張 娜，孟 標，金美玲，陳佳麗，楊曉靜，劉芳妮，秦世宇，劉 雄，王長軍，陳 勇

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室, 遼寧 沈陽 110122； 2. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心應(yīng)急處置大隊，北京 100071； 3. 安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與統(tǒng)計學(xué)系，安徽 合肥 230032； 4. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心有害生物防制科，北京 100071； 5. 鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001； 6. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心信息科，北京 100071； 7. 中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)勤部，北京 100071)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬于條件致病菌，是常見的臨床患者感染的致病菌之一。抗菌藥物在臨床中廣泛使用，導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥的KP數(shù)量越來越多。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)是臨床常見耐藥菌，其檢出率呈不斷升高趨勢[1-3]。臨床CRKP常見標本來源包括尿、血、呼吸道分泌物和無菌體液等[2]。年老體弱、侵襲性操作[4]和基礎(chǔ)疾病[5]是臨床患者感染CRKP的主要因素。近年來，CRKP所致血流感染的病例越來越多[6]，該類患者病情兇險、預(yù)后差，部分文獻報道CRKP血流感染患者病死率高達71.9%，遠高于其他部位感染的病死率(21.9%)[7]，CRKP已成為全球范圍內(nèi)患者正在面臨的嚴重安全威脅。為研究不同標本來源CRKP在攜帶耐藥基因、毒力基因和質(zhì)粒數(shù)量等方面有無差異，筆者對公共數(shù)據(jù)庫2011—2020年的CRKP基因組測序數(shù)據(jù)進行篩選分析，為深入了解不同標本類型CRKP感染的臨床特點和感染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源和篩選標準 本研究從Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC)[8]數(shù)據(jù)庫(PATRIC數(shù)據(jù)庫提供全面的細菌基因組學(xué)數(shù)據(jù)和與基因組分析相關(guān)的大量數(shù)據(jù)，相比于NCBI數(shù)據(jù)庫，標本來源、分離國家、耐藥情況等基礎(chǔ)信息更完善，更便于進行比較分析)下載2011—2020年間所有的KP基因組測序數(shù)據(jù)，根據(jù)宿主、標本來源、對碳青霉烯類抗生素耐藥等信息進行篩選，納入標準包括：(1)人類宿主；(2)按照2020年中國細菌耐藥檢測結(jié)果的分類情況[2]并結(jié)合收集到的標本類型，確定標本來源為血、尿、肺泡灌洗液、無菌體液、傷口膿液、糞便、呼吸道標本和導(dǎo)管標本共8個類型；(3)菌株攜帶碳青霉烯酶基因；(4)分離國家等基礎(chǔ)信息完整。排除標準：(1)分離自人類以外的宿主；(2)除血、尿、肺泡灌洗液、無菌體液、傷口膿液、糞便、呼吸道標本和導(dǎo)管標本以外的標本來源；(3)不攜帶碳青霉烯酶基因；(4)分離時間、分離地區(qū)、標本來源、基因組數(shù)據(jù)等信息不完整。

