吳穎 高蔚 張佑揚(yáng) 翁婷 李晶晶

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院·南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)宿遷醫(yī)院呼吸科，江蘇 宿遷 223800)

肺癌在我國(guó)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，其早期檢出率較前明顯增加，治療手段除了手術(shù)切除、放化療之外，靶向治療及免疫治療在臨床中也廣泛應(yīng)用，但是中晚期肺癌患者仍然預(yù)后不良，5年存活率僅僅15.9%，絕大多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)與原發(fā)病灶的轉(zhuǎn)移[1]，因此盡早阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移對(duì)改善患者預(yù)后很重要。趨化因子是具有誘導(dǎo)趨化活性的一大類(lèi)細(xì)胞因子，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用，一定程度上參與了乳腺癌，腎癌，胃癌等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[2-4]。CCL5又稱(chēng)RANTES，是CC類(lèi)趨化因子的一種。CCL5一般由活化的T淋巴細(xì)胞合成并分泌，對(duì)于包括T細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等在內(nèi)的多種細(xì)胞具有復(fù)雜而巨大的生物學(xué)影響。除趨化效應(yīng)之外，CCL5也是一種重要HIV抑制因子，可通過(guò)與CCR5受體結(jié)合，減弱人原代巨噬細(xì)胞的單核細(xì)胞遷移，抑制HIV-1病毒體外復(fù)制[5]。CCL5還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移能力，可能是通過(guò)介導(dǎo)免疫細(xì)胞定向趨化作用實(shí)現(xiàn)的[6]，但其在肺癌中的作用尚未證實(shí)。因此，在本研究中我們首先在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出在非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中高表達(dá)的基因-CCL5，同時(shí)以原發(fā)性NSCLC患者為考察對(duì)象，利用免疫組化法及RT-PCR分別檢測(cè)NSCLC患者腫瘤組織及血標(biāo)本中CCL5的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其表達(dá)與患者臨床病理特征和總生存時(shí)間相關(guān)性，從而闡明其在NSCLC中表達(dá)及臨床意義。此外，通過(guò)敲低CCL5后探究對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移能力影響而進(jìn)一步闡明其可能潛在分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 NSCLC患者肺癌組織取材于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬宿遷醫(yī)院2014～2021年住院的72例肺癌患者，其中男54例，女18例，年齡30～75歲，中位年齡為59.5歲，術(shù)后病理明確診斷為非小細(xì)胞肺癌，手術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療等其它抗腫瘤治療，無(wú)合并疾病。健康對(duì)照組36例，男21例，女15例，年齡37～70歲，中位年齡57.1歲。均為體檢中心體檢合格的健康人。對(duì)72例患者進(jìn)行常規(guī)術(shù)后隨訪(采用電話(huà)溝通或門(mén)診隨診方式)，隨訪截止時(shí)間2021年7月，隨訪時(shí)間18～162個(gè)月，研究期間死于肺癌相關(guān)疾病者為完全數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理證實(shí)的非小細(xì)胞肺癌患者。②年齡≥18歲。③TNM分期為Ⅰ-Ⅲ期。④接受手術(shù)治療。⑤患者隨診史及基本資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類(lèi)型肺癌患者及肺轉(zhuǎn)移癌。②年齡<18歲。③原位癌、Ⅳ期肺癌、未接受手術(shù)治療患者。

1.2 主要的試劑及儀器 CCL5兔抗人單克隆抗體(上海拜力生物科技有限公司)；SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋科技公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量試劑(日本TAKARA公司)；人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H358(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；小牛血清、DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司)；Trizol(總RNA抽提試劑)、脂質(zhì)體Lipofect 3000、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitativereal-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；Transwell培養(yǎng)小室(美國(guó)賽默飛公司)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CCL5在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平 離體組織石蠟切片4 μm，脫蠟，水化，熱修復(fù)；阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次；滴加鼠抗人CCL5單克隆抗體過(guò)夜，PBS沖洗；滴加聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液，孵育30 min(37℃)；顯色、復(fù)染、脫水、樹(shù)膠封固鏡檢。應(yīng)用PBS作為陰性對(duì)照。在顯微鏡下仔細(xì)觀察CCL5在組織中的表達(dá)。

