蘇思維 姜雯君 王曉穎 杜森 宋洪強(qiáng)

（山東第一醫(yī)科大學(xué)暨山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究所，泰安 271000）

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種嚴(yán)重的慢性自身免疫性疾病，特征是持續(xù)性滑膜炎和系統(tǒng)性炎癥。全球RA患者占成年人的0.5%~1.0%［1］。RA是導(dǎo)致嚴(yán)重肢體殘疾的重要因素之一，給患者帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有報(bào)告指出，RA會(huì)顯著縮短患者的預(yù)期壽命［2］。目前，尚無(wú)治愈RA的方法，主要依賴(lài)于早期的發(fā)現(xiàn)和積極的治療。因此，研究RA的分子機(jī)制和分析相關(guān)的信號(hào)通路，有利于發(fā)現(xiàn)更加有效的治療靶點(diǎn)。

RA在性別上的差異是不容忽視的。有研究證實(shí)，女性患RA的概率是男性的3倍［3］。盡管性別的差異可能在導(dǎo)致自身免疫功能紊亂方面發(fā)揮復(fù)雜的作用，但迄今為止，性別因素與RA發(fā)病之間的聯(lián)系尚不清楚［4］。因此，本研究的目的是通過(guò)全面的生物信息學(xué)分析，探討RA發(fā)生發(fā)展在性別差異間的關(guān)鍵基因與途徑，將有助于進(jìn)一步了解RA發(fā)病的性別特異性，為RA提供潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下 載 基 因 表 達(dá) 譜GSE55457、GSE55584和GSE12021。篩選條件為：①RA；②人類(lèi)；③滑膜。本研究納入GSE12021數(shù)據(jù)集中7例正常男性滑膜樣本，2例正常女性滑膜樣本，3例男性RA滑膜樣本，9例女性RA滑膜樣本；GSE55457數(shù)據(jù)集中8例正常男性滑膜樣本，2例正常女性滑膜樣本，3例 男 性RA滑膜 樣 本，10例女 性RA樣本；GSE55584數(shù)據(jù)集中3例男性RA滑膜樣本，7例女性RA樣本。

1.2 數(shù)據(jù)整理及篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）使用R軟件獲取原始數(shù)據(jù)，采用log2變換進(jìn)行歸一化處理。將篩選出的樣本合并后分為男性組：男性RA和男性健康對(duì)照；女性組：女性RA和女性健康對(duì)照進(jìn)行兩兩比較。選擇P≤0.05和|log2FC|≥1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。利用R軟件中的ggplot2包制作DEGs火山圖。

1.3 功能富集分析DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）是一個(gè)被廣泛使用的在線數(shù)據(jù)庫(kù)，DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)GO分析和KEGG通路分析為DEGs進(jìn)行功能和通路富集分析［5-7］。為了獲取DEGs的生物學(xué)功能和信號(hào)傳導(dǎo)通路，本研究通過(guò)DAVID對(duì)DEGs進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。

1.4 蛋白-蛋白相互作用分析本研究將所有的DEGs上傳至STRING在線分析網(wǎng)站（https：//stringdb.org/）。以“combined score>0.7”作為篩選條件。導(dǎo)出分析結(jié)果通過(guò)Cytoscape軟件3.60版本進(jìn)行可視化處理［8］，并采用cytoHubba插件根據(jù)“Degree”算法，篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中前5個(gè)關(guān)鍵基因。

1.5 模塊化分析Cytoscape軟件中的MCODE插件被用來(lái)篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的密集連結(jié)區(qū)域［9］。本研究使用MCODE從構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)中獲取核心模塊。參數(shù)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為：node score cutoff=0.2，K-core=2，degree cutoff=2。此外，對(duì)模塊分析結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步通路富集分析，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs將GSE55457、GSE55584和GSE12021數(shù)據(jù)集篩選整理后進(jìn)一步差異分析得到男性組：RA 9例，正常15例，女性組：RA 26例，正常4例。其中男性組中高表達(dá)基因416個(gè)，低表達(dá)基因336個(gè)，女性組中高表達(dá)基因744個(gè)，低表達(dá)基因309個(gè)?；鹕綀D如圖1所示，紅色代表高表達(dá)的基因，藍(lán)色代表低表達(dá)的基因。

圖1 GSE55457、GSE55584和GSE12021的DEGs火山圖Fig.1 Volcano plots of DEGs of GSE55457，GSE55584 and GSE12021