1.2 毒力基因、耐藥基因、質(zhì)粒和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)分析 應(yīng)用kleborate[9]軟件對菌株進行物種鑒定，并篩選其是否攜帶CARD[10]數(shù)據(jù)庫中存在的碳青霉烯酶基因。應(yīng)用abricate軟件，將基因組序列與CARD、VFDB[11]和PlasmidFinder[12]數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得每個菌株攜帶毒力基因、耐藥基因和質(zhì)粒的情況。選擇肺炎克雷伯菌HS11286 (GenBank assembly accession: GCA_000240185.2)作為參考基因組。應(yīng)用snippy軟件，將各菌株基因組與參考基因組進行對比分析，獲得各菌株SNPs數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用IBM SPSS 23.0和R v4.2.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。毒力基因、耐藥基因和質(zhì)粒等計數(shù)資料采用中位數(shù)[M(P25，P75)]進行統(tǒng)計描述，采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-WallisH秩和檢驗)比較多個組間總體差異，曼-惠特尼U檢驗比較兩組間差異。采用卡方檢驗對不同率或百分比之間的差異進行統(tǒng)計學(xué)比較，P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRKP基因組序列的篩選和標本分布 對2011—2020年10年間PATRIC公共數(shù)據(jù)庫中12 774株KP進行篩選后納入2 356個符合篩選條件的CRKP基因組序列進行分析，其中2011—2015年1 621株(20.92%，共計7 749株)，2016—2020年735株(14.63%，共計5 025株)。尿(797株，33.83%)、血(706株，29.97%)、呼吸道(366株，15.53%)和糞便(231株，9.80%)為主要標本來源。血標本CRKP的數(shù)量每年均位居前3位，提示血是CRKP最常見標本來源之一。見圖1。

圖1 2011—2020年不同標本來源CRKP的數(shù)量分布

2.2 提交CRKP基因組序列的國家/地區(qū)分布 美國在2013—2014年提交至數(shù)據(jù)庫的KP感染基因組數(shù)據(jù)較多，使這兩年納入分析的CRKP基因組樣本明顯增多，2013年397株，2014年296株。2011—2015年美國提交CRKP基因組序列數(shù)量最多(n=1 001)，占該5年所有CRKP序列數(shù)量的61.75%。2016—2020年提交CRKP基因組序列數(shù)量最多的國家分別是泰國(n=188)、中國(n=187)、巴西(n=93)和印度(n=69)，占這5年所有CRKP序列數(shù)量的73.06%，其他國家/地區(qū)提交CRKP基因組序列總體較少。見表1。

表1 2011—2020年不同國家/地區(qū)提交CRKP基因組序列數(shù)量(株)

續(xù)表1 (Table 1， Continued)

2.3 碳青霉烯酶基因分布情況 2 356株CRKP菌株中最常見的5種碳青霉烯酶基因為：blaKPC-2(50.51%)、blaKPC-3(21.39%)、blaNDM-1(11.50%)、blaOXA-232(10.48%)和blaOXA-48(7.39%)。7.05%的CRKP菌株攜帶多個碳青霉烯酶基因。美國來源的CRKP菌株攜帶的碳青霉烯酶以blaKPC-2和blaKPC-3為主，巴西和中國以攜帶blaKPC-2為主，泰國主要攜帶blaOXA-232和blaNDM-1，意大利和葡萄牙以blaKPC-3為主，俄國、西班牙主要攜帶blaOXA-48。產(chǎn)KPC-2(50.51%)是CRKP對碳青霉烯類藥物耐藥的主要機制，但不同碳青霉烯酶基因在標本整體和不同標本類型中占比不同。blaKPC-2整體占比由2011—2015的54.8%降至2016—2020的41.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，除blaKPC-2外的其他碳青霉烯酶基因占比在2016—2020年里均明顯增加。尿中以blaKPC-2(46.05%)、blaKPC-3(31.62%)、blaNDM-1(9.91%)和blaOXA-48(7.78%)為主；血中以blaKPC-2(51.98%)、blaKPC-3(22.10%)、blaOXA-232(8.22%)和blaOXA-48(6.94%)為主；呼吸道標本以blaKPC-2(59.56%)、blaOXA-232(20.22%)和blaNDM-1(14.21%)為主；糞便以blaKPC-2(50.22%)、blaOXA-232(36.36%)和blaNDM-1(31.17%)為主；傷口膿液中以blaKPC-2(48.89%)、blaOXA-48(20.74%)和blaKPC-3(18.52%)為主；無菌體液以blaKPC-2(48.39%)、blaKPC-3(27.42%)和blaOXA-48(9.68%)為主；肺泡灌洗液以blaKPC-2(47.37%)、blaKPC-3(26.32%)和blaNDM-1(10.53%)為主；導(dǎo)管標本以blaKPC-2(38.10%)、blaNDM-1和blaOXA-48(均19.05%)為主。見表2。