1.4 CCL5免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)價(jià) 免疫組化結(jié)果根據(jù)CCL5染色強(qiáng)度及細(xì)胞陽(yáng)性比例兩方面進(jìn)行結(jié)果的評(píng)定。免疫組化定量分?jǐn)?shù)=染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)×陽(yáng)性細(xì)胞比例分?jǐn)?shù)。

1.5 血液中CCL5的含量 取血清上清液，依照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)OD值計(jì)算RNA濃度，將純度良好的RNA按照試劑盒使用說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，行RT-PCR擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參基因，進(jìn)行相關(guān)引物序列的設(shè)計(jì)，分析各基因Ct值，計(jì)算CCL5的相對(duì)倍比關(guān)系，該實(shí)驗(yàn)需要計(jì)算3次平均值。

1.6 RT-PCR檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、 H358及正常人支氣管上皮細(xì)胞16HBE中CCL5的表達(dá) 人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549均在37℃，含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。用RT-PCR檢測(cè)A549、 H358細(xì)胞系和人正常支氣管上皮細(xì)胞中CCL5mRNA的表達(dá)。

1.7 RNA干擾和體外增殖能力檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞，取生長(zhǎng)良好的A549細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染。貼壁后按照Lipofectamine 3000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，將siRNA-NC、siRNA-CCL5轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中，分別作為對(duì)照組(siRNA-NC組)、實(shí)驗(yàn)組(siRNA-CCL5組)。轉(zhuǎn)染后將兩組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)待后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR法檢測(cè)兩組CCL5mRNA水平，評(píng)估轉(zhuǎn)染效果。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兩組A549細(xì)胞，消化、離心、懸浮，取出所需細(xì)胞的總量接種在96孔板中。分別將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24、48、72 h細(xì)胞每孔加入CCK-8(10 μL)+DMEM(90 μL)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞在450 nm處的光密度(opticaldensity，OD)值，并繪制72 h生長(zhǎng)曲線。

1.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力 遷移試驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期兩組細(xì)胞，胰酶消化，重懸，然后以4×104細(xì)胞數(shù)置于上室培養(yǎng)，下室加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后擦去未遷移細(xì)胞，用甲醇固定遷移細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染液染色。隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)目。侵襲試驗(yàn)：提前用固定濃度的Matrigel凝膠包被Transwell小室上室底部膜，其它步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用雙側(cè)檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)確定組間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； CCL5與臨床、病理因素關(guān)系的評(píng)估采用雙側(cè)t檢驗(yàn)；NSCLC患者PFS與CCL5關(guān)系的分析采用Kaplan-Meier法，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)測(cè)NSCLC中CCL5表達(dá)差異 本研究應(yīng)用癌癥基因組圖譜(The Cancer GenomeAtlas, TCGA)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)分析在肺癌中轉(zhuǎn)錄過(guò)程中CCL5表達(dá)情況。共納入肺癌患者969例(483例肺腺癌樣本和486例肺鱗癌樣本)，女性427例，男性542例；年齡22～86歲，年齡中位數(shù)59歲。T分期:T1期251例，T2期428例，T3期260例，T4期30例；N分期：N0期211例，N1期368例，N2期305例，N3期85例；M分期，M0期832例，M1期137例。分析結(jié)果顯示CCL5基因TPM(Transcripts Per Million，每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的Transcripts)表達(dá)水平在肺癌的腺癌和鱗癌均有增加，見(jiàn)圖1。

圖1 CCL5mRNA表達(dá)在肺腺癌和鱗癌中增加

2.2 CCL5的免疫組化表達(dá)情況 結(jié)果顯示CCL5蛋白在肺癌組織中廣泛表達(dá)，其中中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性的NSCLC患者48例(66.7%)，弱陽(yáng)性和陰性表達(dá)的患者24例(33.3%)，而癌旁正常組織中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性的NSCLC患者12例(16.7%)，弱陽(yáng)性和陰性表達(dá)的患者60例(83.3%)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 NSCLC癌組織和癌旁組織中CCL5的顯示結(jié)果

