閆雪 崔蕊 熊曉毅 張敏龍

(1.咸陽職業(yè)技術學院醫(yī)學院，陜西 咸陽 712000；2.空軍軍醫(yī)大學預防醫(yī)學系，陜西 西安 710032；3.空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院呼吸科，陜西 西安 10038；4.解放軍總醫(yī)院呼吸與危重癥學部，北京 100091)

Semaphorins家族蛋白是由一系列結構相對保守的糖蛋白組成，其特征性的結構是由大約500個氨基酸組成的sema結構域。該蛋白家族最早是在神經(jīng)系統(tǒng)中因誘導軸突生長被發(fā)現(xiàn)的。后續(xù)的研究證實，該類蛋白在血管形成、免疫反應以及腫瘤侵襲轉移等方面也有重要作用[1-2]。Semaphorins家族根據(jù)結構特點分為8個亞型。Semaphorin 7A(SEMA7A)，是一種分子量 80000的GPI 錨鏈的膜相關糖蛋白[3]。SEMA7A 是通過與其兩類不同的受體(β1-integrin和Plexin C1)結合而發(fā)揮作用的，有研究表明，與β1-integrin相互作用在免疫及炎癥反應等方面有重要作用[4]，而與Plexin C1相互作用在細胞粘附、樹突化以及細胞骨架改變等方面有主要作用[5]。此外，還有研究證實SEMA7A也參與了腫瘤細胞的侵襲過程[6-7]，其中膠質(zhì)瘤的高侵襲細胞株中發(fā)現(xiàn)了SEMA7A蛋白的高表達，而SEMA7A與Plexin C1的相互作用也被認為在黑色素瘤的侵襲和轉移中有重要作用，但SEMA7A及其受體在肺癌中的相關研究還較少。非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺部腫瘤中最為常見的類型，腫瘤的侵襲及轉移與患者的治療和預后密切相關[8-10]，其中趨化因子受體7(Chemokine receptor-7，CCR-7)作為趨化因子受體成員，在腫瘤向血液及淋巴系統(tǒng)中趨化侵襲中有關鍵性的作用[11-13]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)家族是公認的腫瘤粘附轉移起始階段關鍵蛋白酶，其中以MMP-2以及MMP-9最為重要，抑制該類蛋白的表達則能抑制腫瘤的生長及侵襲能力[14-15]。結合上述背景及機制，在該研究中，我們探究了SEMA7A及其受體對非小細胞肺癌A549細胞株侵襲及轉移的作用，同時也探討了與CCR-7、MMP-2以及MMP-9的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 SEMA7A抗體購于Abcam公司，β1-integrin和Plexin C1抗體、Recombinant SEMA7A (rSEMA7A)購于R&D公司。CCR-7、MMP-2以及MMP-9抗體購于Cell Signaling公司，β-actin抗體購于Santa Cruz公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 正常肺泡上皮細胞系(Human pulmonary alveolar epithelial cells，NPC)以及A549細胞用含有100U/mL青鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。SEMA7A小干擾RNA(siRNA)沉默靶點序列：5′-GGACCAAGCCTATGATGAT-3′ Plexin C1 siRNA沉默靶點序列：5′-CCCTTCCTTGACTACAAACAT-3′ 。siRNA轉染入細胞通過Lipofectamine 2000。轉染48小時后，再給予細胞后續(xù)刺激等處理。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 Western-blot法檢測蛋白表達 取適量的培養(yǎng)細胞，加入蛋白裂解液于冰上進行勻漿，離心并收集上清液，定量，用沸水煮15 min，電泳并轉膜。封閉2 h，加入1∶1000稀釋的一抗，4℃過夜，然后加入1∶5000稀釋二抗，37℃溫育1 h，ECL顯色，避光保存并照相，做灰度掃描處理。

1.3.2 劃痕實驗 首先A549細胞在六孔板中種植，并在孔中將siRNA進行轉染，用無菌的1 mL移液管在細胞層上做直線劃痕，然后分別在0 h及24 h后對細胞層劃痕處進行顯微鏡下拍攝，觀測各組劃痕差異。

1.3.3 Transwell細胞遷移實驗 將轉染及處理后的各組細胞用消化液消化并懸浮于無血清培養(yǎng)基中，在24孔板中設置transwell小室，每孔上層中個加入200 μL細胞懸浮液，下層加入800 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，然后孵育24 h。將孵育好的細胞用4%多聚甲醛固定30 min，0.2% Triton X-100穿透15 min，然后用0.05%結晶紫染液染色5 min，最后顯微鏡下拍照觀察細胞遷移情況。

2 結果

2.1 SEMA7A及其受體在A549細胞中的表達 與正常肺泡上皮細胞對比，A549細胞中SEMA7A及Plexin C1的表達明顯增多(P<0.05)，但β1-integrin的表達和正常肺上皮細胞中變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 SEMA7A及其受體在A549細胞中的表達