表2 2011—2020年不同碳青霉烯酶基因在8種類型標本中的分布情況[株(%)]

2.4 分子分型特征 2 356株CRKP可劃分為133個多位點序列型別(ST型)，其中，2011—2015年有101個ST型，2016—2020年有65個ST型。常見的型別包括ST258(33.19%, 782株)、ST11(16.00%, 377株)、ST307(8.91%, 210株)、ST16(7.77%, 183株)、ST512(5.01%, 118株)、ST15(3.82%, 90株)和ST147(3.18%, 75株)。ST258型主要集中在2012—2015年(90.15%，705/782)；ST11型2015、2016和2018年最多，占所有ST11型的62.60%(236/377)；ST307型2012—2015年出現(xiàn)較多(89.05%，187/210)；ST16型CRKP主要出現(xiàn)在2016—2019年(89.07%，163/183)。

2.5 不同標本類型CRKP耐藥、質(zhì)粒和毒力基因攜帶數(shù)量比較 CRKP菌株攜帶耐藥基因、質(zhì)粒和毒力基因數(shù)量的M(P25，P75)分別為18(16，20)、4(3，5)和60(57，68)。不同標本來源的CRKP攜帶耐藥基因數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.055)，攜帶毒力基因和質(zhì)粒數(shù)量之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。糞便來源的CRKP菌株攜帶耐藥基因、質(zhì)粒和毒力基因的數(shù)量較多，其M(P25,P75)分別為19(16，21)、5(3，6)、63(61，69)；導(dǎo)管來源CRKP主要攜帶iutA、iucA、iucB、iucC、iucD(均為19.0%，4/21)；rmpA和rmpA2在肺泡灌洗液來源CRKP中數(shù)量最多，分別占比7.9%(3/38)和15.8%(6/38)；無菌體液中CRKP攜帶iro(iroB、iroC、iroD、iroN)基因比率高于其他標本類型CRKP(6.5%，4/62)，不同標本類型的CRKP攜帶關(guān)鍵毒力基因(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD、rmpA、rmpA2、iroB、iroC、iroD、iroN)數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

不同標本來源的CRKP菌株SNPs數(shù)量為2 924～41 470(P=0.414)，其中呼吸道分泌物CRKP菌株SNP變異位點數(shù)量最少[7 419(7 017, 24 156)]，糞便標本CRKP含有SNPs變異位點數(shù)量最多[20 148(3 528, 24 233)]，不同樣本類型CRKP攜帶SNPs的數(shù)量見圖2。

圖2 不同標本類型CRKP的SNPs數(shù)量比較

對706份血標本與1 650份非血標本來源的CRKP耐藥基因、毒力基因和質(zhì)粒攜帶數(shù)量進行比較，發(fā)現(xiàn)血標本來源CRKP[60(58, 69)]比其他標本類型CRKP[60(56, 67)]攜帶更多毒力基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。見表4。

表4 血標本與其他標本來源的CRKP耐藥基因、質(zhì)粒、毒力基因和SNPs攜帶情況

3 討論

國內(nèi)外CRKP的感染情況日益嚴重，對患者入院治療和預(yù)后影響巨大。以往關(guān)于CRKP的研究主要為基于局部地區(qū)所有標本類型的研究或單一標本來源的研究，如某醫(yī)院、某區(qū)域所有CRKP菌株的流行病學(xué)特征和基因組研究，以探究其流行、傳播和進化機制，但比較不同標本類型CRKP差異的相關(guān)研究還不充分。