2.3 CCL5mRNA在血清中的表達(dá) NSCLC患者血清中CCL5mRNA的表達(dá)量為(2.07±0.35)，高于健康對(duì)照組的(1.02±0.81)(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 CCL5在血漿中的mRNA表達(dá)水平

2.4 NSCLC組織中CCL5的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)CCL5表達(dá)情況，將NSCLC患者分為高表達(dá)組48例(66.7%)和低表達(dá)組24例(33.3%)，分析CCL5表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CCL5高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.019)，同時(shí)CCL5表達(dá)可能與腫瘤臨床階段相關(guān)(P=0.033)。CCL5表達(dá)水平高低與患者性別、年齡、組織分化、病理分型都無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 NSCLC患者組織中CCL5的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[n,n(×10-2)]

2.5 血清CCL5mRNA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 采用Kaplan Meier生存曲線分析血清CCL5mRNA與NSCLC患者預(yù)后的相關(guān)性。72例NSCLC患者，從高到低排列CCL5mRNA表達(dá)水平，依據(jù)中位數(shù)的數(shù)值(1.63以上為高表達(dá))將患者分為高表達(dá)組(CCL5 High，n=47)低表達(dá)組(CCL5 Low，n=25)。結(jié)果表明，CCL5mRNA表達(dá)與NSCLC患者的PFS相關(guān)(P<0.01)，CCL5低表達(dá)者的PFS優(yōu)于高表達(dá)者(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

圖4 血清CCL5mRNA的表達(dá)與患者預(yù)后的相關(guān)性分析

2.6 組織中CCL5高表達(dá)提示NSCLC患者預(yù)后不良 采用Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估組織中CCL5表達(dá)與臨床病理特征對(duì)NSCLC總生存的預(yù)測(cè)作用。結(jié)果顯示，CCL5表達(dá)可作為NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素之一，見(jiàn)表2。

表2 單因素、多因素Cox回歸模型分析影響NSCLC患者生存的臨床病理因素

2.7 干擾CCL5抑制A549細(xì)胞的體外增殖、侵襲、遷移 為進(jìn)一步探究CCL5在NSCLC中的生物學(xué)功能，我們首先在肺癌細(xì)胞及氣管上皮細(xì)胞HBE中檢測(cè)CCL5的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL5在肺癌A549、H358中細(xì)胞較正常上皮細(xì)胞中高表達(dá)，見(jiàn)圖5A。同時(shí)選取高表達(dá)CCL5的肺癌細(xì)胞株A549行干擾質(zhì)粒siRNA-CCL5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，同時(shí)行質(zhì)粒的干擾效果驗(yàn)證，與對(duì)照組相比，siRNA-CCL5轉(zhuǎn)染組內(nèi)CCL5mRNA表達(dá)水平明顯降低[(0.73±0.08)vs(0.21±0.06)]。CCK8實(shí)驗(yàn)提示轉(zhuǎn)染siRNA-CCL5的A549細(xì)胞在24、48、72 h時(shí)OD值小于siRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖5B； Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA-CCL5組 遷移平均細(xì)胞數(shù)為(252±13)個(gè)，高于siRNA-NC組(105±10)個(gè)，P<0.01，見(jiàn)圖5C、D。侵襲實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組侵襲平均細(xì)胞數(shù)為(198±15)個(gè)，高于實(shí)驗(yàn)組(98±11)個(gè)(P<0.01)，見(jiàn)圖5E、F。上述結(jié)果提示CCL5敲低后A549細(xì)胞增殖 、遷移、侵襲能力均受到抑制。

