陳明杰，李益濤，曹夢園，王晨豫，閆雪琪，陳 杰,齊亞銀

(石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

糞腸球菌(E.faecalis)為革蘭陽性細(xì)菌，通常居住在健康人和動物的腸道中，但如果破壞了脆弱的微生物群平衡，則有可能引起侵襲性感染[1-2]。近些年關(guān)于糞腸球菌致病的報道越來越多，甚至可以通過包括侵入性醫(yī)療設(shè)備在內(nèi)的多種交叉污染途徑輕松傳播[3-4]。而糞腸球菌又是醫(yī)院環(huán)境中最常見的分離菌之一，通常與醫(yī)院心內(nèi)膜炎、尿路感染、菌血癥和牙周炎等相關(guān)[5-6]。目前已有研究表明致病性糞腸球菌不僅給衛(wèi)生系統(tǒng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且還使脆弱的患者容易遭受致命的感染[3,7-8]。

2005年齊亞銀等[9]在患腦炎的羔羊中分離到糞腸球菌，隨后周霞等[10]通過致病性試驗證實該糞腸球菌是導(dǎo)致羔羊發(fā)生腦膜炎的致病菌，目前已經(jīng)有很多研究表明糞腸球菌可以導(dǎo)致血腦屏障的緊密連接受到破壞[11]。由于目前對于糞腸球菌導(dǎo)致血腦屏障損傷的機(jī)制尚不明確，本試驗選用實驗室保存的糞腸球菌感染小鼠構(gòu)建體內(nèi)血腦屏障損傷模型。通過人工感染糞腸球菌后，利用深度高通量測序技術(shù)研究小鼠在感染糞腸球菌后，腦組織microRNA的表達(dá)情況，分析差異表達(dá)microRNA的種類及其調(diào)控的靶基因[12]，并進(jìn)行相關(guān)功能分析，以期為研究細(xì)菌性腦膜炎感染機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑凝膠成像儀(美國UVP公司)；37℃恒溫?fù)u床(購迅儀器公司)；CM1950 冷凍切片機(jī)(上海徠卡)；Roche LightCycler?96 (瑞士Roche)；伊文思藍(lán)(麥克林公司)；2×PCR MIX、DNA Marker(天根公司)；1×PBS(索萊寶公司)；小鼠降鈣素原(PCT)ELISA檢測試劑盒和小鼠C-反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA檢測試劑盒(語純公司)；OTC組織包埋劑(上海櫻花);PrimeScript@RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)試劑盒 (日本TaKaRa)；LightCycler 480 SYBR GreenⅠ Master (北京華美生物)。

1.2 實驗動物與試驗菌株8周齡清潔級昆明小鼠45只，體質(zhì)量22～25 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。致羔羊腦膜炎糞腸球菌 (命名為XJ1)由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1菌株復(fù)蘇與模型的建立 將實驗室保存的糞腸球菌XJ1進(jìn)行復(fù)蘇，PCR驗證后采用XJ1的2/3 LD50[13]細(xì)菌數(shù)對小鼠進(jìn)行腹腔注射。

1.3.2伊文思藍(lán)(EB)法觀測血腦屏障通透性 采用EB法進(jìn)行檢測[14]，選擇對照組及攻毒后12，24，60 h組，提前2 h利用尾靜脈注射方法注射2%的EB。各時點將小鼠用0.9%生理鹽水迅速經(jīng)心臟灌注，脫頸處死，剪斷鼠頭，取出腦組織，制作腦組織冰凍切片后激光共聚焦顯微鏡觀察 EB 在腦組織中的分布情況，每個時間點選用3個視野，將圖片用 Image J 圖像分析，并將光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，得出紅色熒光密度。

1.3.3腦組織中細(xì)菌的鑒定 試驗組小鼠在無菌條件下取腦組織，一部分組織做觸片用于瑞氏染色；另一部分接種于BHI培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min振蕩12～14 h后進(jìn)行鏡檢，并提取其DNA用于16S RNA的鑒定。16S rRNA引物F：TGGCATAAGAGTGAAAGGCGC；R：GGGGACGTTCAGTTACTAACGT，退火溫度56℃。

