王靜 苗姝 佟金平 王濤

(1.大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116021；2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)一科，遼寧 大連 116001)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一組病因未明、以彌漫性肺泡炎癥、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、肺間質(zhì)纖維化改變?yōu)椴±硖卣鞯拈g質(zhì)性肺病[1]。目前在臨床指南中雖有吡非尼酮、尼達(dá)尼布等抗纖維化藥物，但治療效果仍不理想，5年存活率無(wú)明顯改善[2]。在臨床中通常采用高分辨CT(HRCT)顯示的雙下肺“蜂窩影”及肺功能作為診斷及評(píng)估特發(fā)性肺纖維化的重要標(biāo)準(zhǔn)和病情的嚴(yán)重程度，但出現(xiàn)這些典型的臨床特征時(shí)患者通常已經(jīng)進(jìn)入晚期，同時(shí)存在呼吸困難的一些老年患者常無(wú)法完成肺功能檢查，對(duì)病情嚴(yán)重程度的評(píng)估造成困難[3-4]。因此尋找早期診斷IPF、評(píng)估IPF嚴(yán)重程度的無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)記物成為近幾年間質(zhì)性肺病研究領(lǐng)域的熱門(mén)方向。已有的研究證實(shí)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(Type Ⅱalveolar epithelial cells， AECsⅡ)在慢性持續(xù)性損傷病理?xiàng)l件下會(huì)誘導(dǎo)肺間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞聚集與細(xì)胞外基質(zhì)沉積，成為啟動(dòng)IPF進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)[5]。國(guó)外基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)涎液化糖鏈抗原6(Krebs von den lungen-6，KL-6) 是AECsⅡ損傷后持續(xù)性分泌的一種黏蛋白樣糖蛋白，能夠反映肺纖維化病理?xiàng)l件下AECsⅡ的損傷程度[6]。國(guó)外最新研究也報(bào)道了KL-6的表達(dá)水平與IPF的嚴(yán)重程度、生存預(yù)后存在明確的相關(guān)性[6-7]。但國(guó)內(nèi)對(duì)KL-6在IPF患者中的臨床價(jià)值及其臨床應(yīng)用幾近空白。因此，本研究檢測(cè)IPF患者血清及肺泡灌洗液中KL-6的表達(dá)水平，根據(jù)KL-6的表達(dá)水平，分析KL-6與IPF病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為將來(lái)作為IPF早期診斷、病情監(jiān)測(cè)、預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月～2021年3月在大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院門(mén)診、住院診斷及治療的 IPF患者作為本研究的觀察組，共80例，其中男性70例，女性10例；年齡53～78歲，平均(62.48 ±5.76) 歲；病程8～36(14.76±5.67)個(gè)月。同時(shí)選取在本院門(mén)診體檢的同年齡段、性別比例一致的正常人群作為本研究項(xiàng)目的健康對(duì)照組，共80例。IPF的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2011年美國(guó)胸科學(xué)會(huì)/歐洲呼吸學(xué)(ATS/ERS/JRS/ALAT)定制的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：近2個(gè)月內(nèi)曾使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療者；合并惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎疾病、糖尿病等代謝性疾病者。IPF急性加重(AEIPF)的診斷標(biāo)準(zhǔn): ①I(mǎi)PF患者近1月內(nèi)出現(xiàn)不明原因的呼吸困難加重。②高分辨率CT(HRCT)在原有病變基礎(chǔ)上出現(xiàn)新發(fā)雙肺磨玻璃影伴或不伴實(shí)變影。③缺乏直接的感染證據(jù)。④除外左心衰、肺栓塞、急性肺損傷等誘因。根據(jù)該判定標(biāo)準(zhǔn)，在80例IPF患者中，10例患者發(fā)生了AEIPF，剩余70例患者均處于穩(wěn)定期。本項(xiàng)目經(jīng)大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(20220321)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 肺功能全套檢測(cè) 兩組患者均使用肺功能儀(德國(guó)耶格Master Screen Pneumo )進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括：用力肺活量(Forced vital capacity，F(xiàn)VC)、1秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume in one second /predict value，F(xiàn)EV1% pred)及一氧化碳彌散量占預(yù)計(jì)值的百分比(DLco% pred)。

1.2.2 HRCT檢查 使用美國(guó)GE公司Light SpeedVCT 64排螺旋CT掃描儀對(duì)所有入組患者進(jìn)行HRCT檢查。仰臥位，先行平掃，呼氣末自肺尖掃描至膈頂進(jìn)行掃描。層厚1.25 mm、準(zhǔn)直1.5 mm、層間距10 mm、管電流250 mA、電壓120 kV、矩陣512×512掃描結(jié)束后行高空間分辨率重建，視野45 mm×45 mm。肺窗(窗寬2000HU、窗位-550HU)、縱膈窗(窗寬450HU、窗位55HU)拍攝CT片，重點(diǎn)觀察間質(zhì)的病變。以主動(dòng)脈弓、右下肺靜脈為界限，分為左右上、中、下3個(gè)肺區(qū)，觀察各個(gè)肺區(qū)病變及受累情況，肺纖維化程度的量化評(píng)分參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8]。

