陳寶婷，陳舉亮，詹亞坤，張素方

（廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519015）

知母具有清熱瀉火、生津潤燥功效，臨床用于高熱煩渴、骨蒸潮熱、虛煩不眠等癥，常與黃柏以藥對形式配伍應(yīng)用，經(jīng)典方劑有滋腎通關(guān)丸、知柏地黃丸、大補(bǔ)陰丸等。知母總皂苷是知母中主要的有效甾體皂苷，知母皂苷A-Ⅲ（TA-Ⅲ）又稱西陵皂苷A-Ⅲ，是知母總皂苷的主要活性成分，抗癌、抗衰老、抗血管生成、抗氧化、降血糖、抗抑郁、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善記憶力等作用顯著［1-9］。目前，關(guān)于測定生物基質(zhì)中TA-Ⅲ的方法有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法［10］和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法［11］，但存在血漿用量大、離子抑制效應(yīng)嚴(yán)重、選擇性和靈敏度低、線性范圍窄、運(yùn)行時(shí)間長等不足。為此，本研究中建立了測定大鼠血漿中TA-Ⅲ的LC-MS/MS法，并考察其藥物代謝動力學(xué)（PK）特征，為其臨床合理應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

API4000+型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Applied Biosystems公司），配有Turbo Ionspray離子源及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；LC-20AD型高效液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司），配有DGU-20A3型在線真空脫氣機(jī)，LC-20AD型泵，SIL-20AC型自動進(jìn)樣器，CBM-20A型控制器，CTO-20A型色譜柱柱溫箱；Microfuge 16型臺式微量離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特公司）；Milli-Q型超純水機(jī)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

TA-Ⅲ對照品（天津中新藥業(yè)中藥現(xiàn)代化技術(shù)工程中心，批號為MUST-15020108，純度＞99%）；人參皂苷Rg2對照品（內(nèi)標(biāo)，中國食品藥品檢定研究院，批號為110406，純度＞99%）；知母（批號為110501），黃柏（批號為120104991），均購自廣州致信中藥飲片有限公司；乙腈和乙酸銨均為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠12只，雄性，體質(zhì)量230～270 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號為（粵）0100527，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號為SYXK（粵）2018-0094。所有大鼠均飼養(yǎng)于溫度為20～25℃、相對濕度為40%～70%的房間內(nèi)，自然明暗循環(huán)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

1）色譜條件。色譜柱：Agilent XDB-C8柱（150 mm×2.1 mm，5μm）；流動相：乙腈-2 mmol/L乙酸銨（55∶45，V/V）；流速：250μL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL。

2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：4 500 V；霧化溫度：500℃；霧化氣：60 psi；加熱輔助氣：40 psi；氣簾氣：20 psi；碰撞氣：12 psi；檢測方式：負(fù)離子多離子反應(yīng)監(jiān)測；用于定量分析的離子質(zhì)荷比（m/z）：739.5→577.4（TA-Ⅲ），783.5→475.2（內(nèi)標(biāo)）。

2.2 溶液制備

取TA-Ⅲ對照品1.50 mg，精密稱定，加55%乙腈配制成質(zhì)量濃度為150 μg/mL的TA-Ⅲ貯備液，置4℃冰箱保存，備用。

取人參皂苷Rg2對照品10 mg，精密稱定，加55%乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液，繼續(xù)加55%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為20μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，置4℃冰箱保存，備用。

分別稱取知母100 g和知母-黃柏（1∶1，m/m）200 g，加適量超純水浸泡30 min，加熱回流提取3次，每次60，60，45 min，3次加入的超純水體積比為5∶3∶3（V/V/V），趁熱濾過，合并濾液，濃縮得知母單煎液、知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液。采用LC-MS/MS法測定各煎液中TA-Ⅲ的質(zhì)量濃度，加超純水稀釋，得TA-Ⅲ質(zhì)量濃度均為0.117 mg/mL的知母供試品溶液和知母-黃柏（1∶1，m/m）供試品溶液。

