王亞萍，郭 普，汪華學

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 1. 重癥醫(yī)學科； 2. 檢驗科，安徽 蚌埠 233004)

鮑曼不動桿菌是一種革蘭陰性的機會性致病菌，可導致免疫功能低下和危重患者發(fā)生醫(yī)院感染[1-2]。近年來，多重耐藥鮑曼不動桿菌(multidrug resis-tanceAcinetobacterbaumannii，MDR-AB)感染的報道不斷增多，而臨床上可供選擇的治療藥物有限，抗菌藥物聯(lián)合應用被認為是潛在有效的治療方法[3-5]。作為β-內(nèi)酰胺類抗生素之一的碳青霉烯類藥物通過與青霉素結合蛋白共價結合來抑制細菌細胞壁的合成[6]。磷霉素(FOS)是一種由鏈霉菌屬產(chǎn)生的磷酸烯醇丙酮酸類似物，可以干擾細菌細胞壁形成并具有穿透細菌生物膜的能力[7]，與其他抗菌藥物聯(lián)合使用對包括鮑曼不動桿菌在內(nèi)的非發(fā)酵菌有很強的抗菌活性[8-11]。本研究通過體內(nèi)外試驗，研究亞胺培南(IMP)聯(lián)用FOS對7株體外分離MDR-AB的抗菌活性，同時比較IMP與FOS、阿米卡星(AMK)、替加環(huán)素(TGC)、多粘菌素B(PB)的體外協(xié)同作用，進一步探討IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB生物膜形成及活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的影響，為臨床防治MDR-AB感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 亞胺培南(CAS號：74431-23-5)、磷霉素鈉(CAS號：26016-99-9)購自美國CSNpharm公司。MH瓊脂及MH肉湯購自英國Oxoid公司。貝博○RBBcellProbe○R活細菌/死細菌染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司?；钚匝鯔z測試劑盒及D-PBS均購自上海碧云天生物技術有限公司。磷酸鹽緩沖液，K-B藥敏由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科微生物室提供。VITEK比濁儀購自法國生物梅里埃公司；酶標儀購自瑞士Tecan貿(mào)易股份公司；流式細胞儀購自美國克曼庫爾特公司；超高分辨率激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國蔡司公司。

1.1.2 試驗菌株與動物 臨床分離的7株MDR-AB均由蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科提供。藥敏質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853。大蠟螟購自中國天津尚偉軒魚需有限公司，長度15～25 mm，重量200～300 mg。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株鑒定 菌株通過VITEK 2 Compact細菌鑒定儀以及飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定，耐藥性通過K-B紙片法進行檢測，藥敏結果判定參照2020版美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[12]標準。

1.2.2 最低抑菌濃度(MIC)及部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)測定 根據(jù)CLSI 2020版推薦的微量肉湯稀釋法測定7株MDR-AB對IMP、FOS、PB、AMK、TGC的單藥MIC，根據(jù)單藥MIC結果繼續(xù)使用微量棋盤法測定7株MDR-AB對IMP分別與FOS、TGC、PB的聯(lián)合MIC并計算FICI。FICI=MICA藥聯(lián)用/MICA藥單用+MICB藥聯(lián)用/MICB藥單用。判斷標準：FICI≤0.5，協(xié)同作用；FICI>2.0，拮抗作用；0.5

1.2.3 時間殺菌曲線 選取菌株AB6624與AB0153，用無菌M-H肉湯將孵育的對數(shù)生長期細菌制備菌懸液調(diào)節(jié)至1.5×108CFU/mL。然后根據(jù)兩株菌單藥MIC結果，選擇4×MIC的IMP與3×MIC的FOS單藥或者聯(lián)合用藥與菌液共孵育，同時把不加入藥物的菌液同步培養(yǎng)作為空白對照組。分別在0、4、8、12、24 h從各組中取10 μL菌液，并用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)階梯性稀釋10倍，混勻后各取10 μL接種于MHA瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后進行菌落計數(shù)并構建殺菌曲線。判斷標準：協(xié)同效應定義為聯(lián)合比單藥最強效應的抗菌藥物超過細菌初始量2log10CFU/mL的減少；殺菌效應定義為細菌菌落數(shù)較初始接種菌落數(shù)降低≥3log10CFU/mL[13]。

1.2.4 菌落生物膜測定

1.2.4.1 結晶紫染色法半定量生物膜 以M-H肉湯中孵育的對數(shù)生長期細菌制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1.5×108CFU/mL，將菌液接種于96孔聚苯乙烯平板，每株菌接種3孔，每孔100 μL。設空白對照組、對照組、IMP(0.5×MIC)組、FOS(0.5×MIC)組、IMP+FOS(0.5×MIC的IMP+0.5×MIC的FOS)組，分別加入等體積抗菌藥物，將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育48 h，吸出菌液，使用PBS沖洗3遍去除游離菌，室溫晾干。每孔加入200 μL 95%甲醇固定15 min，自然風干后再加入200 μL 0.01%的結晶紫染色液染色15 min；吸出結晶紫染色液，使用PBS反復沖洗，自然風干后加入95%乙醇200 μL放入37℃恒溫培養(yǎng)箱充分溶解生物膜上的結晶紫，于590 nm處用全波段酶標儀測定光密度(OD)值。

