韓歡勝，趙列平，柴孟龍，徐　馨，高　利（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱5000；.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院哈爾濱特產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱5008；.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾6006）

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梅花鹿發(fā)情期陰道細(xì)胞形態(tài)變化與最適輸精期

韓歡勝1，2，趙列平2，柴孟龍2，徐馨3，高利1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院哈爾濱特產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150038；3.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，黑龍江齊齊哈爾161006）

摘要：為了對梅花鹿進(jìn)行準(zhǔn)確的發(fā)情鑒定和適時(shí)輸精，本試驗(yàn)對梅花鹿發(fā)情期陰道細(xì)胞進(jìn)行涂片檢查和發(fā)情時(shí)期劃分，并按劃分時(shí)期進(jìn)行了輸精試驗(yàn)。通過研究形成了梅花鹿發(fā)情前期、發(fā)情盛期、發(fā)情末期與間情期陰道細(xì)胞檢查圖譜，總結(jié)出了各時(shí)期陰道細(xì)胞變化規(guī)律。發(fā)情期各階段輸精結(jié)果，發(fā)情盛期的Ⅰ期到Ⅲ期受胎率分別是83.3%、86.5%、79.1%，受胎率明顯高于發(fā)情期輸精總的受胎率71.5%，確定梅花鹿普通凍精輸精最適時(shí)期是發(fā)情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期）。研究表明，梅花鹿陰道細(xì)胞發(fā)情鑒定是提高梅花鹿人工授精受胎率的一種新的有效方法。

關(guān)鍵詞：梅花鹿；發(fā)情期；陰道細(xì)胞；形態(tài)變化；最適輸精

準(zhǔn)確的發(fā)情鑒定對提高動(dòng)物繁殖生產(chǎn)意義重大。目前，哺乳動(dòng)物發(fā)情鑒定方法有行為觀察法、公獸試情法、陰道細(xì)胞學(xué)檢查法、陰道電阻測定法、生殖激素含量測定法、唾液結(jié)晶檢查法等多種方法[1-5]。梅花鹿屬季節(jié)性周期多次發(fā)情動(dòng)物，發(fā)情鑒定目前主要采用公鹿試情行為觀察的方法，由于其生性膽小，發(fā)情行為隱蔽，采用該法一般很難確定發(fā)情所處階段，給適時(shí)配種或輸精增加了難度。為進(jìn)一步提高情期受胎率，本研究對梅花鹿發(fā)情不同階段陰道細(xì)胞進(jìn)行了形態(tài)學(xué)檢查和時(shí)期劃分，并按劃分時(shí)期進(jìn)行了輸精試驗(yàn)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于發(fā)情期陰道細(xì)胞檢查和人工輸精的鹿，北京市懷柔區(qū)喇嘛溝門西府營鄉(xiāng)梅花鹿場提供56頭，富裕縣梅花鹿場提供83頭。

1.2試驗(yàn)器械、藥品載玻片、醫(yī)用棉簽、75%酒精、生理鹽水、光學(xué)顯微鏡（帶顯微攝像頭）、鹿眠寶、鹿醒寧（青島漢河集團(tuán)）、消毒毛巾、日式輸精槍、梅花鹿常規(guī)凍精。

2　試驗(yàn)方法

2.1梅花鹿陰道細(xì)胞檢查及時(shí)期劃分用公鹿試情方法進(jìn)行母鹿發(fā)情鑒定，將發(fā)情的母鹿每隔2 h進(jìn)行1次麻醉，用消毒毛巾擦凈外陰，用生理鹽水將消毒后的棉簽蘸濕，順著陰道上側(cè)壁，邊捻轉(zhuǎn)邊插入，到10 cm左右深度時(shí)，貼著陰道上側(cè)壁捻轉(zhuǎn)3～4次，順著上側(cè)壁慢慢拉出。然后在潔凈的載玻片上從一邊開始，轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽將陰道黏液均勻的涂抹在載玻片中央，自然風(fēng)干后在16×40倍顯微鏡下檢查發(fā)情期陰道細(xì)胞形態(tài)，并結(jié)合發(fā)情行為和細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)劃分發(fā)情時(shí)期。

2.2梅花鹿輸精適期確定用陰道細(xì)胞檢查方法對發(fā)情期各階段進(jìn)行凍精人工輸精試驗(yàn)，每次輸0.25 mL細(xì)管凍精1支，解凍后有效精子數(shù)≥1 000萬個(gè)，活力≥0.3。然后根據(jù)各時(shí)段輸精母鹿的受胎率情況來確定最適輸精時(shí)間。

