朱萍，浦春，2*，胡蝶，張艷珍，張博超，馬思源，趙曉曉

（1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院）

結(jié)直腸癌（CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，靶向治療可有效改善生存率，降低病死率［1］。研究表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在CRC 組織及細(xì)胞系中異常表達(dá)，影響了CRC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和凋亡，并作為CRC 診斷、治療及預(yù)后的靶標(biāo)［2］。長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA00963（LINC00963）是一種新的lncRNA，位于9 號(hào)染色體上，全長(zhǎng)25 027 bp，已被證實(shí)在多種人類腫瘤中存在差異表達(dá)，并在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。最近有研究表明，LINC00963 可以通過(guò)miR-532-3p/HMGA2 軸發(fā)揮CRC 的致癌活性，與CRC 不良預(yù)后相關(guān)［3］。此外，LINC00963 在乳腺癌中顯著上調(diào)，它的上調(diào)與乳腺癌細(xì)胞的增殖、腫瘤發(fā)生和抗放射性有關(guān)［4］。miRNAs是一類大小在20～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，可與其相對(duì)應(yīng)的目的基因3'-UTR 進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致目的基因降解和抑制其蛋白質(zhì)翻譯［5］。在功能上，miRNAs 的異常表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如增殖活力、劃痕愈合率和侵襲能力等［6-8］。miR-214-5p是miRNAs 的一種，研究發(fā)現(xiàn)miR-214-5p在肝癌細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)抑制肝癌增殖和遷移［9］；此外，miR-214-5p可調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［10］。但LINC00963 和miR-214-5p對(duì)CRC 細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響還尚未可知。Semaphorin4C（SEMA4C）是一種信號(hào)蛋白，其在乳腺癌［11］、肺癌［12］、宮頸癌［13］和肝癌［14］中高表達(dá)。本研究旨在研究LINC00963 是否通過(guò)調(diào)控miR-214-5p/SEMA4C影響CRC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料 CRC 細(xì)胞株HCT116、SW480 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；PCR 引物（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；Trizol 試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Transwell 小室、基質(zhì)膠（美國(guó)BD 公司）；CCK-8 試劑盒、羊抗兔IgG 及BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗人單克隆抗體SEMA4C抗體（英國(guó)Abcam 公司）；兔抗人單克隆抗體β-actin（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；si-LINC00963 及陰性對(duì)照（si-nc）、miR-214-5p模擬物（mimic）及模擬對(duì)照序列（miRNA-nc）（廣州銳博生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 應(yīng)用含有青霉素/鏈霉素雙抗的10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)HCT116、SW480 細(xì)胞，分別將si-nc、si-LINC00963、miRNA-nc、miR-214-5pmimic 轉(zhuǎn) 染至HCT116、SW480 細(xì)胞中，記為si-nc 組、si-LINC00963組、miR-nc組、miR-214-5p mimic組。

1.2.2 在線生物信息學(xué)工具 利用StarBase v3.0、Ualcan 和GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的LINC00963 及miR-214-5p進(jìn)行分析，明確兩者在CRC 組織及正常組織中的表達(dá)差異及LINC00963及SEMA4C的相關(guān)性，通過(guò)LncBase Predicted v.2及miRanda 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00963 與miR-214-5p之間存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，后續(xù)通過(guò)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的聯(lián)系。

1.2.3 qRT-PCR 提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。LINC00963 引物的上游引物為5'-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3'，下游引物為5'-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3'；miR-214-5p引物的上游引物為5'-GGCCTGGCTGGACAGAGTTG-3'；SEMA4C引物的上游引物為 5'-GACACCTCCTGGCACAACAC-3'，下游引物為5'-CCACTTCTGGGCTTCCTCA-3'；U6 引物的上游引物為5'-AGAGAAGATTAGCATGGCCCCTG-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物的上游引物為5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3'，下游引物為5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的HCT116、SW480 細(xì)胞接種于96 孔板，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，每個(gè)復(fù)孔接種6 000個(gè)細(xì)胞，每組轉(zhuǎn)染后，分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h 時(shí)，每孔加入10 μl CCK-8 溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)良好的 HCT116、SW480 細(xì)胞接種至6 孔板，24 h 后各組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞長(zhǎng)到100%匯合度時(shí)，用200 μl無(wú)菌槍頭劃破細(xì)胞的中軸，移液管吸取磷酸鹽緩沖液沖洗滑落下來(lái)的細(xì)胞，保證邊緣整齊，倒置顯微鏡下觀察拍照，用無(wú)菌槍頭加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。并在0、24 和48 h 3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，使用倒置顯微鏡拍攝傷口愈合情況。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將100 μl 稀釋的Matrigel膠加入Transwell小室上方，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h。取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h 后將含有6×104個(gè)細(xì)胞的200 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基加入Transwell小室上方，小室下方加入500 μl 含20%胎牛血清的培養(yǎng)基后，置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)48 h 后，吸出上室液體，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用結(jié)晶紫溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色20 min，用磷酸鹽緩沖液洗去多余染料，用無(wú)菌棉簽擦去小室內(nèi)細(xì)胞，放于低倍顯微鏡下觀察膜的下室面，隨機(jī)選取3個(gè)低倍區(qū)域（×100），計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot 蛋白提取和Western blot 采用裂解緩沖液（RIPA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）和苯甲磺酰氟（PMSF，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA 試劑盒測(cè)定各蛋白樣本的濃度。取50 μg蛋白經(jīng)過(guò)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶在4 ℃下阻斷1 h，分別用1∶10 000的兔抗人單克隆抗體SEMA4C 和1∶1 000 的兔抗人單克隆抗體β-actin 在4 ℃搖床過(guò)夜；第2 天用1∶1 000 的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 室溫輕搖2 h，避光條件下，加入ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液，置于成像儀中觀察結(jié)果。