1.2.4.2 共聚焦顯微鏡觀察菌落生物膜內(nèi)細菌活力 生物膜制備同1.2.4.1，將菌液接種于共聚焦皿中培養(yǎng)48 h，然后吸出菌液，使用0.85%氯化鈉溶液沖洗三遍去除游離菌，按說明書使用貝博○RBBcellProbe○R活細菌/死細菌染色試劑盒中PI和BBcellProbe○RN01兩種熒光染液對菌落生物膜進行染色，染色結束后使用0.85%氯化鈉溶液清洗，重復清洗2遍最后用吸水紙吸干水分，避光轉(zhuǎn)移并使用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。

1.2.5 細菌ROS水平檢測 以M-H肉湯中孵育的對數(shù)生長期細菌制備菌懸液，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1.5×108CFU/mL，接種2 mL菌液于5 mL玻璃管中。設置空白對照組、IMP(0.5×MIC)組、FOS(0.5×MIC)組、IMP+FOS(0.5×MIC的IMP+0.5×MIC的FOS)組及活性氧陽性對照組，按照分組分別加入10 μL抗菌藥物及活性氧陽性對照，將玻璃管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，離心后用0.85%氯化鈉溶液洗2次，然后根據(jù)說明書配置濃度為10 μM ROS檢測熒光探針(DCFH-DA)工作液，使用200 μL重懸細菌后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，離心后加入0.85%氯化鈉溶液洗兩次，再用200 μL PBS重懸，立即上流式細胞儀檢測，每組收集105個細菌的數(shù)據(jù)。

1.2.6 構建大蠟螟模型

1.2.6.1 大蠟螟毒力檢測試驗 以M-H肉湯中孵育的對數(shù)生長期細菌制備菌懸液,倍比稀釋成菌液濃度分別為107、106、105的3個試驗組，第4組為注射PBS對照組，第5組設置為空白對照組，使用25 μL微量注射器注射。將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱孵育96 h，每24 h觀察幼蟲存活量。同一濃度重復3次，計算每株菌的LD80。

1.2.6.2 大蠟螟體內(nèi)抗菌藥物敏感試驗 根據(jù)毒力試驗得到的LD80配制菌液濃度感染大蠟螟幼蟲。每株菌設置5組，每組15只幼蟲，其中1～3組為試驗組，注射相應濃度菌液；第4組為PBS對照組，注射PBS緩沖液；第5組為空白對照組。注射完畢后將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后對試驗組幼蟲模擬人體劑量一次性給予10 μL抗菌藥物，分為IMP單藥組、FOS單藥組和IMP+FOS聯(lián)合組，其中IMP和FOS的人體劑量分別為50、160 mg/kg。注射完抗菌藥物后，將幼蟲置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育96 h，每12 h觀察并記錄每組幼蟲死亡數(shù)量，比較存活率。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，每組試驗重復3次，采用t檢驗進行比較，對于生存率曲線比較，使用Log-rank(Mantel-Cox)檢驗分析結果。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 以IMP為基礎的聯(lián)合用藥對7株臨床分離MDR-AB的MIC及FICI IMP聯(lián)合FOS對其中5株MDR-AB的FICI值為0.281 2～0.5，為協(xié)同作用；對其中兩株菌FICI為0.5～1.0，為相加作用。IMP+FOS組聯(lián)用較其他組協(xié)同率高。見表1。

表1 IMP與4種抗菌藥物單用及聯(lián)合用藥對MDR-AB的作用結果(n=7)

2.2 IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB的殺菌曲線 IMP聯(lián)合FOS對菌株AB6624的殺菌曲線顯示，4×MIC的IMP與3×MIC的FOS聯(lián)合處理組在8 h的細菌菌落數(shù)較IMP和FOS單藥應用降低>2log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)合有協(xié)同效應，見圖1。菌株AB0153的殺菌曲線顯示，4×MIC的IMP與3×MIC的FOS處理組在4 h的細菌菌落數(shù)較兩藥單藥應用時降低>2log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同效應。4×MIC的IMP與3×MIC的FOS聯(lián)合處理組在24 h的細菌菌落數(shù)較初始接種量降低>3log10CFU/mL，說明兩藥聯(lián)用具有殺菌效應，見圖2。

圖1 IMP聯(lián)合FOS對菌株AB6624的殺菌曲線

圖2 IMP聯(lián)合FOS對菌株AB0153的殺菌曲線

2.3 IMP聯(lián)合FOS對AB6624、AB0153生物膜的影響 選取菌株AB6624、AB0153，通過結晶紫染色法測定IMP聯(lián)合FOS對菌株生物膜體外抑制活性。培養(yǎng)48 h后，AB6624與AB0153的兩藥聯(lián)合處理組OD(590)值均低于對照組(均P<0.01)，表明IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB生物膜形成具有抑制作用。見表2。