3　結(jié)果與分析

3.1梅花鹿發(fā)情期各階段陰道細(xì)胞變化按副基細(xì)胞、有核角化細(xì)胞、無核角化細(xì)胞出現(xiàn)和轉(zhuǎn)化情況將發(fā)情期分為發(fā)情前期、發(fā)情盛期和發(fā)情末期，并對各期進(jìn)行了Ⅰ期到Ⅲ期的具體細(xì)化，總結(jié)了發(fā)情期各期細(xì)胞變化特點(diǎn)。為區(qū)別對照發(fā)情期與間情期細(xì)胞變化，對間情期陰道細(xì)胞形態(tài)變化也進(jìn)行了檢查。

3.1.1發(fā)情前期陰道細(xì)胞變化發(fā)情前期Ⅰ期，母鹿處于發(fā)情前期的早期，剛接受公鹿爬跨，溜圈，陰道細(xì)胞特征是副基細(xì)胞散在稀疏，主要是小中間細(xì)胞（圖1左圖箭頭表示）。發(fā)情前期Ⅱ期，母鹿處于發(fā)情前期的中期，接受公鹿爬跨，外逃，陰道細(xì)胞特征是副基細(xì)胞增多，小中間細(xì)胞多于大中間細(xì)胞（圖1中圖箭頭所示），血小板增多，均勻分布。發(fā)情前期Ⅲ期：母鹿處于發(fā)情前期的晚期，接受公鹿爬跨，外逃，陰道細(xì)胞特征是副基細(xì)胞增多，其中大中間細(xì)胞（圖1右圖箭頭所示）多于小中間細(xì)胞，血小板密集。在160～640倍顯微鏡下，血小板可檢查到，但圖像經(jīng)過轉(zhuǎn)換后血小板在圖片上呈現(xiàn)不清晰，與細(xì)胞分層觀察有關(guān)，以下各期圖片效果相同。

3.1.2發(fā)情盛期陰道細(xì)胞變化發(fā)情盛期Ⅰ期：母鹿處于發(fā)情盛期的早期，接受公鹿爬跨，陰道細(xì)胞特征是有核角化細(xì)胞（圖2左圖箭頭所示）開始出現(xiàn)增多，副基細(xì)胞多于有核角化細(xì)胞，并以大中間細(xì)胞為主，血小板密集。發(fā)情盛期Ⅱ期，母鹿處于發(fā)情盛期的中期，接受公鹿?fàn)顟B(tài)為一爬一走，陰道細(xì)胞特征是有核角化細(xì)胞（圖2中圖長箭頭所示）多于副基細(xì)胞，副基細(xì)胞以大中間細(xì)胞（圖2中圖短箭頭所示）為主，血小板開始減少。發(fā)情盛期Ⅲ期：母鹿處于發(fā)情盛期的晚期，拒絕公鹿爬跨，陰道上皮細(xì)胞特征是出現(xiàn)大量紅細(xì)胞（2右圖箭頭所示），大量有核角化細(xì)胞，少量副基細(xì)胞（大中間細(xì)胞為主），血小板散在稀疏。

3.1.3發(fā)情末期陰道細(xì)胞變化發(fā)情末期Ⅰ期：母鹿處于發(fā)情末期的早期，拒絕公鹿爬跨，陰道細(xì)胞特征是中量紅細(xì)胞，中量無核角化細(xì)胞（圖3左圖長箭頭所示），極少量副基細(xì)胞（以大中間細(xì)胞為主），血小板特別稀疏。發(fā)情末期Ⅱ期：母鹿處于發(fā)情末期的中期，拒絕公鹿爬跨，陰道細(xì)胞特征是中量無核角化細(xì)胞（圖3中圖長箭頭所示），副基細(xì)胞（小、大中間細(xì)胞）又開始增多，少量紅細(xì)胞（圖3中圖短箭頭所示），細(xì)胞開始聚集。發(fā)情末期Ⅲ期：母鹿處于發(fā)情末期的晚期，拒絕公鹿爬跨，陰道細(xì)胞特征是副基細(xì)胞（小、大中間細(xì)胞）中量，少量無核角化細(xì)胞，出現(xiàn)少量細(xì)胞碎片，細(xì)胞聚集呈云霧狀。

圖1　發(fā)情前期陰道細(xì)胞變化（×640）

3.1.4間情期陰道細(xì)胞變化間情期，母鹿拒絕公鹿爬跨，性興奮轉(zhuǎn)為安靜，陰道細(xì)胞特征是零星的副基細(xì)胞，且主要是大中間細(xì)胞（圖4左圖），或只見細(xì)胞碎片（圖4右圖），或零星的副基細(xì)胞與細(xì)胞碎片同時(shí)出現(xiàn)（圖4中圖）。

