拜合提亞·阿扎提 李前進 劉強 王玉杰

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆 烏魯木齊 830054)

近年來，腎細胞癌已占全球癌癥相關死亡2%以上[1-2]，它分為幾種主要和罕見的亞型。腎透明細胞癌亞型是腎細胞癌中最常見、侵襲性最強的亞型[3-5]。雖然大多數(shù)原位腎細胞癌患者可以通過手術進行治療，但術后全約有四分之一的患者會復發(fā)和轉移[6-7]，因此需要探索額外的治療方案。有研究顯示，阿霉素可引起腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡，誘導抗原特異性抗腫瘤免疫應答，可與免疫檢查點抑制劑或免疫佐劑聯(lián)合使用，增強全身抗腫瘤免疫，減少轉移[8-10]。在所有免疫檢查點抑制劑中，CTLA-4抗體最早被批準用于治療包括腎細胞癌在內的多種癌癥[11]。然而，CTLA-4抗體在臨床應用過程中存在響應率低和毒副作用較大等缺陷[12]。因此，利用小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)直接敲除免疫檢查點CTLA-4是很好的選擇[13]。為了實現(xiàn)高效的CTLA-4 siRNA和阿霉素的共同遞送，本研究設計了對PH敏感的共包封納米載體，進而探究該阿霉素/CTLA-4 siRNA納米載體復合物是否可以激活抗腫瘤免疫并抑制腎透明細胞癌的生長。

1 材料與方法

1.1 細胞系、動物和主要試劑 RENCA細胞購自武漢普諾賽生物有限公司；Fluc-RENCA細胞由本實驗室先前構建保存。細胞培養(yǎng)在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。35只雌性Balb/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，保證小鼠充足進食飲水，所有動物實驗通過新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。4 -羧基苯甲醛、PCL-OH、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基丁二酰亞胺 (NHS)、二甲氨基吡啶 (DMAP)、二氯甲烷(DCM)、四氫呋喃(THF)購自北京百靈威科技有限公司；PEG, PEG-NH2和三乙胺(TEA) 購自北京鍵凱科技有限公司。阿霉素(doxorubicin, Dox)購自武漢德美凱生物科技有限公司；si-CTLA-4由上海吉瑪科技有限公司合成，序列為5′-TACTTTGTGGGCATGGGCTT-3′。RIPA試劑、ECL發(fā)光試劑、熒光素酶底物、DAB顯色試劑購自碧云天生物科技有限公司；兔抗CTLA-4、兔抗IFN-γ、兔抗Ki67購自Abcam公司；兔抗GAPDH和山羊抗兔二抗購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 LDs和P-LDs的合成 以4-羧基苯甲醛和PCL-OH為原料，經羥基酯化反應合成PCL-CHO。4-羧基苯甲醛(2.5 mmol)， EDC(5 mmol)， NHS(2.5 mmol)和DMAP (1.5 mmol)溶于DCM∶THF=3∶1的混合液中, 30℃反應1 h。之后加入PCL-OH(0.5 mmol)反應48 h。反應結束后,溶液使用旋轉蒸發(fā)儀蒸干，殘留物溶于DCM，過濾去除多余4-羧基苯甲醛。將剩余的澄清溶液濃縮后倒入冷甲醇中，沉淀過濾后用甲醇洗滌，真空干燥得到PCL-CHO。將PCL-CHO (0.5 mmol)、PEG或PEG-NH2(0.75 mmol)和TEA (2.5 mmol)溶于10 mL DCM中反應48 h。用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，將殘渣溶于THF中，滴入超純水中。在超純水(pH 7.4)中透析(MWCO=8 kDa)24 h，去除游離的PEG，然后離心去除未反應的PCL-CHO。凍干后，得到PCL-PEG或PCL-N-PEG。將25 mg PCL-PEG或PCL-N-PEG與2mg Dox溶于5 mL DCM，用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，得到Dox膠束，將siRNA和Dox膠束輕輕混合(膠束∶siRNA=2000∶1，摩爾比)，即得到LDs或P-LDs。

1.3 電鏡觀察P-LDs及差示掃描量熱法檢測P-LDs的粒徑 將Lipo、LDs和P-LDs分別滴加到銅網(wǎng)上，讓液滴充分鋪開，室溫靜置30 min。小心除去多余液體，加入2%的磷鎢酸復染后在室溫下干燥過夜。 使用透射電子顯微鏡(JEM-2100，Hitachi，Japan)在200kV的電壓下觀察樣品。對于粒徑檢測，將Lipo、LDs和P-LDs分別加入小鼠血漿中，在1、2、4、8、12、24 h取樣，按照儀器使用流程采用差示掃描量熱法測定它們的平均粒徑。