1.3.4血中PCT和CRP的測定 采取攻菌后12，24，48，60，72 h時各3只小鼠的全血，放置于37℃的培養(yǎng)箱中1～2 h待其自然析出血清后收集其血清，再分別按照小鼠降鈣素原(PCT)ELISA檢測試劑盒和小鼠C-反應(yīng)蛋白(CRP)ELISA檢測試劑盒對血中PCT和CRP進(jìn)行測定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5miRNA文庫的構(gòu)建 (1)分別選取對照組與攻菌后60 h小鼠腦組織樣品提取總RNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，再使用Nano Drop 2000測定其濃度及純度是否合格。

(2)樣品檢測合格后，首先構(gòu)建含有3′及5′磷酸基團(tuán)的Small RNA樣品，通過PCR將含有特殊結(jié)構(gòu)的Small RNA樣品反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，隨后以cDNA為起始模板，利用Small RNA Sample Pre Kit對其擴(kuò)增得到DNA片段，AGE電泳凝膠分離，進(jìn)行膠回收得到CDNA文庫。測序由北京諾禾致源公司利用 Illumina Hi SeqTM2500/Mi Seq 測序平臺完成。

(3)經(jīng)過測序得到原始數(shù)據(jù)測Raw reads，為了保證信息分析的質(zhì)量，對Raw reads進(jìn)行處理，得到Clean reads。對各樣品的Clean reads進(jìn)行篩選，選取一定長度范圍內(nèi)的sRNA用于后續(xù)分析。

將sRNA比對到mRNA的外顯子和內(nèi)含子，找出來自mRNA降解片段的sRNA，miRNA前體的標(biāo)志性發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能夠用來預(yù)測新的miRNA。通過整合miREvo[15]和mirdeep2[16]這些miRNA預(yù)測軟件來進(jìn)行新miRNA的分析。

(4)以padj<0.05 & | log2(foldchange)|>1為條件篩選差異miRNA,通過miRanda和RNAhybrid預(yù)測差異miRNA的靶基因得到差異表達(dá)miRNA后，根據(jù)miRNA與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，對每組差異表達(dá)miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行Gene Ontology和KEGG富集分析。

(5)確保測序分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用實時熒光定量PCR對測序獲得的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行進(jìn)一步驗證。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨機(jī)選取8個miRNAs，以U6作為內(nèi)參基因，每個樣品重復(fù)3次,miRNA定量上游引物為已知成熟miRNA序列(表1)，下游引物為反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的通用引物，進(jìn)行實時熒光定量PCR。

表1 差異miRNA引物信息

2 結(jié)果

2.1 EB測定結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡下激發(fā)觀察EB進(jìn)入小鼠血腦屏障的變化，再通過Image J軟件計算視野中平均熒光強(qiáng)度，如圖1所示，攻菌12，24 h 腦組織平均熒光強(qiáng)度緩慢增加，在60 h達(dá)到最大。

圖1 小鼠腦組織EB含量變化圖

2.2 HE染色觀察結(jié)果如圖2所示，圖2A為PBS處理組，可觀察到小鼠腦組織的腦膜完整，界限清晰，細(xì)胞狀態(tài)較好，細(xì)胞的輪廓清晰，細(xì)胞和間質(zhì)無水腫現(xiàn)象。用XJ1號毒株的2/3 LD50進(jìn)行攻毒后12 h(圖2 B)少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)空白間隙，表現(xiàn)為腦組織輕微水腫。在24 h(圖2 C)出現(xiàn)血管充血、血管周圍的間隙明顯增大。在60 h時(圖2 D)腦組織的病變較明顯，可觀察到腦組織出現(xiàn)明顯損傷，出現(xiàn)微血栓。

