劉 博,霍 芳,徐晴晴,2,劉海隆,張 瑩,蔡青云,谷英華,張 艷*,王文秀,2*

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東省院士工作站，山東 濱州 256600； 3.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600； 4.海南省家畜家禽工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571100；5.濱州市人民醫(yī)院，山東 濱州 256600)

炎癥反應(yīng)是一種機(jī)體對(duì)感染和組織損傷的急性反應(yīng)。炎癥反應(yīng)可以抑制感染和組織損傷對(duì)機(jī)體造成的傷害。然而當(dāng)發(fā)生調(diào)節(jié)異常和慢性炎癥時(shí)，炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致繼發(fā)性損傷和宿主免疫病。炎癥小體是細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的一種復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)重要的組成部分[1-3]。它由胞漿內(nèi)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)參與并招募其他蛋白組裝而成的。在炎癥小體的組裝過程中，首先作為傳感器的炎癥小體蛋白寡聚化并招募包含 CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 (ASC)形成復(fù)合物，該復(fù)合物與半胱氨酸蛋白酶 Caspase-1的酶原分子連接組裝形成炎癥小體復(fù)合物。組裝后，炎癥小體介導(dǎo) Caspase-1的激活，進(jìn)而介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子 IL-1和 IL-18的加工和釋放，同時(shí)還可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡。

迄今為止發(fā)現(xiàn)的炎癥小體中，NLRP3炎癥小體可以被多種病原體如細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲感染所激活，也能夠被各種不同結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAM-Ps)、宿主內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào) (danger associated molecular patterns,DAMPs) DAMPs 和環(huán)境因素所刺激，因此被廣泛研究。已知的流感病毒 (influenza A virus,IAV)、腺病毒 (adenovirus)、仙臺(tái)病毒 (sendai virus,Sev)以及豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等都可以激活 NLRP3炎癥小體[4-10]，肺炎鏈球菌可誘導(dǎo) NLRP3依賴性 IL-1β的產(chǎn)生，其與促炎細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)相關(guān)[11-12]。另外，NLRP3炎癥小體與各種疾病的發(fā)病和進(jìn)展相關(guān)，包括代謝紊亂、多發(fā)性硬化、炎性腸病等相關(guān)的周期性發(fā)熱，以及其他免疫和自發(fā)性炎癥性疾病。

畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中，豬的各種炎癥性疾病頻發(fā)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。快速、準(zhǔn)確診斷豬體炎癥可以為正確治療和防控病毒和細(xì)菌等引起的炎性疾病提供時(shí)間參考。本研究以 NLRP3重組蛋白為抗原制備了3株特異性單克隆抗體，并對(duì)其特性和結(jié)合的抗原位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，為研究和開發(fā)可準(zhǔn)確檢測(cè) NLRP3炎癥小體的試劑盒提供了重要條件。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物E.coliDH5α與 BL21 (DE3)、小鼠骨髓瘤細(xì)胞系 SP2/0均由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存； 6～8周齡的健康雌性 BALB/c小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑截短的 NLRP3重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存； HRP(horseradish peroxidase) Goat Anti Mouse IgG、FITC(fluoresceine isothiocyanate) Goat Anti Mouse IgG、DAB(diaminobenzidine)顯色試劑盒購自濟(jì)南和拓生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰荆?ECL(Enhanced Chemiluminescence)超敏發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 小鼠免疫將鎳柱純化的 NLRP3重組蛋白與等體積佐劑混合乳化后，背部皮下多點(diǎn)注射 6周齡 BALB/c小鼠 5只，0.1 mg/只。首次免疫使用弗氏完全佐劑，后續(xù)2次免疫使用弗氏不完全佐劑。三免后第 7 天進(jìn)行斷尾采血，用間接 ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。融合前 3 d腹腔注射純化重組蛋白 0.2 mg進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.4 間接 ELISA方法的建立采用方陣滴定法確定抗原(重組 NLRP3蛋白)最佳包被濃度和陽性血清的最佳稀釋度，HRP標(biāo)記山羊抗鼠 IgG作為酶標(biāo)二抗，免疫小鼠的血清為一抗，按照常規(guī) ELISA程序進(jìn)行包備、封閉和洗滌等步驟，以此確定抗原最佳包被濃度和血清最適稀釋度。

1.5 細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞的篩選常規(guī)方法制備免疫鼠脾臟細(xì)胞并與 SP2/0胞進(jìn)行融合，分散于 96孔培養(yǎng)板經(jīng) HAT、HT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得融合細(xì)胞株。用優(yōu)化后間接 ELISA方法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，放大培養(yǎng)并保種，同時(shí)收獲培養(yǎng)上清測(cè)定效價(jià)。