1.4 流式細胞術檢測脾淋巴細胞對P-LDs的攝取 分離小鼠脾臟，使用70 μm濾網(wǎng)過濾細胞勻漿，使用小鼠脾淋巴細胞分離試劑盒的說明操作，得到小鼠脾淋巴細胞。在24孔板(106個/孔)中接種的脾淋巴細胞，在pH為7.4和pH為6.8的RPMI 1640中分別加入1.32 μg/mL si-CTLA-4的LDs、P-LDs、siRNA及商品化的陽離子轉染試劑+siRNA孵育2 h，離心洗滌收集細胞，200 μL PBS重懸細胞，使用LSR II細胞儀(BD，USA)進行檢測，并用FACS DIVA軟件v8.0進行分析。

1.5 Western blot檢測P-LDs對脾淋巴細胞中CTLA-4表達的影響 在pH 7.4或pH 6.8條件下，用1.32 μg/mL si-CTLA-4的LDs、P-LDs及siRNA分別轉染脾淋巴細胞。培養(yǎng)48 h后，使用RIPA裂解液裂解細胞，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用電轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，使用兔抗小鼠CTLA-4抗體(1∶2000)及兔抗小鼠GAPDH抗體(1∶1000)在4℃孵育過夜，使用山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，使用ECL發(fā)光液在ChemiDocTM成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)進行成像。蛋白條帶經Image J軟件定量。

1.6 活體成像法檢測P-LDs的體內分布 在雌性Balb/c小鼠左側腋下接種5×105個RENCA細胞，建立Balb/c小鼠皮下腎癌模型。接瘤后7天，通過尾靜脈注射Lipo、LDs和P-LDs (2 mg/kg)。24 h后使用IVIS?Spectrum系統(tǒng)(Caliper, hopkins, USA)對小鼠器官進行成像。

1.7 皮下移植瘤模型檢測P-LDs的體內抗腫瘤活性 將表達螢火蟲熒光素酶的RENCA細胞(Fluc-RENCA)( 5×105個/只)接種到小鼠的左測腋下。待腫瘤體積達到100 mm3左右，隨機分為4組，每組5只，通過尾靜脈每隔3天注射PBS、Dox+si-CTLA-4、LDs和P-LDs (回輸量均換算為Dox:2 mg/kg, si-CTLA-4:0.32 mg/kg)。每2天記錄小鼠體重和腫瘤體積。根據(jù)以下公式計算腫瘤體積:V = L×W2/2(L，最長維度;W，最短維度)。在第23天使用IVIS?Spectrum系統(tǒng)對小鼠進行成像。

1.8 免疫組化法檢測腫瘤組織中CTLA-4、IFN-γ和Ki67的含量 分離的腫瘤組織在4%多聚甲醛中固定48 h，經過脫水、浸蠟、包埋后，切成6 μm厚的切片，切片經復水后使用pH9.0的Tris-EDTA緩沖液抗原修復20 min，使用5%山羊血清室溫封閉2 h，使用兔抗小鼠CTLA-4抗體(1∶200)、兔抗小鼠IFN-γ抗體(1∶100)和兔抗小鼠Ki67抗體(1∶100)4℃孵育過夜，使用山羊抗兔二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，使用DAB顯色液室溫避光顯色5 min，蘇木精復染2 min，封片后使用IXplore Standard(Olympus，Japan)進行觀察，使用Image Pro Plus軟件對陽性區(qū)域進行定量分析。

2 結果

2.1 P-LDs的構建及特性分析 采用化學合成法獲得包裹Dox和si-CTLA-4的PH敏感型納米載體復合物P-LDs以及包裹Dox和si-CTLA-4的非PH敏感型納米載體復合物LDs，電鏡觀察結果顯示，脂質體Lipo、LDs以及P-LDs在pH6.8和pH7.4時均具有均一的球形結構，見圖1A。粒徑分析結果顯示，Lipo、LDs以及P-LDs在血漿中可以穩(wěn)定存在，粒徑保持在60 nm左右，見圖1B。

圖1 P-LDs的特性分析

2.2 P-LDs在低PH時可以有效介導siRNA轉染脾淋巴細胞 使用流式細胞術檢測Cy5標記的siRNA轉染脾淋巴細胞的能力，結果顯示，市售陽離子轉染試劑和LDs在pH6.8和pH7.4時轉染的細胞熒光強度均較弱，P-LDs在pH7.4轉染細胞時熒光強度與其余各組無顯著差異，而在pH6.8轉染細胞時，熒光強度顯著提高(P<0.01)，圖2A、B。

圖2 P-LDs的細胞攝取

2.3 P-LDs在低PH時可以有效降低脾淋巴細胞中CTLA-4表達量 使用western blot檢測siRNA沉默CTLA-4的能力，結果顯示，LDs在pH6.8和pH7.4時轉染的細胞CTLA-4表達量較高，P-LDs在pH7.4轉染細胞時CTLA-4表達量與其余各組無顯著差異，而在pH6.8轉染細胞時，CTLA-4的表達量顯著降低(P<0.01)，見圖3A、B。