3.2最適輸精時(shí)間梅花鹿普通凍精輸精發(fā)情期各階段受胎情況見表1，輸精受胎集中時(shí)間是發(fā)情前期Ⅲ期到發(fā)情末期的Ⅱ期，受胎率依次是31.3%、83.3%、86.5%、79.1%、53.3%、20.0%，其中輸精受胎率最高階段是發(fā)情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期，受胎率分別是83.3%、86.5%、79.1%，比總受胎71.5%分別高15.0%、7.6%，說明發(fā)情盛期的Ⅰ期至Ⅲ期是梅花鹿普通凍精輸精最適時(shí)間。

圖3　發(fā)情末期陰道細(xì)胞變化（×640）

4　討論

圖4　間情期陰道細(xì)胞變化（×640）

表1　發(fā)情期各階段人工輸精效果

4.1梅花鹿排卵過程與陰道細(xì)胞變化關(guān)系試驗(yàn)認(rèn)為梅花鹿陰道細(xì)胞的來源，主要由陰道上皮細(xì)胞和排卵過程中產(chǎn)生的細(xì)胞組成。細(xì)胞形態(tài)的變化主要由生殖激素雌激素和孕激素作用引起。梅花鹿發(fā)情期陰道內(nèi)細(xì)胞變化本研究認(rèn)為由兩條途徑調(diào)節(jié)，一條途徑是，排卵過程引起的細(xì)胞變化。鹿進(jìn)入發(fā)情季節(jié)，卵泡雌激素分泌增多，在雌激素的反饋?zhàn)饔孟?，垂體前葉LH分泌增加，F(xiàn)SH分泌減少，使排卵前出現(xiàn)LH峰，進(jìn)而激發(fā)卵泡產(chǎn)生一系列的理化變化，最終引發(fā)卵泡膜變薄、充血、破裂與排卵，通過分泌物引起陰道內(nèi)細(xì)胞的變化，在陰道細(xì)胞檢查中出現(xiàn)的紅細(xì)胞、血小板就是由卵泡充血滲出血液（主要是血小板）和破裂時(shí)流出的液體引起的。另一條途徑是，通過血液中雌激素和孕激素周期的改變引起陰道上皮細(xì)胞變化。

4.2低倍鏡下不規(guī)則圖像出現(xiàn)原因陰道分泌物涂片在低倍顯微鏡（16×10倍）肉眼觀察到不規(guī)則形狀出現(xiàn)原因。涂片在低倍顯微鏡視野內(nèi)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)散點(diǎn)狀、雪松狀、雪花狀、云霧狀等圖像。本試驗(yàn)認(rèn)為與“血小板衛(wèi)星現(xiàn)象”有關(guān)[6]。“血小板衛(wèi)星現(xiàn)象”是在涂片中血小板粘附于白細(xì)胞周圍，在顯微鏡下呈現(xiàn)簇狀聚集的現(xiàn)象。在鹿陰道細(xì)胞檢查中當(dāng)臨近排卵前后，卵巢組織受損，白細(xì)胞增多，發(fā)情前期和發(fā)情盛期出現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞；另外卵泡血液滲出或排卵出血時(shí)，會(huì)出現(xiàn)大量的血小板，這樣血小板和白細(xì)胞的按不同比例混合，經(jīng)過“血小板衛(wèi)星現(xiàn)象”，形成了各種觀察圖像。

4.3輸精劑量與受胎率的關(guān)系梅花鹿是陰道射精型動(dòng)物，精子到達(dá)輸卵管壺腹部受精，需穿過子宮頸、宮管連接部、輸卵管壺腹部和狹部連接部等柵欄，本交射精上億個(gè)但到達(dá)壺腹部的精子只有幾百個(gè)。人工輸精時(shí)精子數(shù)不能低于某一限度，才可保證壺腹部有足夠的用以受精的精子。綿羊正常一次射精約有30億個(gè)精子，但通過子宮頸者卻少于100萬個(gè)[1]；在牛的繁殖上每次輸精劑量是≥800萬有效精子[7]；目前，鹿冷凍精液還沒有國標(biāo)，趙列平等輸精試驗(yàn)表明[8]，梅花鹿性控凍精（解凍后有效精子數(shù)100～120萬）與普通凍精（有效精子數(shù)≥1 000萬）輸精情期受胎率60.76 %、61.63 %，兩者間無顯著差異（P>0.05），說明梅花鹿人工輸精有效精子數(shù)120萬就可保證受胎。本試驗(yàn)使用的凍精有效精子數(shù)≥1 000萬，輸精部位躍過子宮頸，這樣保證了有足夠的精子到達(dá)輸卵管壺腹部，并受精。