2.3 樣品處理

吸取大鼠血漿樣品50μL，加內(nèi)標(biāo)工作液20μL，渦旋振蕩30 s，加乙腈200μL，渦旋振蕩2 min，離心（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min）10 min，吸取上清液150μL，加90μL超純水，渦旋振蕩30 s，離心（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min）30 s，0.2μm薄膜濾過，取濾液，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取空白血漿、空白血漿+TA-Ⅲ+內(nèi)標(biāo)、灌胃TA-Ⅲ血漿樣品各適量，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。結(jié)果TA-Ⅲ和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為3.15 min和1.55 min，色譜峰峰形良好，分離完全，無內(nèi)源性物質(zhì)與其他物質(zhì)干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限確定：取2.2項(xiàng)下TA-Ⅲ貯備液，用55%乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為60 μg/mL，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加空白血漿配制成質(zhì)量濃度為3 000 ng/mL的TA-Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)血樣。加入空白血漿，稀釋得質(zhì)量濃度分別為0.3，1，3，10，30，100，300，1 000，2 500，3 000 ng/mL的系列TA-Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)血樣，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。以TA-Ⅲ和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）、TA-Ⅲ質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL）進(jìn)行加權(quán)線性回歸（權(quán)重為1/X2），得回歸方程Y=4.88×10-4X+1.31×10-4（r=0.999 3，n=10）。結(jié)果表明，TA-Ⅲ質(zhì)量濃度在0.3～3 000 ng/mL范圍內(nèi)與TA-Ⅲ和內(nèi)標(biāo)峰面積比值線性關(guān)系良好。定量下限為0.3 ng/mL。

1.TA-Ⅲ2.人參皂苷Rg2A.空白血漿 B.空白血漿+TA-Ⅲ+內(nèi)標(biāo) C.灌胃TA-Ⅲ血漿圖1專屬性試驗(yàn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.TA-Ⅲ2.Ginsenoside Rg2A.Blank plasma B.Blank plasma+TA-Ⅲ+internal standard C.Plasma obtained from rats after the gastrointestinal administration of TA-ⅢFig.1 LC-MS/MS chromatograms of the specificity test

精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下TA-Ⅲ貯備液，用55%乙腈稀釋至質(zhì)量濃度為60 μg/mL，精密吸取0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加空白血漿配制成質(zhì)量濃度為3 000 ng/mL的TA-Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)血樣。加入空白血漿，稀釋得質(zhì)量濃度為1，1 500，2 500 ng/mL的系列TA-Ⅲ質(zhì)控樣品，各5份，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，于同1 d和連續(xù)3 d測定質(zhì)控樣品中TA-Ⅲ的質(zhì)量濃度。以日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察方法的精密度，以相對回收率（實(shí)測濃度與真實(shí)濃度的比值）考察準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

表1 血漿中TA-Ⅲ的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（%，n=5）Tab.1 Results of the precision and accuracy tests of TA-Ⅲin plasma（%，n=5）

提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)：按精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為1，1 500，2 500 ng/mL的TA-Ⅲ質(zhì)控樣品，各5份，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，得峰面積（A1）；取空白血漿，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，得峰面積（A2）；用乙腈沉淀空白血漿，取上清液150μL，加內(nèi)標(biāo)工作液與TA-Ⅲ貯備液各適量，使TA-Ⅲ的質(zhì)量濃度分別為1，1 500，2 500 ng/mL，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定，得峰面積（A3）。按公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)（%）=（A3/A1×100%）；按公式計(jì)算提取回收率，提取回收率（%）=（A2/A3×100%）。結(jié)果見表2。

表2 血漿中TA-Ⅲ的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=5）Tab.2 Results of the extraction recovery and matrix effect tests of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

表2 血漿中TA-Ⅲ的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=5）Tab.2 Results of the extraction recovery and matrix effect tests of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

質(zhì)量濃度1 ng/mL 1 500 ng/mL 2 500 ng/mL提取回收率96.03±3.94 100.66±1.68 102.11±1.31基質(zhì)效應(yīng)90.63±6.45 83.57±0.26 88.88±0.49

殘留效應(yīng)試驗(yàn)：按精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為2 500 ng/mL的TA-Ⅲ質(zhì)控樣品，并取空白血漿樣品，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件分別交替進(jìn)樣分析6次，考察TA-Ⅲ與內(nèi)標(biāo)的殘留效應(yīng)。結(jié)果高濃度的TA-Ⅲ進(jìn)樣后幾乎無殘留，符合方法學(xué)要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：按精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度分別為1，1 500，2 500 ng/mL的TA-Ⅲ質(zhì)控樣品，各5份，分別將樣品于室溫下放置4 h、反復(fù)凍融3次、4℃放置24 h后，按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表3 血漿中TA-Ⅲ的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=5）Tab.3 Results of the stability test of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

表3 血漿中TA-Ⅲ的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（±s，%，n=5）Tab.3 Results of the stability test of TA-Ⅲin plasma（±s，%，n=5）

質(zhì)量濃度1 ng/mL 1 500 ng/mL 2 500 ng/mL室溫（4 h）109.25±8.99 90.17±3.82 91.30±0.82反復(fù)凍融（3次）108.00±9.06 91.83±2.52 91.20±1.90 4℃（24 h）100.24±12.31 108.80±3.69 106.80±3.88

