李金茹，角星孟，謝言青，譚文紅，劉 錄

（云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500）

回心草為苔蘚類真蘚科植物暖地大葉蘚Rhodobryum giganteum（Hook.）Par.的 干燥全草[1]，全草入藥，是介于藻類和蕨類之間的高等植物類群[2]。根據(jù)文獻(xiàn)[3-7]記載，此藥味淡，性平，具有養(yǎng)心安神、清肝明目的作用，可用于心悸怔忡、神經(jīng)衰弱等方面的治療。《云南中草藥選》《云南思茅草藥選》《云南中藥資源名錄》《德宏民族藥志》等中均有回心草的記載?，F(xiàn)代臨床藥理研究證明，回心草對(duì)血液黏度有明顯改善作用[8]，具有降血壓、降血脂、抗心肌缺血[9-10]及抗動(dòng)脈粥樣硬化[11]等作用。臨床上主要用于治療冠心病、心絞痛和高血壓等疾病。研究表明回心草富含果糖[12]、植物糖蔗糖、果糖1-酮糖[13]、短鏈低聚果糖-益生元[14]等糖類，而植物多糖具有抗氧化[15]、降血脂、降血糖[16]、抗腫瘤[17]、抗免疫調(diào)節(jié)[18]等藥理活性。目前對(duì)回心草的研究主要集中于對(duì)其水煎液的化學(xué)成分與藥理活性研究，對(duì)回心草多糖還未進(jìn)行深入研究，本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見(jiàn)分光光度法對(duì)回心草水煎液中的多糖進(jìn)行含量測(cè)定，為回心草的更深一步研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（批號(hào)：2021132902），購(gòu)于上海元析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（批號(hào)：HH-S24s），購(gòu)于鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（批號(hào)：EYELAN-1100）東京理化；電子天平（批號(hào)：FA2104N），購(gòu)于上海菁海儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)（批號(hào)：FD-1A-50），購(gòu)于北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；紫砂煎藥壺-45U2（潮州市潮安區(qū)康雅順）全自動(dòng)煎藥壺。葡萄糖化學(xué)對(duì)照品（批號(hào)：1122A0223），購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；濃硫酸（批號(hào)：20180410），購(gòu)于云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司；苯酚（批號(hào)：20190201），購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

藥材采集于云南省4 個(gè)地區(qū)的15 個(gè)地方（大理鳳羽鎮(zhèn)、大理上蘭鄉(xiāng)、大理洱源、大理馬登鄉(xiāng)、保山蒲縹鎮(zhèn)、保山施甸、保山騰沖、臨滄雞飛鎮(zhèn)、臨滄勐海、臨滄三岔河、德宏蒲川鄉(xiāng)、德宏中山鎮(zhèn)、德宏軒崗鄉(xiāng)、德宏河興鄉(xiāng)、德宏象達(dá)鎮(zhèn)），由三九藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)楊竹雅教授鑒定為藥材暖地大葉蘚（R. giganteum）的干燥全草。

1.2 凍干粉的制備

1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照衛(wèi)生部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3 號(hào)文，花草全草類飲片一般煎煮2 次。加水量一般浸過(guò)藥面2～5 cm 左右。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以出膏率為指標(biāo)，考察提取過(guò)程中3 個(gè)主要因素：煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)和加水倍數(shù)。見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

回心草出膏率測(cè)定：精密吸取混合煎煮液20 g，置于恒重蒸發(fā)皿，在105 ℃的干燥箱干燥3 h，置干燥器中冷卻1 h，迅速稱重，質(zhì)量為W2，按下式公式計(jì)算出膏率。出膏率=W2×V/20×W1×100%。式中：W1-回心草的質(zhì)量（g），W2-濃縮液的干浸膏質(zhì)量（g）；V-提取液總質(zhì)量（g）。

1.2.2 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果 從河頭鄉(xiāng)（批號(hào)：S14）中分別稱取9 份回心草飲片，每份100 g，先用純凈水浸泡30 min，按照L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，濾液合并，按出膏率測(cè)定項(xiàng)進(jìn)行稱量計(jì)算。D 列為空白列。結(jié)果見(jiàn)表2 和表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 方差分析表

結(jié)論：3 個(gè)因素對(duì)回心草出膏量影響程度為：煎煮次數(shù)＞加水倍數(shù)＞煎煮時(shí)間；因素A 、因素C 主具有顯著意義，因此影響因子大小順序?yàn)镃＞A＞B，A2＞A3＞A1，B1＞B3＞B2，C3＞C2＞C1，最終方案：A2B1C2，煎煮兩次，一煎30 min，二煎25 min，第一次加水24倍，第二次22 倍。