1.2.3 ELISA檢測(cè)血清與支氣管肺泡灌洗液(BALF)總KL-6的表達(dá)水平 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA，購(gòu)于武漢三鷹生物科技有限公司)檢測(cè)兩組患者血清KL-6的表達(dá)水平。ELISA 檢測(cè)觀察組BALF中KL-6的表達(dá)水平。于空腹?fàn)顟B(tài)抽取的肘靜脈血，3000 rpm條件下離心，時(shí)間10 min，分離上層血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)說(shuō)明書(shū)，采用KL-6 ELISA 試劑盒上樣檢測(cè)。

1.2.4 BALF的留取 術(shù)前常規(guī)霧化利多卡因進(jìn)行吸入麻醉(20 min)。麻醉結(jié)束后再行檢支氣管鏡的檢查，選擇右肺中葉或左肺舌葉進(jìn)行灌洗，灌洗量約50 mL的生理鹽水進(jìn)行灌洗， 回收率需要>30%?；厥蘸蟮腂ALF離心保存方法同前。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 對(duì)照組與觀察組在性別、年齡、吸煙史、體重指數(shù)方面的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P>0.05)。與健康對(duì)照組相比，肺功能指標(biāo)FVC% pred、FEV1% pred、DLco% pred指標(biāo)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

表1 兩組臨床資料的對(duì)比

2.2 KL-6在兩組血清中表達(dá)含量的比較 KL-6在IPF組患者外周血中的表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；KL-6在BALF液中的表達(dá)水平同樣也高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 KL-6在兩組患者血清中表達(dá)含量的比較

2.3 不同HRCT評(píng)分患者KL-6水平比較 不同HRCT評(píng)分的比較，在HRCT評(píng)分方面觀察組要高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在觀察組中65例患者HRCT評(píng)分≤4分，35例患者>4分。HRCT評(píng)分≤4 的IPF患者血清、BALF中KL-6的表達(dá)水平要低于>4分的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同HRCT評(píng)分患者臨床樣本中KL-6水平比較

2.4 KL-6在IPF穩(wěn)定期和AEIPF患者血清中的水平比較 與IPF穩(wěn)定期患者相比，KL-6在AEIPF患者血清中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 KL-6在穩(wěn)定期和急性加重期患者血清中的比較

2.5 KL-6表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)、HRCT評(píng)分的相關(guān)性分析 統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示KL-6與FVC、FEV1% pred、DLco% pred呈明顯的負(fù)性相關(guān)(P<0.05)；與HRCT評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 IPF患者臨床樣本中 KL-6與肺功能參數(shù)、HRCT 評(píng)分的相關(guān)性

2.6 KL-6預(yù)測(cè)特發(fā)性肺纖維化發(fā)生效能 ROC曲線結(jié)果顯示，血清KL-6、肺功能DLco% pred對(duì)于預(yù)測(cè)IPF發(fā)生的AUC值分別為：0.9380、0.9700。其中KL-6的cutoff值敏感度0.907，特異性0.833；肺功能DLco% pred的cutoff值敏感度0.937，特異性0.889。KL-6與DLco% pred預(yù)測(cè)IPF發(fā)生的臨床效能均可靠。見(jiàn)圖1。

圖1 ROC曲線統(tǒng)計(jì)血清KL-6、肺功能DLco% pred對(duì)IPF發(fā)生的預(yù)測(cè)效能

3 討論

IPF是一類難治性的間質(zhì)性肺病，其進(jìn)展速度快，治療效果差，患者的死亡率居高不下[9]。在過(guò)去十年中，除吡非尼酮、尼達(dá)尼布兩個(gè)抗纖維化藥物外，在治療領(lǐng)域幾乎沒(méi)有新進(jìn)展[9]。上述抗纖維化藥物雖然在一定程度上緩解了IPF患者的肺功能，但患者的生存期仍不理想。因此，尋找診斷IPF的生物標(biāo)志物對(duì)疾病的早期判斷、病情評(píng)估、臨床預(yù)后具有重要的臨床意義。與現(xiàn)有的診斷方法相比，血清標(biāo)志物的檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，可以盡早地對(duì)IPF進(jìn)行診斷，在整個(gè)疾病過(guò)程中可以動(dòng)態(tài)地進(jìn)行病情評(píng)估。