1.6 腹水制備及亞類鑒定腹水制備前 7 d，取 8周齡的陰性雌性小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只 500 μL，致敏小鼠。 然后選取高效價(jià)的雜交瘤細(xì)胞株腹腔注射已致敏小鼠，10 d后采集腹水，并將其保存于 -70℃冰箱中。按照 Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit說明書的步驟，檢測(cè)所制備的單克隆抗體的類別和亞類。

1.7 單克隆抗體的Western blot鑒定將表達(dá)純化的 NLRP3蛋白作為抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 (NC膜)上，用 5%脫脂奶粉于 37℃封閉 2 h，PBST洗滌 3次后，加入 1∶2 000稀釋的單克隆抗體作為一抗于 4℃孵育 12 h，PBST洗滌 3次后，加入 1∶3 000 稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG，37℃孵育 1 h，PBST洗滌 3次后，ECL顯色劑顯色觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 單克隆抗體的間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)腹水經(jīng) NH4SO2沉淀后，按 Protein G Focurose 4FF說明書進(jìn)行純化。 1×107PK細(xì)胞經(jīng) 0.25%胰酶消化，接種到 96孔板，37℃培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿 70%～80%時(shí)，接種 1×1010CCU/L豬肺炎支原體 (mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)，2%的 DMEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)以刺激豬炎癥小體 NLRP3蛋白的表達(dá)，同時(shí)設(shè)未感染的細(xì)胞做對(duì)照。細(xì)胞接種豬肺炎支原體 48 h后，棄掉細(xì)胞上清液，用冰凍的無水乙醇固定 20 min，PBS洗滌 3次；用 0.1% TritonX-100于室溫通透細(xì)胞膜 10 min，PBS洗滌 3次；使用含 10%胎牛血清的 PBS于室溫封閉 1 h，加入單克隆抗體于 4℃孵育 12 h，PBS洗滌 3次后，加入 1∶1 000稀釋的 FITC標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，37℃孵育 1 h，PBS洗滌 3次，加入少量 PBS置于熒光顯微鏡下觀察。

1.9 抗原表位篩選與鑒定為篩選出單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位，將表達(dá)的 NLRP3蛋白分為 5段，引物序列見表 1。以 p32a-NLRP3-864質(zhì)粒為模板分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，并與表達(dá)載體 pGEX-6P-1進(jìn)行連接，構(gòu)建分段表達(dá)載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入 BL21中表達(dá)及純化，方法參照文獻(xiàn)[19]。將分段表達(dá)的蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE凝膠電泳，得到的條帶轉(zhuǎn)到 NC膜上，用純化的單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG作為二抗，對(duì)單抗進(jìn)行 Western blot鑒定，ECL顯色來初步確定每個(gè)單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位區(qū)域。

表1 豬NLRP3基因分段擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的篩選及效價(jià)測(cè)定成功篩選出 3株穩(wěn)定分泌抗 NLRP3蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，命名為 9H5、13E1和 15E2。間接 ELISA方法測(cè)定 3株單克隆抗體的效價(jià)均為 1∶12 800。

2.2 抗體亞類鑒定經(jīng)鑒定 3株單克隆抗體的重鏈亞類均為 IgG 2b；輕鏈 15E2為 κ 鏈，其余均為 λ 鏈。

2.3 Western blot如圖 1所示，3株單抗 9H5、13E1和 15E2均能與 NLRP3重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，而與 pET-32a誘導(dǎo)表達(dá)蛋白未發(fā)生反應(yīng)，表明制備的3株單抗與 NLRP3重組蛋白具有良好的反應(yīng)活性。

M.蛋白Marker；1.NLRP3重組蛋白；2. pET-32a空載體蛋白

2.4 單克隆抗體的 IFA檢測(cè)將已純化的質(zhì)量濃度為 1 mg/L單克隆抗體 1∶50稀釋作為一抗分別進(jìn)行 IFA檢測(cè)。IFA 結(jié)果顯示，與未感染組相比，3株單克隆抗體 9H5、13E1、15E2均能在 Mhp感染的 PK細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到熒光，且熒光強(qiáng)度強(qiáng)，表明 3株 MAb都與 PK細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體發(fā)生了特異性反應(yīng)(圖 2)。

A.9H5;B.13E1;C.15E2;D.陰性對(duì)照

2.5 單克隆抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的鑒定將一系列分段表達(dá)的 NLRP3重組蛋白作為抗原，進(jìn)行 Western blot 鑒定，結(jié)果顯示單克隆抗體 9H5和 15E2僅可識(shí)別 NLRP3分段表達(dá)的重組蛋白 NLRP3-1而不能識(shí)別其他分段表達(dá)的重組蛋白，表明 9H5和 13E1的抗原結(jié)合位點(diǎn)在 1～50 aa之間；單克隆抗體 13E1僅可識(shí)別 NLRP3分段表達(dá)的重組蛋白NLRP3-3而不能識(shí)別其他分段表達(dá)的重組蛋白，表明 13E1的抗原結(jié)合位點(diǎn)在 118～183 aa之間(圖3)。