2.5 PK研究

大鼠給藥前禁食16 h，自由飲水。取12只大鼠，隨機(jī)分為知母單煎液組和知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液組，各6只，均灌胃給藥TA-Ⅲ1.17 mg/kg。分別于給藥0，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24，36 h時(shí)取眼眶血0.4 mL，置肝素化離心管中離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min）15 min，制備血漿，-80℃保存，待測。按2.3項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下試驗(yàn)條件進(jìn)樣測定TA-Ⅲ的血藥濃度。采用DAS 2.1.1軟件，根據(jù)非房室模型對血藥濃度和時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并計(jì)算PK參數(shù)（表4）。其中，藥物最大濃度的時(shí)間點(diǎn)（tmax）和最大血藥濃度（Cmax）均為實(shí)測值，采用梯形法計(jì)算血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC），并繪制曲線圖（圖2）。結(jié)果知母單煎液組大鼠TA-Ⅲ的血藥濃度低，藥物吸收較慢，灌胃給藥1 h后才檢測到一定濃度的TA-Ⅲ。與知母單煎液組比較，知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液組TA-Ⅲ的血藥濃度仍較低，但AUC增大，且0-∞的平均滯留時(shí)間（MRT0-∞）和消除半衰期（t1/2）均顯著延長（P＜0.01）。

表4 TA-Ⅲ的PK參數(shù)（±s，n=6）Tab.4 PK parameters of TA-Ⅲ（±s，n=6）

表4 TA-Ⅲ的PK參數(shù)（±s，n=6）Tab.4 PK parameters of TA-Ⅲ（±s，n=6）

注：與知母單煎液組比較，*P＜0.01。Note：Compared with those in the Anemarrhenae Rhizoma decoction group，*P＜0.01.

PK參數(shù)AUC0-t［（μg·h）/L］AUC0-∞［（μg·h）/L］MRT0-t（h）MRT0-∞（h）t1/2（h）tmax（h）Cmax（μg/L）知母單煎液組586.90±281.50 662.59±241.35 9.23±1.88 12.92±4.05 6.99±3.00 6.33±1.97 48.65±25.07知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液組706.59±402.34 912.57±540.44 12.39±3.98 22.96±20.57*15.12±17.93*7.60±2.61 51.28±23.32

圖2 TA-Ⅲ平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n=6）Fig.2 Mean drug concentration-time curves of TA-Ⅲ（n=6）

3 討論

為進(jìn)一步改善液相色譜的分離效能，參考文獻(xiàn)［10-13］，在水相中分別嘗試了不同比例的甲酸和乙酸銨溶液，最終確定流動相為乙腈-2 mmol/L乙酸銨（55∶45，V/V）。結(jié)果色譜峰峰形良好，TA-Ⅲ和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為3.15 min和1.55 min，分析周期僅4 min。在實(shí)驗(yàn)樣品前處理中，僅需血漿樣品50 μL，是文獻(xiàn)［12］報(bào)道血漿用量的1/2。用血量的減少有利于實(shí)驗(yàn)動物在連續(xù)采血的PK研究中保持良好的生理狀態(tài)，更加客觀地反映藥物的PK特征。TA-Ⅲ的定量下限為0.3 ng/mL，比文獻(xiàn)［10］報(bào)道的更低，保留時(shí)間也縮短，可快速、準(zhǔn)確、靈敏地完成TA-Ⅲ的測定。

在中藥復(fù)方及臨床應(yīng)用中，知母-黃柏藥對2味藥材質(zhì)量比多為1∶1（m/m），如知柏地黃丸、大補(bǔ)陰丸等。本研究中重點(diǎn)考察了知母-黃柏等量配伍后，知母有效成分TA-Ⅲ的體內(nèi)PK特征，并與知母單獨(dú)給藥進(jìn)行比較。結(jié)果知母單煎液組大鼠TA-Ⅲ的血藥濃度低，藥物吸收較慢，灌胃給藥1 h后才檢測到一定濃度的TA-Ⅲ。與知母單煎液組比較，知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液組TA-Ⅲ的血藥濃度仍較低，但AUC增大，且MRT0-∞和t1/2均顯著延長。提示知母等量配伍黃柏可促進(jìn)TA-Ⅲ的吸收，提高藥效。

綜上所述，建立的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于測定大鼠體內(nèi)TA-Ⅲ的血藥濃度。知母-黃柏（1∶1，m/m）合煎液促進(jìn)了TA-Ⅲ的吸收，可延長其MRT0-∞和t1/2。