A.PBS處理組；B.12 h處理組；C.24 h處理組；D.60 h處理組

2.3 腦組織中細(xì)菌的鑒定如圖3A所示,可在腦組織的觸片中觀察到雙球狀的細(xì)菌，該細(xì)菌的形態(tài)及大小與糞腸球菌極為相似。并且將腦組織接種于BHI培養(yǎng)基中的菌液進(jìn)行鏡檢可觀察到形態(tài)大小與腦組織觸片一致的革蘭陽性球菌(圖3 B)。經(jīng)PCR驗證后可得知其腦中的細(xì)菌確實為糞腸球菌?？蓴U(kuò)增出大小為296 bp大小的片段(圖3 C)。

A.小鼠腦組織瑞士染色結(jié)果 (×1 000);B.腦組織增菌鏡檢結(jié)果 (×1 000);C.腦組織增菌細(xì)菌PCR驗證結(jié)果(M.DL2000 DNA MarkerⅠ;1～6.分離菌株)

2.4 PCT和CRP的標(biāo)準(zhǔn)曲線和含量測定檢測0,50，100,200,400,800 ng/L的PCT含量時的D值,制定PCT的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其具有線性關(guān)系，其R2=9 961，方程為：y=460.920 0x-30.661 0。分別檢測 0,15,30,60,120,240 mg/L含量時CRP的D值制定CRP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其具有線性關(guān)系R2=9 988，方程為：y=148.540 0x-4.916 6。

根據(jù)其曲線方程計算出被檢血清中PCT含量，結(jié)果顯示在攻菌后24,36，48 h時具有極顯著性差異(P<0.01)；在6，12 h時差異不顯著，不存在統(tǒng)計學(xué)意義；在60，72 h時具有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

**.P<0.01;*.P<0.05。下同

根據(jù)其曲線方程計算出被檢血清中CRP含量，結(jié)果顯示在攻菌后24,36，48 h時具有極顯著性差異(P<0.01);在6,72 h時差異不顯著，不存在統(tǒng)計學(xué)意義; 在12,60 h具有顯著性差異(P<0.05)(圖5)。

圖5 小鼠血清中CRP含量分析圖

2.5 miRNA測序分析采用Illumina Hi SeqTM-2500/Mi Seq 測序平臺完成測序，測序結(jié)果如表2所示。由表2可知，每個文庫獲得原始測序數(shù)據(jù)(Raw reads)均超過9 000 000條，對照組共獲得3 164 097條Raw reads，60 h試驗組獲得35 378 676條Raw reads。去除受污染和低質(zhì)量序列，每個測序文庫獲得Clean reads均超過9 000 000條，Clean reads占Raw reads的百分比>96%。選取長度18～35 nt的序列(sRNA)進(jìn)行后續(xù)分析。對sRNA進(jìn)行分類統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，21～23 nt的sRNA數(shù)量占總sRNA的百分比>70%，其中22 nt長度的sRNA所占比例最高。將長度篩選后的sRNA定位到參考序列上，每個測序文庫比對到參考序列上的sRNA總數(shù)>90%。6個文庫測序結(jié)果分析得出平均GC堿基含量為49.27%，AT和GC含量基本持平。測序結(jié)果表明各文庫的Q20、Q30均在90%以上，表明本測序結(jié)果質(zhì)量高，所得數(shù)據(jù)可靠，可用于下一步分析。

表2 對照組和試驗組miRNA測序結(jié)果

2.6 Small RNA 分類注釋將所有測序所得結(jié)果進(jìn)行Small RNA與各類RNA的比對、注釋。由于在比對、注釋過程中存在一對多的情況，按照已知miRNA>rRNA>tRNA>snRNA>snoRNA>repeat>gene>新miRNA檢測的優(yōu)先級順序?qū)Ω黝怰NA進(jìn)行比對與注釋。此方法將RNA作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，在質(zhì)量較好的動物樣品中rRNA總量占比低于40%，說明樣品質(zhì)量較好(表3)。