圖5 CCL5在肺癌A549細(xì)胞中的生物學(xué)功能

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，識(shí)別有效的分子生物標(biāo)志物對(duì)于肺癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療具有非常重要意義。趨化因子與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展有一定相關(guān)性，它可以與靶細(xì)胞表面受體結(jié)合從而激活下游信號(hào)肽，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖。在腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定、腫瘤血管生成、腫瘤耐藥等方面發(fā)揮重要作用[7]。因此正確評(píng)估腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子譜，可提高我們對(duì)腫瘤免疫應(yīng)答狀態(tài)的認(rèn)識(shí)，并極有可能發(fā)現(xiàn)癌癥早期篩查的生物標(biāo)志物。在巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和特定類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞表面均有CCL5表達(dá)，它可部分調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程，主要通過(guò)與體內(nèi)多種基因相互作用[8-9]。Aldinucci等[10]指出在血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病中CCL5-CCR5通路發(fā)揮重要作用，與腫瘤的進(jìn)展有關(guān) ；Marjorie等[11]研究證實(shí)CCR5/CCL5軸相互作用影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲；Naike等[12]指出CCL5參與了淋巴瘤的進(jìn)展過(guò)程。但CCL5蛋白表達(dá)在肺癌的研究目前相關(guān)研究報(bào)道極少。

本研究用免疫組化方法檢測(cè)72例NSCLC患者與60例癌旁組織中CCL5蛋白表達(dá)情況，提示CCL5蛋白在肺癌組織中有高水平表達(dá)，而在正常組織中僅為弱陽(yáng)性，甚至陰性表達(dá)。CCL5高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤分型、大小無(wú)關(guān)，CCL5的陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有顯著相關(guān)性，說(shuō)明CCL5與NSCLC的生長(zhǎng)及侵襲密切相關(guān)，可能在NSCLC的轉(zhuǎn)移與病情進(jìn)展中發(fā)揮著一定的作用。有研究發(fā)現(xiàn)CCL5 mRNA在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，與肝癌的進(jìn)展有關(guān)，且同期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌CCL5促進(jìn)腫瘤相關(guān)細(xì)胞的增殖或募集[13];Mio等[14]研究顯示乳腺癌患者原發(fā)病灶、血液、轉(zhuǎn)移灶、受侵犯的淋巴結(jié)中均高表達(dá)CCL5/CCR5，并且 CCL5高表達(dá)與腫瘤侵襲性、患者預(yù)后有明顯關(guān)聯(lián)，這提示CCL5在肝癌和乳腺癌的進(jìn)展中起著關(guān)鍵性的作用。結(jié)合本研究結(jié)果，CCL5在NSCLC中也發(fā)揮一定作用。

本研究結(jié)果提示NSCLC患者血清中CCL5mRNA的表達(dá)量均高于健康對(duì)照組，提示其可能在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起一定的促進(jìn)作用。本文還進(jìn)行了CCL5表達(dá)高低與患者預(yù)后的K-M生存分析，結(jié)果顯示高表達(dá)CCL5mRNA患者的生存期更短，預(yù)后更差。Cox多因素比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估提示CCL5表達(dá)可作為NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因素之一。有研究表明，乳腺癌患者腫瘤組織和血清中CCL5的含量是乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子，并且血清中CCL5的含量可以作為乳腺癌疾病進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)[15-18]，CCL5或許能成為治療乳腺癌的靶點(diǎn)，并且前列腺癌患者中，高表達(dá)CCL5的前列腺癌患者腫瘤的侵襲性明顯增強(qiáng)，CCL5的表達(dá)水平可能為判斷患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)[19-21]，與本文研究結(jié)果一致。

為探討CCL5對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，本研究敲低CCL5后檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-CCL5后A549細(xì)胞增殖能力明顯降低，侵襲和遷移能力也降低，因此推測(cè)下調(diào)CCL5可抑制A549細(xì)胞增殖，侵襲，延緩轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌作用，這與Gaili等[22]研究結(jié)果相似，該研究顯示在特定類(lèi)型的乳腺癌中，乳腺癌細(xì)胞能夠自分泌CCL5促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，下調(diào)CCR5和CCL5表達(dá)水平，可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)也證明巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌CCL5能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，增加侵襲能力[23-25]。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究證實(shí)CCL5在NSCLC中高表達(dá)，并與患者T分期、N分期、M分期呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，CCL5可能同樣在NSCLC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，有望成為一種潛在的新型肺癌腫瘤標(biāo)志物用于臨床診斷，并指導(dǎo)臨床對(duì)NSCLC的預(yù)后判斷，提高治療的有效率。其臨床意義值得進(jìn)一步深入研究。