KL-6 是AECsⅡ細(xì)胞膜上的糖類蛋白，在I型肺泡上皮細(xì)胞、細(xì)支氣管上皮細(xì)胞表面也有少量表達(dá)[10]。AECsⅡ在慢性損傷條件下，自身修復(fù)功能受損，過(guò)多分泌KL-6蛋白，誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生，加速了肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，最終形成了終末期蜂窩肺的影像學(xué)表現(xiàn)[11-12]。國(guó)外有學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了KL-6從上皮細(xì)胞脫落進(jìn)入外周血循環(huán)中與結(jié)締組織病肺間質(zhì)病變程度明顯相關(guān)，且隨病的嚴(yán)重程度的變化，KL-6在血液中的濃度會(huì)逐漸升高[13-14]。在本研究結(jié)果中借助臨床樣本也發(fā)現(xiàn)了KL-6 與IPF有關(guān)，KL-6在IPF患者血清中的濃度要高于正常健康人群。這與KL-6在IPF進(jìn)展中的基礎(chǔ)研究報(bào)道是相符的。

呼吸困難往往是IPF患者最明顯的臨床癥狀，而當(dāng)患者出現(xiàn)明顯呼吸困難時(shí)，通常提示患者的肺部可能已經(jīng)出現(xiàn)了纖維化[15]。但要確診IPF及評(píng)估病情嚴(yán)重程度仍需借助于傳統(tǒng)的HRCT及肺功能檢查項(xiàng)目。IPF在HRCT的特征性表現(xiàn)是雙下肺沿胸膜下分布的“蜂窩”影，肺功能則主要表現(xiàn)為限制性肺通氣功能障礙和彌散功能障礙[16]。通過(guò)上述兩項(xiàng)檢測(cè)可以間接反映其病理?yè)p傷程度，因?yàn)楫?dāng)肺間質(zhì)中出現(xiàn)及肌成纖維細(xì)胞聚集及過(guò)度的膠原蛋白沉積的時(shí)候往往是造成肺間質(zhì)增寬及“蜂窩”影的重要原因，同時(shí)這也意味著IPF病情已進(jìn)入晚期[17-18]。在臨床實(shí)踐中，早期的IPF并無(wú)特異性的臨床表現(xiàn)，又因?yàn)槔夏昊颊咦鳛镮PF發(fā)病的主要人群往往無(wú)法配合肺功能的實(shí)施給臨床的診斷、評(píng)估病情及判斷預(yù)后都成為目前臨床面臨的難題。

國(guó)外報(bào)道及本項(xiàng)目研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了KL-6在IPF患者與健康對(duì)照患者的臨床樣本中存在明顯的差異性表達(dá)[19-20]。鑒于這一發(fā)現(xiàn)，本項(xiàng)目推測(cè)KL-6對(duì)IPF的早期診斷、病情評(píng)估、判斷預(yù)后均有幫助。研究中除了發(fā)現(xiàn)IPF患者血清和BALF中KL-6表達(dá)水平升高外，還發(fā)現(xiàn)了KL-6與肺功能指標(biāo)中FVC、FEV1% pred、DLco% pred呈負(fù)性相關(guān)，同時(shí)HRCT顯示肺纖維化程度、受累范圍增加的IPF患者中，KL-6的血清濃度也是升高的。在隨訪IPF患者期間，發(fā)生急性加重的患者的血清樣本中KL-6的表達(dá)水平升高程度更為顯著。此外，本研究通過(guò)ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KL-6在預(yù)測(cè)IPF發(fā)生機(jī)率中均有較高的效能。這些結(jié)果均提示KL-6可作為早期診斷IPF、監(jiān)測(cè)病情進(jìn)展、判斷預(yù)后的一項(xiàng)良好的臨床參考指標(biāo)。

盡管在IPF的研究領(lǐng)域中還有諸多問(wèn)題尚不明確，但是生物標(biāo)志物可以幫助解決IPF患者早期診斷、早期干預(yù)等精準(zhǔn)醫(yī)療的重要問(wèn)題。同時(shí)IPF新藥的上市也迫切需要可靠的生物指標(biāo)對(duì)其治療效果進(jìn)行精準(zhǔn)評(píng)估。本研究雖然驗(yàn)證了KL-6在IPF患者臨床樣本中表達(dá)的臨床意義，但其作為標(biāo)志物分子聯(lián)合診斷IPF的特異性、準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步擴(kuò)大臨床樣本量進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

KL-6表達(dá)水平的高低與IPF患者的肺功能參數(shù)、HRCT評(píng)分、病情嚴(yán)重程度之間有明確的相關(guān)性，可作為IPF病情評(píng)估、預(yù)后判定的生物學(xué)指標(biāo)。