1.2.8 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染前一晚的HEK-293T 細(xì)胞接種于24 孔板，待到細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80% 時(shí)轉(zhuǎn)染，利用lipofectamine 試劑將LINC00963-wt 質(zhì)粒 與miR-214-5pmimics、miR-nc共轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細(xì)胞，48 h后檢測(cè)熒光素酶活性強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.00、GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2 組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)LINC00963 與miR-214-5p相關(guān)性 通過(guò)LncBase Predicted v.2 發(fā) 現(xiàn)LINC00963 與miR-214-5p結(jié)合評(píng)分為0.991，顯示兩者可能存在結(jié)合位點(diǎn)；并且miRanda 預(yù)測(cè)顯示，LINC00963 與miR-214-5p結(jié)合評(píng)分為154，LINC00963 可能調(diào)控miR-214-5p表達(dá)；同時(shí)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示LINC00963與miR-214-5p存在相互作用。見(jiàn)圖1。

圖1 LINC00963與miR-214-5p具有結(jié)合位點(diǎn)

2.2 CRC 組織 中LINC00963 和miR-214-5p的表 達(dá)及LINC00963 與SEMA4C的相關(guān)性 GEPIA 及StarBase 數(shù)據(jù)庫(kù)顯示CRC 組織中LINC00963 的表達(dá)水平高于正常組織，而miR-214的表達(dá)水平低于正常組織，此外，CRC 患者LINC00963 的高表達(dá)與較差的總生存期（OS）相 關(guān)（P＜0.05），LINC00963與SEMA4C的表達(dá)呈正相關(guān)，見(jiàn)圖2。

圖2 LINC00963和miR-214-5p在CRC組織中的表達(dá)及LINC00963與SEMA4C的相關(guān)性

2.3 下 調(diào)LINC00963 對(duì)miR-214-5p及SEMA4C的影響 為了驗(yàn)證LINC00963 對(duì)CRC 細(xì)胞的影響，將si-LINC00963 與陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至HCT116、SW480 細(xì)胞中，qRT-PCR 結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組（si-nc組）比較，si-LINC00963組HCT116、SW480細(xì)胞中LINC00963 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），miR-214-5p表達(dá)水平顯著升高，SEMA4CmRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；Western blot 結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組（si-nc組）比較，SEMA4C蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、si-LINC00963后各組LINC00963、miR-214-5p及SEMA4C的表達(dá)

2.4 下調(diào)LINC00963 抑制CRC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力 轉(zhuǎn)染了si-LINC00963 后，與對(duì)照組（si-nc組）比較，si-LINC00963組CRC細(xì)胞增殖活力、遷移能力降低，侵襲數(shù)量減少（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、si-LINC00963后各組細(xì)胞的增殖能力、劃痕愈合率及侵襲能力

2.5 上調(diào)miR-214-5p對(duì)SEMA4C的影響 為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-214-5p表達(dá)增高對(duì)CRC細(xì)胞的影響，將陰性對(duì)照、miR-214-5pmimic 轉(zhuǎn)染至HCT116、SW480 細(xì)胞。結(jié)果顯示，與miR-nc 組比較，miR-214-5p mimic 組miR-214-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染成功。然后采用qRT-PCR與Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCT116、SW480 細(xì)胞中SEMA4CmRNA 和蛋白質(zhì)水平顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、miR-214-5p mimic后各組miR-214-5p及SEMA4C的表達(dá)

2.6 上調(diào)miR-214-5p表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉(zhuǎn)染了miR-214-5pmimic 后，與miR-nc 組比較，miR-214-5p mimic 組CRC 細(xì)胞增殖活力、遷移能力降低，侵襲數(shù)量減少（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

