王靈靈，王令令，張雨晴，馬 寧，何 欣

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

灰黃霉素 (griseofulvin，Gri) 是從灰黃青霉 (penicillium griseofulvin) 培養(yǎng)液中得到的一種含氯代謝產(chǎn)物，是一種非多烯類的抗真菌抗生素[1]，為白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭，味微苦，在臨床上是治療皮膚真菌病最常用的抗菌藥物之一[2]?；尹S霉素在水中極微溶解，僅為13.06 mg/L，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng) (biopharmaceutics classification system,BCS) 中屬于低溶解性高滲透性的Ⅱ類藥物[3]。由于極低的水溶性，導(dǎo)致需要更大劑量才能達(dá)到治療水平，因此需要改善其水溶性提高抗真菌活性[4]。

固體分散體是指由一種或多種活性成分高度分散在適宜的載體中而形成的一種固體分散體系[5]，因顆粒尺寸的減小、團(tuán)聚的減少和潤濕性的改善可顯著提高藥物的溶解度和生物利用度[6]。常用的固體分散體制備方法有熔融法、溶劑法和溶劑-熔融法。本研究是利用一種不同于傳統(tǒng)制備方法的反溶劑共沉淀法制備灰黃霉素固體分散體，以期彌補(bǔ)灰黃霉素水溶性差、生物利用度低的缺陷，增加臨床用藥選擇性，為提高灰黃霉素溶解性的開發(fā)研究提供新思路。

圖1 Gri (a) 和HPMCAS (b) 的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試驗材料與動物灰黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品98%(上海源葉生物科技有限公司)；灰黃霉素原料藥97%(美國葛蘭素史克公司)；HPMCAS(HF、MF、LF 3種規(guī)格)購于日本信越株式會社；N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；健康成年雄性比格犬6只，體質(zhì)量為12～16 kg(購于北京瑪斯生物技術(shù)有限公司)，試驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，將比格犬隨機(jī)分為2組，每組3只，試驗前禁食12 h，可自由飲水。

1.2 灰黃霉素反溶劑的選擇配制不同pH的水溶液，各取6 mL后加入50 mg灰黃霉素，100 r/min，37℃ 震蕩24 h，過濾取上清，用紫外分光光度計在296 nm處測定吸光度代入標(biāo)曲，選出灰黃霉素溶解度最低的水溶液。

1.3 灰黃霉素固體分散體的制備分別取1 g HPMCAS-HF、HPMCAS-MF、HPMCAS-LF加入到10 mL的N,N-二甲基甲酰胺中充分?jǐn)嚢?。將適量灰黃霉素按照5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9加入到不同規(guī)格的聚合物溶液中，充分混合后勻速注入反溶劑中，抽濾得沉淀，凍干后研磨過篩備用。

1.4 灰黃霉素固體分散體的表征

1.4.1粉末X射線衍射 (PXRD) 分別將Gri、3種不同規(guī)格聚合物及共沉淀產(chǎn)物過篩后平鋪于樣品槽內(nèi)進(jìn)行測試。測試條件為：電壓40 kV，電流15 mA，測試步長為0.01°，掃描速度為20°/min，掃描范圍為3～40°，測試溫度為室溫。

1.4.2差示量熱掃描 (DSC) 分別將3～5 mg待測樣品研磨過篩干燥去水后放置于標(biāo)準(zhǔn)鋁盤密封，鋁盤蓋扎孔，測試時空鋁盤為對比參照，另一個鋁盤裝待測樣品。測試條件為：采用N2氣氛，升溫速率為10℃/min，溫度范圍為25～250℃，N2流速為50 mL/min。

1.4.3紅外光譜分析 (FT-IR) 樣品制備：采用常規(guī)壓片的方法，先將溴化鉀研磨過篩成2 μm以下的粉末，干燥備用。按照樣品和溴化鉀1∶100的比例，取2 mg的待測樣品和溴化鉀粉末于研缽中，研磨混合均勻，壓片后測定。測試條件為：波數(shù)范圍4 000.0～400.0 cm-1，分辨率為0.1 cm-1。