本研究對2011—2020年P(guān)ATRIC數(shù)據(jù)庫中所有符合篩選標準的CRKP進行分析，發(fā)現(xiàn)尿、血和呼吸道標本是臨床CRKP感染的主要標本類型。與以往研究[13]相比，血標本CRKP在所有CRKP中的占比有所提升。美國在2013—2014年提交CRKP的數(shù)量較多，可能與該時間段美國對KP的關(guān)注突然增加有關(guān)。美國和中國分別以ST258型(63.66%)和ST11型(79.22%)為主要序列類型，與以往研究[14-15]相同。10年間，不同碳青霉烯酶類型在各標本來源CRKP中的比例發(fā)生改變，雖仍以KPC-2為主，但其他類型碳青霉烯酶占比增加，提示CRKP菌株的耐藥基因型向復(fù)雜多樣化進化。

CRKP往往攜帶多種碳青霉烯酶耐藥基因，常見blaKPC-2和blaNDM-1，主要流行于ST11型CRKP菌株；blaVIM-1、blaVIM-2、blaOXA-232主要流行于ST23型CRKP菌株[16]。血標本來源CRKP以產(chǎn)碳青霉烯酶為最常見的耐藥機制，編碼該酶的基因位于細菌質(zhì)?；蛉旧w上，通過轉(zhuǎn)座子或結(jié)合性質(zhì)粒等移動元件在菌株與人群之間廣泛傳播。各個國家分離的菌株產(chǎn)碳青霉烯酶類型各不相同，與既往研究[17]一致，在美國，產(chǎn)KPC酶為CRKP最常見耐藥機制；OXA-48和NDM-1是埃及癌癥患者感染的CRKP中最常見的類型[18]。本組研究顯示，分離自泰國的CRKP菌株主要攜帶NDM-1，質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC-2的水平傳播是我國臨床CRKP的主要耐藥機制，俄國、西班牙和葡萄牙等歐洲國家的CRKP菌株主要攜帶OXA-48。許多地區(qū)都存在主要流行的碳青霉烯酶類型，提示地理位置和區(qū)域管轄對CRKP的傳播進化影響密切。

血標本來源的CRKP在攜帶質(zhì)粒和毒力基因(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD、rmpA、rmpA2、iroB、iroC、iroD、iroN等)方面與其他7個標本類型存在差異，血標本中分離的CRKP攜帶更多數(shù)量的毒力基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)，提示血標本來源CRKP感染者的高病死率可能與菌株攜帶更多毒力基因有關(guān)。既往研究也在所有血標本肺炎克雷伯菌中檢測到毒力基因，其中84.13%的菌株攜帶高毒力基因[19]，攜帶iutA等高毒力基因是血流感染CRKP患者死亡的獨立危險因素[20]，證實CRKP菌株攜帶毒力基因與患者感染后高病死率有直接關(guān)聯(lián)。

本研究存在一定局限性，首先，由于PATRIC公共數(shù)據(jù)庫菌株信息受全球地區(qū)不同經(jīng)濟狀況及提交數(shù)據(jù)課題組研究方向偏好等因素影響，菌株基因組信息代表性可能不夠強，但該數(shù)據(jù)庫提供了較完善的菌株背景信息，為研究肺炎克雷伯菌的基因組特征提供了較好的資源。其次，現(xiàn)有研究顯示菌株基因型和表型之間還存在差異，但由于本研究對象均為PATRIC公共數(shù)據(jù)庫的基因組信息，缺乏相關(guān)實驗研究證實。

本研究通過分析從PATRIC公共數(shù)據(jù)庫中收集的不同標本類型的CRKP攜帶毒力基因、耐藥基因和質(zhì)粒數(shù)量情況，發(fā)現(xiàn)不同標本類型的CRKP攜帶毒力基因和質(zhì)粒數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，血標本CRKP相比其他標本來源的CRKP攜帶更多的毒力基因，在一定程度上反映了公共數(shù)據(jù)庫中不同標本來源CRKP的分布特征，以及耐藥基因、質(zhì)粒和毒力基因的攜帶水平，為后續(xù)CRKP的耐藥和毒力相關(guān)研究提供參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。