圖6 轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照、miR-214-5p mimic后各組細(xì)胞的增殖能力、劃痕愈合率及侵襲能力

3 討論

CRC 的術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移［15］是導(dǎo)致患者死亡和預(yù)后不良的主要原因，其具體機(jī)制尚無(wú)比較明確的定論。LncRNA 是一種長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的非編碼RNA［16］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，LncRNA 與多種腫瘤的惡性腫瘤行為密切相關(guān)，如腫瘤自噬、腫瘤抗性和腫瘤免疫等［17-18］。目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA在CRC 細(xì)胞中異常表達(dá)，并通過(guò)與下游靶基因結(jié)合，共同調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移的形成過(guò)程，從而影響CRC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后［19］。LncHAGLR在CRC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)增加；下調(diào)表達(dá)的HAGLR可抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲［20］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，LINC00707 在大腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并對(duì)大腸癌的體內(nèi)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［21］。

LINC00963 是一種新型LncRNA，位于9 號(hào)染色體9q34.11 上，全長(zhǎng)約為2.1 kb，已被證實(shí)在多種人類腫瘤中存在差異表達(dá)，并在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用［22］。異常表達(dá)的LINC00963 通常通過(guò)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程（包括增殖、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞凋亡）來(lái)發(fā)揮致癌作用。過(guò)表達(dá)的LINC00963 與癌癥臨床病理特征和不良的癌癥預(yù)后有關(guān)，可用于肝細(xì)胞癌的診斷［23］。有研究指出，LINC00963 在乳腺癌中具有顯著的高表達(dá)水平，且LINC00963 可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［24］。Chang 等［25］的研究發(fā)現(xiàn)LINC00963 可能與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，CRC 組織中LINC00963 的表達(dá)水平高于正常組織，此外，CRC 患者LINC00963 的高表達(dá)與較差的總生存期相關(guān)，說(shuō)明LINC00963 可能作為CRC 的潛在預(yù)后標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，CRC細(xì)胞系 HCT116、SW480 轉(zhuǎn)染si-LINC00963 后，癌細(xì)胞增殖能力降低，遷移和侵襲數(shù)量降低；表明干擾LINC00963 的表達(dá)抑制CRC 的增殖、遷移和侵襲。

為了進(jìn)一步分析LINC00963 調(diào)節(jié)CRC 細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)LINC00963 與miR-214-5p可能存在結(jié)合位點(diǎn)。為了驗(yàn)證LINC00963 與miR-214-5p在CRC 細(xì)胞中的相互關(guān)系，將si-LINC00963 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)當(dāng)CRC 細(xì)胞中LINC00963 的表達(dá)降低，miR-214-5p的表達(dá)增高，表示LINC00963 在CRC 細(xì)胞中負(fù)調(diào)控miR-214-5p表達(dá)，這與數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果一致。

miRNAs 是一種源自內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本的非編碼RNA。它們可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因沉默促進(jìn)基因組調(diào)控和微調(diào)［26］。通常，這些miRNA 能夠與其靶基因的3'-UTR 中的特定位點(diǎn)結(jié)合，并通過(guò)完全或不完全的堿基配對(duì)介導(dǎo)mRNA 降解或阻斷基因翻譯［27-28］。大量研究證實(shí)，miR-214-5p在多種腫瘤中起重要作用。有報(bào)道m(xù)iR-214-5p在甲狀腺狀瘤、肝癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)也明顯下調(diào)，miR-214-5p的過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［29］。此外，miR-214-5p可通過(guò)靶向多種腫瘤相關(guān)調(diào)節(jié)因子來(lái)影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展［30］。本研究通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，CRC 組織中miR-214 的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明miR-214 在CRC 組織中低表達(dá)。本研究中將miR-214-5pmimic 轉(zhuǎn)染至CRC 細(xì)胞中，以檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞生物功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-214-5p表達(dá)增高后，CRC 細(xì)胞活性和遷移侵襲數(shù)量降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-214-5p可抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，miR-214-5p是否可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00963 對(duì)CRC 增殖、遷移與侵襲等功能的調(diào)控，這將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

SEMA4C是一種信號(hào)蛋白，是多種miRNA 的靶基因，參與了許多惡性腫瘤（包括乳腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌）的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化介導(dǎo)的化療 耐藥性［31］。為了探討LINC00963 和SEMA4C三者在CRC 細(xì)胞中的相互關(guān)系，我們將si-LINC00963 轉(zhuǎn)染至CRC 細(xì)胞中，以檢測(cè)SEMA4C的水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SEMA4C的mRNA 和蛋白質(zhì)水平均顯著下調(diào)，由此證明SEMA4C與LINC00963呈正相關(guān)。

綜上所述，LINC00963 通過(guò)調(diào)控miR-214-5p/SEMA4C調(diào)控CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。