圖3 P-LDs對CTLA-4基因的沉默

2.4 P-LDs可以有效介導siRNA體內轉染腫瘤細胞 活體成像觀測P-LDs介導Cy5標記的siRNA轉染體內轉染能力，結果顯示，與Lipo組和LDs組相比，P-LDs組的熒光在腫瘤中積累最高(P<0.05)，而在其他主要臟器中的富集較低，見圖4A、B。

圖4 P-LDs的體內生物分布

2.5 P-LDs顯著抑制腎癌細胞的體內生長 活體成像結果顯示，P-LDs組相較于Dox聯(lián)合si-CTLA-4組及LDs組，腫瘤最小，見圖5A。瘤體積監(jiān)測數(shù)據(jù)也表明，P-LDs組的腫瘤生長被顯著抑制，見圖5B。

圖5 P-LDs的抗腫瘤活性

2.6 P-LDs組中CTLA-4和Ki67表達降低，IFN-γ含量顯著提升 免疫組化結果顯示，P-LDs組相較于Dox聯(lián)合si-CTLA-4組及LDs組，CTLA-4和Ki67表達降低(P<0.001)，見圖6A、圖6C。IFN-γ含量顯著提升(P<0.0001)，見圖6B。表明腫瘤微環(huán)境中免疫抑制較弱，抗腫瘤免疫活性較強，腫瘤細胞增殖被顯著抑制。

圖6 免疫組化分析(A) CTLA-4, (B) IFN-γ和(C) Ki67

3 討論

靶向免疫檢查點分子有望成為一種非常有效的抗腫瘤策略。目前，靶向CTLA-4的抗體已在黑色素瘤和腎細胞癌的治療中取得了成功[14]。CTLA-4/B7軸在宿主免疫監(jiān)視和腫瘤微環(huán)境調控中發(fā)揮關鍵作用，T細胞通常表達CTLA-4, 它和B7之間的相互會阻斷T細胞介導的癌細胞殺傷，導致腫瘤免疫逃逸，抑制該通路可能促使T細胞釋放免疫效應分子，產生抗腫瘤反應[15]。然而，腫瘤發(fā)生進展復雜，單一治療通常不能取得很好的療效。因此，許多臨床和臨床前研究集中在聯(lián)合標準化療、放療和免疫治療來治療癌癥。有研究顯示，阿霉素處理的腫瘤細胞可以被髓系和漿細胞樣樹突狀細胞高效吞噬，誘導抗原特異性CTL的激活，產生強烈的抗腫瘤免疫反應[8]。因此，本文旨在研究化療藥物阿霉素與Si-CTLA-4聯(lián)合應用在腎透明細胞癌小鼠模型中對腫瘤細胞的影響。腎癌移植瘤模型顯示，給與P-LDs后可以顯著抑制腫瘤的生長，通過免疫組化染色，本文發(fā)現(xiàn)P-LDs處理的腫瘤組織中Ki67的水平明顯降低，表明腫瘤細胞的增殖顯著被抑制，與此同時，IFN-γ含量則顯著升高。已知IFN-γ是重要的抗腫瘤免疫效應分子，其可以通過激活腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞在抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮至關重要的作用[16]。

對于非病毒基因傳遞系統(tǒng)，帶負電荷的siRNA通常通過靜電相互作用被陽離子載體包裹[17]。粒徑較小的陽離子載體有利于深入滲透至實體瘤內部[18]。然而，陽離子載體存在著血液循環(huán)半衰期短[19]、非特異性細胞毒性、非特異性細胞攝取等問題[20]。內源性刺激響應的納米載體在平衡陽離子載體的優(yōu)缺點方面具有很大的潛力[21-22]。一些研究人員對陽離子載體進行了修飾，使PEG外殼響應性分離，以延長體循環(huán)，增強腫瘤內的滲透和積累[23]。本研究采用的PEG通過亞胺連接物與PCL偶聯(lián)，亞胺鍵對酸性非常敏感，在生理條件(pH7.4)下保持穩(wěn)定，但在酸性腫瘤微環(huán)境(pH 6.8)中容易被水解，從而釋放負載的阿霉素和si-CTLA-4，增強負載藥物在腫瘤部位的富集，降低脫靶效應。體外轉染實驗顯示，在pH6.8時，包裹Cy5標記的si-CTLA-4的P-LDs轉染效率比pH7.4時增加了7.7倍。體內分布實驗也表明，P-LDs組腫瘤內Cy5標記的si-CTLA-4分別比LDs組和Lipo組高1.63和1.89倍。更強的腫瘤細胞靶向能力也帶來更好的CTLA-4基因的沉默效率。體外的western blot檢測及體內的免疫組化結果都表明，P-LDs干預后CTLA-4的表達量都顯著降低。

4 結論

本研究開發(fā)了PH敏感的納米載體復合物P-LDs，包含化療藥物阿霉素以及CTLA-4 siRNA，PEG外殼在PH 6.8時快速脫落，將阿霉素和si-CTLA-4高效傳遞給腫瘤細胞，增強其在腫瘤中的穿透和富集，從而增強局部抗腫瘤免疫反應的發(fā)生，抑制腎細胞腫瘤生長。