骨層厚度比OA 組相比增厚（P＜0.05）。由此表明，BE可顯著改善OA 大鼠的軟骨損傷。見(jiàn)圖3。

圖3 甲苯胺藍(lán)染色觀察大鼠軟骨損傷（20×）

2.4 BE 可促進(jìn)OA 大鼠軟骨組織中Collagen-Ⅱ和p-JNK 的陽(yáng)性率的影響 IHC 染色結(jié)果顯示，相比較于sham 組，OA 組中Collagen-Ⅱ的陽(yáng)性率降低而p-JNK 的陽(yáng)性率升高。OA+BE 組和OA+Cel 組中Collagen-Ⅱ的陽(yáng)性率高于OA 組，p-JNK 的陽(yáng)性率與OA 組相比降低。由此可知，BE 可逆轉(zhuǎn)DMM 誘導(dǎo)的OA 大鼠膝關(guān)節(jié)中Collagen-Ⅱ減少以及p-JNK 陽(yáng)性率的增多，我們推測(cè)BE 可能通過(guò)調(diào)控JNK 信號(hào)通路參與DMM 誘導(dǎo)的膝OA 的發(fā)展進(jìn)程。見(jiàn)圖4。

圖4 IHC 檢測(cè)Collagen-Ⅱ和p-JNK 陽(yáng)性率（20×）

2.5 ELISA 試劑盒檢測(cè)OA 大鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 濃度 收集各組大鼠的血清，通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 的濃度。實(shí)驗(yàn)表明，相比較于sham組，OA 組中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度明顯增多。OA+BE 組和OA+Cel 組中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度顯著低于OA 組。由此可知，BE 可下調(diào)DMM 誘導(dǎo)的大鼠血清中促炎細(xì)胞因子濃度的增加。見(jiàn)圖5。

圖5 ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的濃度

3 討論

膝OA 不僅是關(guān)節(jié)軟骨的退行性疾病，在炎癥作用下軟骨細(xì)胞合成的蛋白多糖減少，會(huì)導(dǎo)致免疫功能受損，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)軟骨，加重炎癥反應(yīng)。骨性關(guān)節(jié)炎的特征是伴隨軟骨下骨的硬化改變以及骨贅進(jìn)展的透明關(guān)節(jié)軟骨的逐漸喪失，表現(xiàn)為患者膝關(guān)節(jié)經(jīng)常疼痛、腫脹以及活動(dòng)受限，嚴(yán)重影響患者的生活和學(xué)習(xí)[8-9]。膝OA 可由性別、肥胖、衰老、退化、勞損感染以及外傷等因素引起。目前，臨床上使用的藥物可在一定程度上緩解疾病，但一般維持時(shí)間較短，仍無(wú)法治愈疾病。因此，尋找OA 的有效治療藥物仍然迫在眉睫。

BE 是類(lèi)黃酮苷的混合物，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗血小板、抗凝以及心肌保護(hù)等多種生物活性，已在臨床上用于治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦供血不足等心腦血管疾病[10-11]。Lan 等報(bào)道，BE 可在多種動(dòng)物模型中抑制代謝應(yīng)激下的肝臟炎癥和纖維化以及小鼠肝臟中的脂質(zhì)積累[12]。在Yang 等人的報(bào)道中，BE 可通過(guò)上調(diào)miR-129-5p，靶向抑制ZFP91 的表達(dá)，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制疾病的發(fā)展進(jìn)程[13]。在大鼠冠狀動(dòng)脈栓塞中，BE 可通過(guò)激活PI3K/AKT/GSK-3β 信號(hào)通路，改善大鼠心功能障礙、降低血清心肌損傷標(biāo)志物水平、縮小心肌微梗死面積和降低心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)以及心肌組織中的炎癥細(xì)胞因子[14]。Peng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，BE 通過(guò)抑制NF-κB/NLRP3 通路的激活，抑制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的炎癥反應(yīng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DMM 誘導(dǎo)的大鼠膝OA 關(guān)節(jié)軟骨層厚度變薄，軟骨細(xì)胞受損，炎性細(xì)胞因子增多，p-JNK 陽(yáng)性率增高；大鼠經(jīng)BE 灌胃后，關(guān)節(jié)軟骨損傷得到緩解，軟骨層增厚，炎性細(xì)胞因子減少，p-JNK 陽(yáng)性率降低。

c-Jun N 末端激酶JNK（c-Jun N terminal kinase，JNK）又稱(chēng)應(yīng)激激活蛋白激酶（stress-activated protein kinase），是MAPK 超家族的成員之一，參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物過(guò)程[16-19]。同時(shí)，JNK 信號(hào)通路也被報(bào)道參與OA 的發(fā)展進(jìn)程。例如，Li 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，氫通過(guò)抑制JNK 信號(hào)的激活，減輕人OA 軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥因子。抑制巨噬細(xì)胞中JNK-ERK-P38 的磷酸化水平可降低促炎細(xì)胞因子的水平和軟骨細(xì)胞的凋亡，減弱小鼠OA[20]。JNK-JUN 信號(hào)依賴(lài)式上調(diào)NCOA4 的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的鐵死亡，通過(guò)鐵蛋白吞噬加重OA[21]。然而，Tong 等報(bào)道激活JNK-mTORC1-PTHrP信號(hào)通路可抑制OA 的發(fā)展進(jìn)程[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，DMM 誘導(dǎo)的OA 大鼠膝關(guān)節(jié)組織中p-JNK 陽(yáng)性率增強(qiáng)，BE 可抑制p-JNK 的陽(yáng)性率，我們推測(cè)JNK 信號(hào)通路參與BE 調(diào)控膝OA 的軟骨損傷進(jìn)程。

綜上所述，本研究中我們證明BE 可通過(guò)抑制JNK 信號(hào)通路的激活，抑制OA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷以及血清中炎癥因子的水平。