1.4.4掃描電子顯微鏡 (SEM) 將待測樣品粉末黏到導(dǎo)電膠上，控制激發(fā)電壓為20 kV，在真空條件下將待測樣品表面噴金后測試觀察樣品的外觀及形態(tài)。

1.5 灰黃霉素固體分散體的體外溶解度測定

1.5.1粉末溶出 分別取Gri原料藥200 mg、3種規(guī)格載體的固體分散體及對應(yīng)的物理混合物(均含原料藥200 mg)于燒杯中，分別加入500 mL的pH 6.8緩沖鹽，溫度為 (37.0±0.5)℃，轉(zhuǎn)速為250 r/min。分別在0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0,45.0,60.0,90.0,120.0,150.0,180.0和240.0 min取出500 μL并補(bǔ)充等溫等量的溶出介質(zhì)，立即用0.22 μm濾膜過濾，在296 nm波長處測定吸光度，平行3次。

1.5.2溶出殘渣分析 將粉末溶出試驗后的混懸液過濾，沉淀物干燥后研磨過篩(80目)，進(jìn)行粉末X射線衍射分析，確定溶出后樣品性質(zhì)是否發(fā)生變化。

1.6 穩(wěn)定性研究分別稱取30 mg 3種不同載體的灰黃霉素固體分散體于平皿中，置于溫度為40℃，濕度為75%的藥品穩(wěn)定性試驗箱中，并分別在0,15,30,60,90,120 d取出適量樣品進(jìn)行粉末X射線衍射分析。

1.7 藥物代謝動力學(xué)

1.7.1給藥與采樣 分別將灰黃霉素與其固體分散體混懸于0.5%的羧甲基纖維素鈉中，以40 mg/kg的劑量灌胃給予比格犬。分別于0.083,0.250,0.330,0.500,1.000,2.000,4.000,6.000,8.000,10.000和12.000 h于比格犬前肢靜脈處采血1 mL，置于含肝素鈉的離心管中，12 000 r/min離心10 min，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2樣品處理 取100 μL血漿樣品加100 μL乙腈，渦旋振蕩2 min，12 000 r/min離心10 min，取上清用0.22 μm濾膜過濾后用HPLC進(jìn)行Gri的含量測定。

1.7.3高效液相色譜條件 色譜柱：SunFire?C18 (4.6 mm×250 mm)；流動相:乙腈∶水=0.55∶0.45；流速：1 mL/min；柱溫：37℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：291 nm。

1.7.4統(tǒng)計學(xué)分析 藥物代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)采用DAS 3.5軟件進(jìn)行藥時曲線下面積 (AUC0～∞)、最大血藥濃度(Cmax)、達(dá)峰時間 (Tmax)、半衰期 (T1/2)、滯留時間 (MRT0～∞) 等藥物代謝動力學(xué)參數(shù)計算分析。采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，以P<0.01(差異極顯著)或P<0.05(差異顯著)為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 灰黃霉素反溶劑的選擇灰黃霉素在不同的pH水溶液中的溶解度如表1所示，在pH=3中溶解度最低，因此選擇pH=3作為灰黃霉素固體分散體制備時的反溶劑。

表1 灰黃霉素在不同pH水溶液中的溶解度 mg/L

2.2 灰黃霉素固體分散體的PXRD結(jié)果待測樣品的PXRD結(jié)果如圖2所示。由Gri的X射線衍射圖可知在 (10.6±0.2),(13.1±0.2),(14.5±0.2),(16.5±0.2),(23.7±0.2),(26.6±0.2),(28.4±0.2) °處均出現(xiàn)窄而尖的衍射峰，證明Gri是一種高結(jié)晶性的藥物[7]；而HPMCAS-HF、HPMCAS-MF、HPMCAS-LF均無明顯的特征衍射峰；物理混合物的衍射峰與Gri的位置相同，但峰的強(qiáng)度比Gri弱，表明有結(jié)晶性藥物的存在；在Gri-HF ASD比例為2∶8,3∶7,4∶6,5∶5時可以明顯觀察到與Gri有著相同位置的晶型衍射峰，證明沒有完全形成無定形固體分散體；而1∶9比例的Gri-HF ASD未觀察到任何晶型衍射峰，證明該比例完全形成無定形固體分散體；而Gri-MF ASD和Gri-LF ASD與Gri-HF ASD一樣，表明僅1∶9比例的Gri完全形成無定形分散于載體之中，形成了固體分散體。