4.4最適輸精時(shí)間最適輸精時(shí)間由排卵時(shí)間、精子受精能力、精子獲能時(shí)間等多個(gè)因素共同決定，使用凍精輸精，準(zhǔn)確的發(fā)情鑒定是確定最適輸精時(shí)間的關(guān)鍵[9-13]。目前，梅花鹿人工輸精主要采取公鹿試情結(jié)合行為觀察或采用同期發(fā)情定時(shí)輸精的方法，往往因個(gè)體差異，采用上法很難確定最佳時(shí)間，本研究通過陰道細(xì)胞檢查方法，增強(qiáng)了發(fā)情鑒定判定的準(zhǔn)確性，結(jié)合公鹿試情可明顯提高梅花鹿受胎率。

5　結(jié)論

本試驗(yàn)形成了梅花鹿發(fā)情期陰道細(xì)胞檢查圖譜，總結(jié)出了陰道細(xì)胞檢查發(fā)情鑒定規(guī)律。應(yīng)用陰道細(xì)胞發(fā)情鑒定技術(shù)確定了梅花鹿普通凍精輸精最適時(shí)期是發(fā)情盛期（Ⅰ期-Ⅲ期），陰道細(xì)胞發(fā)情鑒定技術(shù)作為一種新的方法可應(yīng)用于梅花鹿繁殖生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]董偉.家畜繁殖學(xué)[M] .北京：農(nóng)業(yè)出版社，1980：126-127，173-176．

[2]梁書文，張衛(wèi)憲.寵物繁殖[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008：89-96．

[3]鐘福生，朱開明.果子貍的發(fā)情觀察及其鑒定方法[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，27（2)：57-58．

[4]黎宗強(qiáng)，謝莉萍，陳敏，等.食蟹猴陰道涂片的動(dòng)態(tài)觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13（1）：33-37．

[5]趙興緒.犬和貓的繁殖調(diào)控[M] .北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010：54-67．

[6]張弢，王亞強(qiáng).血小板衛(wèi)星現(xiàn)象淺析[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，25（4）：36-38．

[7] GB 4143-2008，牛冷凍精液[S]．

[8]趙列平，韓歡勝，趙廣華，等.分離Y精子在茸鹿性別控制中的應(yīng)用研究[J].2009，13（4）：187-189．

[9]韓歡勝，趙列平，樊娜，等.寒區(qū)馬鹿發(fā)情鑒定與最佳輸精時(shí)間的確定[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2008，16（6）：11-12．

[10]苗德成，周振海，劉河新.馬鹿最佳輸精時(shí)間探索[J].當(dāng)代畜牧，2002，9：19．

[11]賀星亮，張匯東，馬大君，等.發(fā)情母犬陰道上皮細(xì)胞變化與最佳配種時(shí)間[J].畜牧與獸醫(yī)，2004，36（10）：37-38．

[12]崔成都，劉德成，金日明.雌性黑熊發(fā)情期間陰道上皮細(xì)胞的變化與發(fā)情行為的關(guān)系[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（12）：99-101．

[13]鐘福生.小靈貓發(fā)情及其鑒定方法探討[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，6（1）：18-20．

Vaginal Cell Morphological Changes in Estrus and the Best Inseminating Timeon Sika Deer

HAN Huan-sheng1，2，ZHAO Lie-ping2，CHAI Meng-long2，XU Xin3，GAO Li1
（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Harbin Specialty Research Institute，Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences，Harbin 150038，China；3.Heilongjiang Institute of Veterinary Science，Qiqihar 161006，China）

Abstract：To identify estrus accurately and start artificing insemination timely on the sika deer，we performed a complete study on the observation of sika deer vaginal cell smear using microscop . Our results summarized the vaginal cell examination plates and transformation law in proestrus，vigorous estrus，and late estus and diestrus.We showed that artificing insemination time of the sika deer was in vigorous estrus stage from ItoIII，and the conception rates of artificial insemination were 83.3%，86.5%，and 79.1% from I stage toIII，respectively，which are obviously higher conception rate in each vigorous estrus stage than the general conception rate（71.5%）in estres period.These data indicate that it is a new effective method to improve the conception rate of arti?ficial insemination by identifying the vaginal cells on estrus sika deer.

Key words：Sika Deer；Estrus；Vaginal Cell；Morphological Changes；The Best Inseminating Time

中圖分類號：S825

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0529-6005（2016）05-0028-04

收稿日期：2015-05-26

基金項(xiàng)目：黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（GC13B-（GC13B407）；黑龍江省農(nóng)墾總局攻關(guān)項(xiàng)目（HNKIV-08-12A，HNK125B-12-05）；哈爾濱市科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2015RQQYJ033）

作者簡介：韓歡勝（1978-），男，副研究員，碩士，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)工作，E-mail：hanhuansheng@aliyun.com

通訊作者：高利，E-mail：gaoli43450@163.com

Corresponding author：GAO Li