1.2.3 回心草凍干粉制備 稱取回心草飲片加入飲片量24 倍的水，浸泡30 min，煎煮30 min，用200 目藥典篩趁熱過(guò)濾，濾渣中加飲片量22 倍的水，再煎煮25 min，用200 目藥典篩趁熱過(guò)濾，合并提取濾液，使用200 目篩進(jìn)行趁熱過(guò)濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮（溫度50 ℃，壓力0.08 MPa）至100 mL，經(jīng)真空冷凍干燥即得，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于具塞的200 mL 容量瓶中，加純水至刻度，制成每1 mL 含有0.05 mg 對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取“1.2.3”項(xiàng)制備的回心草凍干粉10 mg，置于具塞的200 mL 容量瓶中，加純水至刻度，定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性關(guān)系的考察 精密量取“2.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、1 mL，分別置于10 mL 試管中，加純水補(bǔ)至1 mL，搖勻，即得濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.05 mg/mL 的對(duì)照品溶液，分別精密加入6 % 苯酚0.5 mL，濃硫酸2.5 mL，混勻，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定上述溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=14.29x+0.2097（R2=0.9994）。結(jié)果表明葡萄糖濃度在0～0.05 mg/mL 范圍內(nèi)與其吸收呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見(jiàn)表4 和圖1。

圖1 葡萄糖對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表4 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.2 精密度 取對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下的方法，連續(xù)測(cè)定溶液6 次吸光度值，結(jié)果其RSD 為0.300 %（n=6），表明儀器精密度良好，測(cè)定結(jié)果可信。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回心草水煎液多糖含量測(cè)定精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 穩(wěn)定性 精密稱取同一供試品溶液，在隔0、2、4、8、12、24 h 分別測(cè)定溶液吸光度值，結(jié)果其RSD值為0.438 %（n=6），表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 回心草水煎液多糖含量測(cè)定精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 重復(fù)性 精密稱取同一供試品6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下分別測(cè)吸光度，以考察本法的重現(xiàn)性。結(jié)果RSD=0.502 %（n=6），說(shuō)明重現(xiàn)性較好。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 回心草水煎液多糖含量測(cè)定重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 加樣回收率 精密稱取等量的供試品溶液6份，分別加入一定量葡萄糖對(duì)照品溶液，按上述“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均回收率為98.8%，RSD 值為0.706 %（n=6）。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 回心草水煎液多糖含量測(cè)定加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 樣品含量測(cè)定 精密稱取15 批供試品，按“2.1”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值，并計(jì)算15 批供試品中多糖的含量。結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 不同地區(qū)回心草多糖含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備多糖的方式為水煎煮法，通過(guò)紫外分光光度計(jì)法對(duì)15 批回心草樣品中多糖進(jìn)行含量測(cè)定，多糖含量分別范圍在15.75%～65.96%之間。結(jié)果表明該多糖含量測(cè)定方法具有良好的準(zhǔn)確度，精密度和穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行。實(shí)驗(yàn)為今后進(jìn)一步研究回心草多糖結(jié)構(gòu)及藥理試驗(yàn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 討論

云南省4 個(gè)地區(qū)所產(chǎn)回心草多糖含量存在顯著差異，其中以臨滄雞飛鎮(zhèn)的回心草多糖含量最高，德宏象達(dá)鎮(zhèn)的回心草多糖含量最低。因采收時(shí)間、生長(zhǎng)年限、產(chǎn)地環(huán)境及處理方式等因素，回心草的多糖含量可能存在一定影響。多糖的含量測(cè)定有比色法、滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜法等多種方法。目前使用的比色法中的苯酚－硫酸法、蒽酮－硫酸法這兩種方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定速度快[19]，苯酚－硫酸法主要用于多聚糖、甲基化的糖和戊糖等糖類的測(cè)定，而蒽酮－硫酸法對(duì)所有的碳水化合物幾乎都可以測(cè)定[20]，回心草中含有果糖、戊糖及多糖，因此苯酚－硫酸法是回心草多糖含量測(cè)定的理想方法?；匦牟輦鹘y(tǒng)應(yīng)用上多為回心草水煎液，具有降血糖、降血脂、抗凝血活性、抗炎等藥理作用，民間主要用于治療心臟病、預(yù)防心血管等方面的疾病，而回心草水煎液中主要含有多糖成分，因此推測(cè)其功效作用與其多糖有著密切關(guān)系。