圖2 Gri、PM、Gri-HF ASD(Gri∶HF=1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5)、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9)、HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF的PXRD圖

2.3 灰黃霉素固體分散體的DSC結(jié)果各樣品的DSC如圖3所示。Gri在220℃有1個明顯的吸熱峰為Gri的熔點(diǎn)[8]；HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF在溫度升高過程中均未出現(xiàn)任何吸熱峰；物理混合物在220℃處可見Gri的熔點(diǎn)峰，證明載體與原料藥為物理混合物；Gri-HF ASD、Gri-MF ASD和Gri-LF ASD在220℃附近均未出現(xiàn)吸熱峰，表明Gri以無定形的狀態(tài)分散于載體之中，與上述PXRD結(jié)果吻合。

圖3 Gri、PM、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9)、HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF的DSC圖

2.4 灰黃霉素固體分散體的FT-IR結(jié)果各樣品的FT-IR結(jié)果如圖4所示。Gri在2 944 cm-1處的譜帶為-OCH3官能團(tuán)的伸縮振動峰；HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF在2 937和1 745 cm-1分別為-OCH3和-C=O官能團(tuán)的伸縮振動峰[9]；在物理混合物中既出現(xiàn)了載體中的2 937 cm-1(-OCH3)官能團(tuán)譜帶，也有Gri中的1 745 cm-1(-C=O)官能團(tuán)譜帶，表明Gri與載體沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，只是簡單的物理混合；在Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9)的圖譜中，Gri的甲氧基峰由原來的2 944 cm-1藍(lán)移到3 132 cm-1。推測Gri在形成固體分散體的過程中，改變了分子中的鍵的伸縮振動情況，表明藥物與載體之間發(fā)生了氫鍵的結(jié)合。

圖4 Gri、PM、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9)、HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF的FT-IR圖

2.5 灰黃霉素固體分散體的SEM結(jié)果各樣品的SEM結(jié)果如圖5所示。Gri是具有短而鈍且不規(guī)則的棒狀晶體結(jié)構(gòu)；HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF的形狀具有相似性，都是不規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu)；Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9) 中沒有明顯的棒狀晶體結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)了少許球狀顆粒及微小聚集體分布在蜂窩狀的空腔內(nèi)，且呈疏松多孔狀的結(jié)構(gòu)，表明Gri以無定形的狀態(tài)分散于載體的孔穴中。

圖5 Gri、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9)、HPMCAS-HF、HPMCAS-MF和HPMCAS-LF的SEM圖

2.6 灰黃霉素固體分散體最佳比例的體外溶出結(jié)果

2.6.1粉末溶出結(jié)果 Gri、PM、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9) 在37℃、pH 6.8磷酸鹽緩沖液條件下的溶出結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出Gri達(dá)到平衡時的溶解度是6 mg/L[10]。3種PM均在30 min達(dá)到平衡狀態(tài)，平衡時的溶解度分別為12 mg/L (Gri-HF)、7 mg/L (Gri-MF和Gri-LF)，分別是Gri原料藥的2.0和1.2倍。Gri-HF ASD的溶出曲線呈先升后降的趨勢，在30 min前呈上升趨勢，30 min后開始下降，最高點(diǎn)時的溶解度為113 mg/L，是Gri原料藥的18倍，最終下降到49 mg/L，是Gri原料藥的8倍。Gri-MF ASD與Gri-LF ASD的溶出曲線類似，均在2 min后開始下降，但Gri-LF ASD下降的趨勢較Gri-MF ASD迅速，最高點(diǎn)時的溶解度分別為205 和132 mg/L，分別是Gri的34和22倍，下降到最低點(diǎn)時的溶解度分別為23 和28 mg/L，是Gri的4倍左右。從溶出曲線可以看出該方法制備出的灰黃霉素?zé)o定型固體分散體明顯改善了灰黃霉素的溶解度。