2.2 SEMA7A及PlexinC1沉默表達后蛋白變化 A549細胞中SEMA7A siRNA及Plexin C1 siRNA作用后，SEMA7A及Plexin C1蛋白的表達受到了明顯的抑制，見圖2。

圖2 SEMA7A及PlexinC1在A549細胞中的表達

2.3 SEMA7A及其受體Plexin C1對A549細胞遷移的影響 A549細胞劃痕24 h后出現(xiàn)了明顯的增殖和遷移，且給予rSEMA7A(100 ng/mL)后，細胞遷移更加顯著，但沉默表達SEMA7A或其受體Plexin C1后，細胞的遷移出現(xiàn)了顯著的抑制，同樣在tranwell遷移實驗中也出現(xiàn)了相同的現(xiàn)象，見圖3。

圖3 SEMA7A及Plexin C1對A549細胞遷移的影響

2.4 SEMA7A與A549細胞中CCR-7、MMP-2及MMP-9表達的關系 與空白對照組及空白質(zhì)粒(Scr siRNA)組對比，SEMA7A沉默表達后CCR-7、MMP-2及MMP-9的表達出現(xiàn)了不同程度的下降，見圖4。

圖4 SEMA7A對A549細胞CCR-7、MMP-2及MMP-9表達情況的影響

2.5 SEMA7A與Plexin C1受體相互作用對A549細胞中CCR-7、MMP-2及MMP-9表達的影響 與空白對照組對比，rSEMA7A刺激后CCR-7、MMP-2及MMP-9的表達明顯升高，但給予Plexin C1沉默表達后，上述3種蛋白表達出現(xiàn)了不同程度下降，見圖5。

圖5 SEMA7A與Plexin C1受體相互作用對A549細胞中CCR-7、MMP-2及MMP-9表達的影響

3 討論

NSCLC是最為常見的腫瘤類型之一，探究NSCLC轉移及侵襲的機制對于腫瘤的控制和治療有著重要的意義[16]。在本研究中，我們探究了SEMA7A及其受體Plexin C1對NSCLC A549細胞系轉移的影響及相關機制。發(fā)現(xiàn)A549細胞中SEMA7A及其受體Plexin C1表達高于正常肺泡上皮組織。另外，重組SEMA7A刺激后會引起腫瘤細胞轉移增多及轉移相關蛋白CCR-7、MMP-2和MMP-9表達增加。而將SEMA7A或其受體Plexin C1沉默表達后分別出現(xiàn)了腫瘤細胞轉移效率下降，同時CCR-7、MMP-2和MMP-9出現(xiàn)了下降。

SEMA7A最初是在胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)對神經(jīng)細胞軸突延伸有重要作用。其后又發(fā)現(xiàn)了其對免疫系統(tǒng)有重要作用，如調(diào)節(jié)T細胞功能，刺激樹突狀細胞激活及炎癥因子產(chǎn)生等作用[4, 17]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)SEMA7A能夠影響腫瘤的進展[7]。SEMA7A 是通過與β1-integrin和Plexin C1受體結合而發(fā)揮作用的，與β1-integrin受體結合更多是在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，而與Plexin C1受體結合則參與了細胞粘附、樹突化及細胞運動骨架調(diào)節(jié)等方面。本研究中發(fā)現(xiàn)了SEMA7A和Plexin C1在A549細胞中表達較高，而β1-integrin表達沒有明顯的差別，因此我們后續(xù)探究了SEMA7A和Plexin C1相互作用對A549細胞轉移機制的影響。

CCR-7、MMP-2及MMP-9是較為公認的在腫瘤細胞脫離原發(fā)位置，轉移到其他部位過程中發(fā)揮重要作用的蛋白，諸多研究表明了上述蛋白參與了多種腫瘤的轉移及侵襲過程[18-20]，而在非小細胞肺癌中也是如此[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)給予重組SEMA7A刺激后，A549細胞出現(xiàn)了明顯的轉移增殖跡象(劃痕實驗及transwell實驗改變明顯)，而沉默表達SEMA7A后則抑制了該現(xiàn)象的發(fā)生，說明了SEMA7A體系起到了促進腫瘤細胞轉移的作用。此外，重組SEMA7A還增加了CCR-7、MMP-2以及MMP-9的表達，而SEMA7A沉默后上述蛋白表達下調(diào)，進一步證明了SEMA7A參與到了A549細胞轉移的過程中。為了探究SEMA7A受體在該過程中的影響，本研究在給予重組SEMA7A刺激的基礎上，同時沉默表達了Plexin C1受體，處理后出現(xiàn)了腫瘤細胞轉移抑制的現(xiàn)象，同時CCR-7、MMP-2以及MMP-9的表達也出現(xiàn)了下降，該部分結果說明了Plexin C1受體參與了上述的過程。

4 結論

綜上所述，SEMA7A在A549細胞的轉移中發(fā)揮了促進作用，且通過與Plexin C1受體相互起到相關功效，這也為非小細胞肺癌轉移機制的探索及治療提供了更多的依據(jù)。