1.分段表達(dá)蛋白 1(NLRP3-1); 2.分段表達(dá)蛋白 2(NLRP3-2); 3.分段表達(dá)蛋白3 (NLRP3-3); 4.分段表達(dá)蛋白 4(NLRP3-4); 5.分段表達(dá)蛋白 5(NLRP3-5)

3 討論

NLRP3屬于 NOD樣受體 (nod-like receptors,NLRs)家族成員，目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體還有 NLR家族成員 NLRP1和 NLRC4以及 HIN 域的家族成員 AIM2和 Pyrin 4種[4,6]。 NLRP3炎癥小體的激活是一個(gè)兩步過程，在 PRRs感應(yīng)到 PAMPs和 DAMPs后啟動(dòng)：首先這些 PRRs識(shí)別病原體會(huì)激活各種下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括導(dǎo)致 pro-IL-1 和 NLRP3 轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的 NF-κB通路；在 NLRP3直接或間接感知其活化劑的存在后，即發(fā)生第二步炎癥小體的組裝[13-15]。

近些年豬 NLRP3炎癥小體蛋白及其激活的炎癥反應(yīng)也在各種病原感染中被研究。 2014年劉園園等[16]研究證明 PRRSV 感染 PAM能夠激活 NLRP3炎癥小體，并初步判斷 DDX19A參與了炎癥小體的激活，該研究對(duì)促進(jìn) PRRSV的基礎(chǔ)研究和臨床研究都具有重要意義。 2015年胡亮等[17]從分子水平揭示了 HP-PRRSV感染 PAMs誘導(dǎo) NLRP3炎癥小體激活的機(jī)理，證明宿主蛋白 DDX19A可以識(shí)別 PRRSV基因組 RNA，招募 NLRP3，激活 NLRP3 炎癥小體，誘導(dǎo) IL-1β分泌。 2019年林嵐等[11]以小鼠為模型證實(shí)了豬鏈球菌 2型分泌的溶血素能激活 NLRP3炎性小體，誘導(dǎo)炎性“風(fēng)暴”，促進(jìn)了鏈球菌中毒樣休克綜合征(streptococcal toxic-shock-like syndrome,STSLS) 的發(fā)生。 2018年范雙旗等[18]發(fā)現(xiàn) NLRP3炎癥小體在對(duì) CSFV感染的先天免疫反應(yīng)中起重要作用，該研究將經(jīng)典豬瘟病毒感染豬外周血單核細(xì)胞，通過檢測(cè) NLRP3、Caspase-1和 IL-1β的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) CSFV感染抑制了 NLRP3的表達(dá)，同時(shí)敲除 NLRP3基因可增強(qiáng)了 CSFV的復(fù)制。

本實(shí)驗(yàn)室為進(jìn)一步研究豬 NLRP3炎癥小體在不同病原體感染后被激活的炎癥反應(yīng)機(jī)制，首先制備了用于 NLRP3炎癥小體檢測(cè)的抗體工具。通過 NCBI檢索及相關(guān)抗原表位在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站選取了表位豐富的結(jié)構(gòu)域構(gòu)建原核達(dá)載體，表達(dá)純化后的重組蛋白制備了 NLRP3的兔源多抗[19]。與多克隆抗體相比，單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、定向性結(jié)合、交叉反應(yīng)少等特點(diǎn)[20]。為提高檢測(cè)效率降低反應(yīng)背景值，本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的重組蛋白做為抗原制備了3株單克隆抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，Western blot結(jié)果顯示所制備的3株 MAb均可與 NLRP3蛋白特異性結(jié)合。近些年Mhp等病原體引起的炎癥反應(yīng)對(duì)豬的養(yǎng)殖產(chǎn)生了重大影響，造成了具大的經(jīng)濟(jì)損失。 IFA研究表明 3株 MAb均可與 PK細(xì)胞質(zhì)中的 NLRP3炎癥小體發(fā)生特異性結(jié)合，同時(shí)初步證明了豬肺炎支原體感染可激活 PK細(xì)胞中的 NLRP3炎癥小體的表達(dá)。 NLRP3分段表達(dá)蛋白 Western blot檢測(cè)中發(fā)現(xiàn) 9H5和 13E1可識(shí)別 NLRP3上不同的抗原表位，為建立 NLRP3炎癥小體雙抗體夾心 ELISA檢測(cè)方法提供了重要技術(shù)支持。