圖6 Gri、PM、Gri-HF ASD、Gri-MF ASD、Gri-LF ASD的體外溶出曲線圖

2.6.2溶出殘渣X射線衍射結(jié)果 Gri、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9) 在37℃、pH 6.8緩沖鹽條件下溶出后殘渣的PXRD結(jié)果如圖7所示。Gri-HF(1∶9)的溶出殘渣在(28.4±0.2)°出現(xiàn)了灰黃霉素的晶體衍射峰，Gri-MF(1∶9)和Gri-LF(1∶9)的溶出殘渣在的溶出殘渣在(23.7±0.2)°出現(xiàn)了灰黃霉素的晶體衍射峰，表明灰黃霉素固體分散體在水溶性介質(zhì)中有一部分從無定形狀態(tài)轉(zhuǎn)為了晶體狀態(tài)。

圖7 Gri、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9)、Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9) 溶出殘渣的PXRD圖

2.7 穩(wěn)定性試驗結(jié)果在加速穩(wěn)定性的試驗條件下(溫度為40℃，濕度為75%)，灰黃霉素固體分散體在不同時間點(diǎn)的X射線衍射圖和差示量熱掃描結(jié)果如圖8所示。在不同時間點(diǎn)的X射線衍射圖中均無任何晶型的衍射峰，證明用反溶劑共沉淀法制備出的固體分散體在高溫高濕的環(huán)境下穩(wěn)定性良好。

圖8 Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9) (a)、Gri-MF ASD (Gri∶MF=1∶9) (b)和Gri-LF ASD (Gri∶LF=1∶9) (c)穩(wěn)定性的PXRD圖

2.8 藥物代謝動力學(xué)結(jié)果根據(jù)體外溶出試驗結(jié)果，選擇Gri、Gri-HF ASD (Gri∶HF=1∶9) 在比格犬進(jìn)行口服藥物代謝動力學(xué)研究。藥物代謝動力學(xué)結(jié)果如圖9和表2所示。Gri-HF ASD的達(dá)峰時間Tmax從0.67 h縮短到到0.39 h，表明Gri-HF ASD在比格犬體內(nèi)吸收迅速；2組的最大血藥質(zhì)量濃度Cmax分別為0.23 和1.43 mg/L，固體分散體組比原料藥組提高了6.2倍；2組的AUC分別為0.84 和1.90 mg/(L·h-1)，固體分散體組比原料藥組提高了2.3倍。

圖9 口服Gri和Gri-HF ASD在比格犬體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線

表2 比格犬口服Gri和Gri-HF ASD主要藥 動學(xué)參數(shù)對比 (n=3)

3 討論

固體分散體 (SDs) 在改善藥物溶解度相比其它策略受到了更多的關(guān)注，與傳統(tǒng)策略相比，因其顆粒尺寸的減小、團(tuán)聚的減少和潤濕性的改善提高了藥物的生物利用度[11]。而因為聚合物能抑制藥物的結(jié)晶，一方面有助于藥物的長期儲存穩(wěn)定性；另一方面，有助于維持一個理想的過飽和水平，因為它阻止了溶劑介導(dǎo)的藥物重結(jié)晶[12]。常用的固體分散體制備方法包括熔融法、溶劑法、熔融-溶劑法等。熔融法具有時間短、無溶劑、成本低及抗毒性等優(yōu)點(diǎn)，但制備過程中高溫的使用，藥物的分子遷移率加快，有些藥物會在熔融過程發(fā)生化學(xué)降解或者升華。溶劑法的優(yōu)點(diǎn)為避免高熱，適用于對熱不穩(wěn)定或揮發(fā)性藥物。但使用有機(jī)溶劑的用量較大，成本高，且有時有機(jī)溶劑難以完全除盡[13]。溶劑-熔融法優(yōu)點(diǎn)是藥物受熱時間短、穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量好，缺點(diǎn)是僅限于小劑量藥物[14]。