表3 sRNA的注釋與統(tǒng)計

2.7 已知 miRNA 的分析及新 miRNA 預(yù)測通過與miRBase中指定范圍序列進(jìn)行比對，鑒定小鼠腦組織的miRNA，最終6個測序文庫共鑒定已知mi RNAs成熟體1 376個，已知miRNA前體965個。選用miREvo和mirdeep2這些miRNA預(yù)測軟件來進(jìn)行新miRNA的分析，共預(yù)測到miRNAs成熟體78個，預(yù)測到前體78個。

采用TPM對miRNA表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理后，使用 DEGseq 軟件進(jìn)行差異表達(dá) miRNAs 的篩選，一共鑒定了22對差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)表達(dá)的 miRNAs有8個，下調(diào)表達(dá)的 miRNAs有14個(表4)。

表4 試驗組和對照組中差異表達(dá)miRNAs

2.8 差異miRNA靶基因富集分析得到各組比較間的差異表達(dá)miRNA后，根據(jù)miRNA與其靶基因間的對應(yīng)關(guān)系，對每組差異表達(dá)miRNA的靶基因的集合分別進(jìn)行Gene Ontology和KEGG富集分析。GO分析結(jié)果表明一共進(jìn)行了60個顯著富集的GO條目，包括20個細(xì)胞成分、20個生物學(xué)過程和20分子功能(圖6A)，分子功能富集在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性分子功能以及細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合分子功能等。KEGG富集分析表明，差異表達(dá)miRNA的靶基因顯著富集于調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號通路、RAS信號通路、MAPK信號通路、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、FcεRI信號通路(圖6B)。

圖6 差異表達(dá)miRNAs靶基因的GO(A)和KEGG(B)富集分析

2.9 差異表達(dá)miRNA的驗證結(jié)果表明,60 h試驗組挑選的8個差異表達(dá)miRNAs中6個是上調(diào)，分別為miR-34b-5p、miR-21a-5p、miR-219b-3p、miR-881-3p、miR-135a-5p及miR-34c-5p；下調(diào)的有2個，分別為miR-323-5p和miR-183-3。驗證結(jié)果顯示miR-34b-5p、miR-21a-5p、miR-219b-3p、miR-881-3p和miR-183-3p與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，miR-34c-5p和miR-323-5p與對照組相比有顯著性差異(P<0.05),miR-135a-5p無顯著性差異，miRNAs的表達(dá)趨勢與Small RNA測序結(jié)果一致，由此證實了Small RNA測序的可靠性(圖7)。

圖7 對照組和試驗組中8個差異表達(dá)miRNAs的表達(dá)驗證

3 討論

研究表明miRNA在維持血腦屏障的完整性中發(fā)揮重要作用[17-20]。ARIE等[17]研究發(fā)現(xiàn)，將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別暴露于正?；蜓装Y條件下培養(yǎng)，炎癥刺激顯著改變了內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平，其中有98種miRNA經(jīng)腫瘤壞死因子α和γ干擾素處理后表達(dá)下調(diào)，且伴隨血腦屏障損傷，差異表達(dá)的miRNA與血腦屏障功能密切相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在多發(fā)性硬化患者尸檢分離的新鮮腦毛細(xì)血管中，血腦屏障相關(guān)miRNA表達(dá)水平顯著下降，其中miR-125a-5p表達(dá)減少，而過表達(dá)miR-125a-5p可顯著改善腦內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能。ALEJANDRO等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-155在多發(fā)性硬化患者腦組織中表達(dá)增加可降低神經(jīng)炎癥動物模型的血腦屏障通透性。

本研究通過糞腸球菌XJ1株構(gòu)建小鼠血腦屏障模型，通過檢測EB、組織切片的觀察以及致病菌的分離鑒定，證明該糞腸球菌確實可以穿越血腦屏障，導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生腦膜炎癥狀，腦組織產(chǎn)生病變，并且改變血腦屏障的通透性。