表2 結晶紫染色法測定IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥對菌株AB6624、AB0153生物膜形成的影響(n=3)

2.4 IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB生物膜內(nèi)細菌活力的影響 激光共聚焦顯微鏡進一步觀察IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB生物膜形成以及膜內(nèi)細菌存活的影響。根據(jù)前期試驗結果，選取菌株AB0153進行試驗，與對照組相比，IMP聯(lián)合FOS處理組生物膜>結構稀疏，細菌數(shù)量低于對照組及單藥處理組，說明兩藥聯(lián)合對細菌生物膜形成具有抑制作用。根據(jù)不同顏色熒光強度推算，兩藥處理組生物膜中包埋的死菌比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明兩藥聯(lián)合對MDR-AB生物膜中細菌具有抑制作用。見圖3、4。

注：綠色為活菌，紅色為死菌。

注：*表示P<0.05。

2.5 IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB內(nèi)ROS水平影響 為了探究IMP聯(lián)合FOS的殺菌機制，采用流式細胞儀分析兩藥聯(lián)合對菌株AB0153胞內(nèi)ROS水平影響，相比于對照組及單藥處理組，IMP聯(lián)合FOS處理組ROS水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示兩藥聯(lián)合可能通過提高細菌內(nèi)ROS水平發(fā)揮殺菌作用。見圖5、6。

圖5 IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥細菌內(nèi)ROS水平變化流式細胞術檢測峰圖(n=3)

注：*表示P<0.05；**表示P<0.01。

2.6 IMP單藥及聯(lián)合用藥大蠟冥生存率 菌株AB0153的LD80為1.0×106CFU/mL；IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB感染的幼蟲具有保護作用，兩藥聯(lián)合可以提高大蠟螟幼蟲的生存率(中位生存時間96 h)，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.022)。見圖7。

圖7 IMP與FOS單藥及聯(lián)合用藥后蠟螟幼蟲生存率曲線

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院內(nèi)免疫功能低下及病?；颊甙l(fā)生侵襲性感染的常見病原菌，近年來抗菌藥物的濫用導致MDR-AB的流行。碳青霉烯類抗生素是臨床治療耐多藥革蘭陰性桿菌感染的一線藥物，其耐藥性的增加使MDR-AB相關感染難以根除[4]。根據(jù)2021年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測結果，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌對IMP的耐藥率高達99.5%。FOS既往被用于治療大腸埃希菌引起的非復雜性尿路感染，近期研究[8, 14]表明，F(xiàn)OS聯(lián)合其他抗菌藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌等非發(fā)酵菌具有很強的抗菌活性，具體作用機制尚不明確。

本研究表明，IMP聯(lián)合FOS對MDR-AB主要表現(xiàn)為協(xié)同作用，兩藥聯(lián)合具有明顯的殺菌效應，相比于聯(lián)合其他抗菌藥物協(xié)同率高。生物膜形成是細菌的一種耐藥機制，細菌可以在生物膜中生長并躲避機體免疫應答，阻礙抗菌藥物發(fā)揮作用，而FOS與其他抗菌藥物聯(lián)合使用可以穿透細菌生物膜結構并抑制生物膜形成[7, 15]。本試驗選取的MDR-AB菌株具有強生物膜形成能力，IMP聯(lián)合FOS可以顯著抑制其生物膜形成并破壞生物膜結構，生物膜內(nèi)活菌數(shù)量降低，提示兩藥聯(lián)合可能通過抑制生物膜形成發(fā)揮協(xié)同作用。ROS是生物有氧能量代謝中生成的副產(chǎn)物，當細菌在抗菌藥物作用下發(fā)生ROS過量積累時可以通過芬頓反應產(chǎn)生大量羥自由基，羥自由基可以直接損傷DNA、破壞蛋白質(zhì)及脂質(zhì)，從而導致細胞死亡，近年來被認為是與殺菌抗生素活性相關的機制之一[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，相比于空白對照組和單藥處理組，IMP聯(lián)合FOS可以提高細菌內(nèi)ROS水平，說明兩藥聯(lián)合可能通過促進ROS的產(chǎn)生發(fā)揮協(xié)同作用。體內(nèi)大蠟螟感染模型試驗進一步驗證兩藥的協(xié)同效應，IMP聯(lián)合FOS治療后的感染組大蠟螟存活率高于單藥治療組以及對照組，說明兩藥聯(lián)合對感染鮑曼不動桿菌的大蠟螟幼蟲具有保護作用。

綜上所述，本試驗通過收集臨床的MDR-AB，構建體內(nèi)外試驗觀察IMP聯(lián)合FOS的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用，并且可以通過抑制細菌生物膜形成及促進ROS產(chǎn)生參與殺菌過程。兩藥聯(lián)合較單藥應用對感染MDR-AB的大蠟螟具有更好的療效，為IMP聯(lián)合FOS臨床治療MDR-AB感染提供了證據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。