新型共沉淀技術(shù)運(yùn)用溶劑-反溶劑原理和經(jīng)典成核理論，該方法是基于含溶質(zhì)的有機(jī)溶液與可混溶的反溶劑的混合，在快速混合的條件下產(chǎn)生高的過飽和狀態(tài)促使快速成核從而瞬時產(chǎn)生沉淀[15]，使藥物以無定形狀態(tài)均勻分布于載體之中，該方法操作簡單成本低對環(huán)境污染小。CHOW等[16]采用共沉淀法制備了姜黃素?zé)o定形固體分散體，并比較了混合速度以及溶劑擴(kuò)散系數(shù)對其粒徑的影響，證明了該方法制備出的固體分散體粒徑小且穩(wěn)定性良好。本研究是采用新型共沉淀的方法制備了灰黃霉素固體分散體，其飽和溶解度提高了8倍，Cmax提高了6.2倍。

HPMCAS為腸溶性載體，在pH 6.0條件下溶解，具有兩親性結(jié)構(gòu)，既有親水基團(tuán)又有疏水基團(tuán)[17-18]。HPMCAS因官能團(tuán)的含量不同分為3種不同型號。HPMCAS-HF含有較多的疏水性取代基乙?；?，當(dāng)作為聚合物時與藥物的相互作用為較強(qiáng)的疏水作用，從而產(chǎn)生較低的藥物過飽和度，因此藥物溶出度較低，但能夠較好的維持過飽和度。而HPMCAS-MF和HPMCAS-LF含有較多的親水取代基琥珀?；虼伺c水有較強(qiáng)的相互作用，藥物溶出度較高，但維持過飽和的能力較弱因為與水的作用力較弱從而減緩藥物結(jié)晶[19]。因此LF和MF的重結(jié)晶速度快，溶解度下降迅速，本研究中利用LF和MF為載體的固體分散體均在2 min后溶解度急劇下降，分別從205 和132 mg/L下降至23和28 mg/L；而HF的重結(jié)晶速度緩慢，溶解度下降緩慢，本研究中HF在30 min后開始緩慢下降，最終從113 降至49 mg/L。由于HF在胃腸道能夠保持更長時間過飽和從而減緩灰黃霉素在胃腸道吸收過程中的重結(jié)晶速度[20-22]，因此以HF在聚合物的固體分散體的生物利用度比灰黃霉素提高了2.3倍。

灰黃霉素是一種高結(jié)晶傾向的藥物[23]，當(dāng)載體材料HPMCAS在pH6.8的緩沖鹽介質(zhì)中部分溶解后，無定形灰黃霉素從載體中釋放暴露于水溶性介質(zhì)中后發(fā)生快速和廣泛的結(jié)晶[24-25]，這是由于藥物與聚合物的相容性和相互作用[26-27]，ASD中的無定形藥物在溶解介質(zhì)中與水接觸時可能發(fā)生相分離和重結(jié)晶[28-30]。因此在溶出后的殘渣PXRD圖中可以看出晶型物質(zhì)的出現(xiàn)。而由于LF和MF含有較多的親水取代基琥珀酰基，具有較高的聚合物潤濕性，導(dǎo)致非晶態(tài)灰黃霉素的初始釋放速度比HF快，因此在溶出開始時LF和MF的最高濃度比HF高，同時由于溶解速度快與水溶性介質(zhì)接觸時間早導(dǎo)致快速結(jié)晶[31-32]。因此可以從溶出殘渣PXRD圖中觀察到LF和MF較HF的重結(jié)晶性高。