同時通過探究感染后小鼠血清中CRP和PCT的含量得出，在感染致腦膜炎糞腸球菌后，小鼠體內(nèi)的CRP和PCT會有所上升，而在醫(yī)學(xué)上CRP和PCT已經(jīng)被證明可以通過含量的變化判定腦膜炎[21]。本研究結(jié)果和賀巧峰等[22]對兒童化膿性腦膜炎和病毒性腦膜炎血清中CRP和PCT的研究結(jié)果類似，都是呈現(xiàn)出上升趨勢，證明本試驗成功構(gòu)建了感染小鼠腦部模型。

選擇感染癥狀最嚴(yán)重的60 h試驗組小鼠和對照組小鼠腦組織樣品測序，通過比對分析共鑒定了22個差異表達(dá)的miRNAs，其中上調(diào)表達(dá)的miRNAs有8個，下調(diào)表達(dá)的miRNAs有14個。本研究中鑒定mmu-miR-34b-5p和mmu-miR-21a-5p都與血腦屏障的通透性密切相關(guān)。

miR-34家族(miR34s)包含3種亞型，即miR-34a、miR-34b及miR-34c。近年來的研究證實miR-34家族能直接作用于p53，抑制細(xì)胞周期及DNA損傷應(yīng)答所涉及的mRNA轉(zhuǎn)錄水平[23]。WELCH等[24]研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中異位表達(dá)miR-34a可以加速細(xì)胞的凋亡。更有研究證明miR-34b/c可以通過阻礙細(xì)胞周期G，抑制細(xì)胞的增殖及生長。因此miR-34家族在細(xì)胞的增殖和凋亡中起著重要的角色。劉利群等[25]的研究中發(fā)現(xiàn)miR-34b-5p可能在發(fā)育期驚厥性腦損傷后早期神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，并且通過構(gòu)建復(fù)發(fā)性癲癇大鼠模型證明miR-34b-5p介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡繼而導(dǎo)致血腦屏障的損傷，這與本研究結(jié)果一致。

miR-21家族目前已經(jīng)在30多個物種體內(nèi)的組織和細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，是在哺乳動物體中最早被發(fā)現(xiàn)的miRNAs分子之一。miR-21是在哺乳動物上最早被發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的miRNAs分子中的一種，目前已在31個物種體內(nèi)的多種組織及細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有miR-21的存在，但還沒在植物上發(fā)現(xiàn)[26]。大量試驗表明，miR-21對多種腫瘤和心血管疾病的形成和發(fā)展都具有重要影響。RAIKWAR等[27]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)外傷尤其是腦外傷(TBI)時，miR-21a-5p表達(dá)明顯上調(diào)，可以用來做TBI特定的生物標(biāo)記。YINING等[28]證明miR-21a-5p 通過抑制 CNTF/STAT3/Nkrf 通路上調(diào)神經(jīng)毒性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞 (A1) 極化來促進(jìn)創(chuàng)傷性脊髓損傷。更有試驗表明miR-21a-5p可調(diào)節(jié)新生小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，并保護(hù)大腦免受缺氧缺血性損傷后的炎癥。多種試驗證明miR-21a-5p可能參與星形膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)，與本次測序所得到的結(jié)果相符。

miRNA靶基因預(yù)測分析對探索miRNA分子功能具有重要意義，靶基因功能注釋將為基因調(diào)控機(jī)制的闡釋提供研究方向。本研究通過差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測及功能注釋發(fā)現(xiàn)靶基因顯著富集于Ras信號通路、癌癥中的蛋白多糖、FcεRI信號通路和神經(jīng)膠質(zhì)瘤通路。RAS通路作為調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、生長、遷移、分化或細(xì)胞骨架動態(tài)的信號通路；FcεRI信號通路則調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子，其中最重要的是TNF-α、IL-4和IL-5。這些介質(zhì)和細(xì)胞因子有助于炎癥反應(yīng)，這些通路都會對血腦屏障的通透性產(chǎn)生影響，這與本研究的目的一致。綜上所述，差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測及基因功能注釋分析，進(jìn)一步揭示相關(guān)miRNA及其靶基因?qū)ρX屏障通透性的改變發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。