2.2 DEGs GO分析GO富集分析結(jié)果顯示，男性組DEGs主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括免疫應(yīng)答、細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等；細(xì)胞組成包括胞外區(qū)、細(xì)胞膜外側(cè)、細(xì)胞膜的組成成分等；分子功能包括細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄激活因子活性、serine-type肽鏈內(nèi)切酶活性等。女性組DEGs主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等；細(xì)胞組成上包括細(xì)胞膜的組成成分、細(xì)胞膜、細(xì)胞外區(qū)等；分子功能包括趨化因子活性、C-C趨化因子受體活性、肝素結(jié)合等。見(jiàn)圖2和表1、表2。

表1 前5女性DEGs GO富集分析Tab.1 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in females

表2 前5男性DEGs GO富集分析Tab.2 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in males

圖2 不同性別DEGs的前5個(gè)GO富集分析Fig.2 Top 5 GO enrichment analysis of DEGs in females and males

2.3 KEGG信號(hào)通路分析采用KEGG途徑富集分析來(lái)了解DEGs信號(hào)通路的富集情況，以P≤0.05為臨界值。KEGG通路分析顯示，男性組DEGs主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、人類(lèi)嗜T細(xì)胞病毒（human T cell leukemia virus type-Ⅰ，HTLV-Ⅰ）感染、造血細(xì)胞譜系等通路中。KEGG通路分析顯示，女性組DEGs主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷等通路中，見(jiàn)圖3和表3、表4。

表3 前5女性DEGs KEGG通路分析Tab.3 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in females

表4 前5男性DEGs KEGG通路分析Tab.4 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in males

圖3 不同性別DEGs的前5個(gè)KEGG通路分析Fig.3 Top 5 KEGG pathway analysis of DEGs in females and males

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 本研究使用在線工具STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)分析DEGs之間的相互作用。將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0工具，篩選出各組degree得分前5位基因，其中男性組前5位關(guān)鍵基因是IL-6、MYC、EGFR、FOS和JUN；女性組中前5位關(guān)鍵基因是IL-6、ALB、PTPRC、CXCL8和CCR5，見(jiàn)附圖1（www.immune99.com）。

2.5 模塊分析采用Cytoscape軟件構(gòu)建DEGs的PPI后，用MCODE插件獲取各組核心模塊，并對(duì)該模塊中的基因進(jìn)行KEGG分析。KEGG富集分析表明，男性組核心模塊的基因主要參與趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)；女性組核心模塊的基因主要與趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和神經(jīng)活性配體-受體相互作用相關(guān)，見(jiàn)圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)的核心模塊及其KEGG通路分析Fig.4 Clusters of PPI networ and KEGG pathway analysis

3 討論

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE55457、GSE55584、GSE12021基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選和整理得到男性組：RA 9例，正常15例，女性組：RA 26例，正常4例。其中男性組中高表達(dá)基因416個(gè)，低表達(dá)基因336個(gè)，女性組中高表達(dá)基因744個(gè)，低表達(dá)基因309個(gè)。在本研究中，DEGs的KEGG通路分析顯示，在男性中主要富集通路是細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、HTLV-Ⅰ感染、造血細(xì)胞譜系、原發(fā)性免疫缺陷和癌癥通路。KEGG通路分析顯示，在女性中富集的通路主要有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)通路、原發(fā)性免疫缺陷、造血細(xì)胞譜系。HTLV-Ⅰ感染和趨化因子信號(hào)通路已經(jīng)被證明參與了RA的發(fā)?。?0-12］。HTLV-Ⅰ是一種人類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒，HTLV-ⅠTax可誘導(dǎo)NF-κB活化宿主細(xì)胞。此外，Tax介導(dǎo)的NF-κB活化涉及HTLV-Ⅰ感染細(xì)胞對(duì)凋亡刺激的抵抗。HTLV-ⅠTax的這些調(diào)節(jié)作用被認(rèn)為具有促進(jìn)HTLV-Ⅰ血清陽(yáng)性受試者自身免疫性疾病，如RA的重要作用［13］。此外，尚未有研究探討性別在RA相關(guān)通路中的作用，本研究發(fā)現(xiàn)，在RA男性和女性發(fā)病過(guò)程中有著相同的信號(hào)通路，如細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、造血細(xì)胞譜系與原發(fā)性免疫缺陷等，但目前尚無(wú)文獻(xiàn)研究這些信號(hào)通路與RA發(fā)病之間的關(guān)系。

通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到，男性組中關(guān)鍵基因?yàn)镮L-6、MYC、EGFR、FOS和JUN，女性組中關(guān)鍵基因?yàn)镮L-6、ALB、PTPRC、CXCL8和CCR5，其中IL-6在男性和女性組中均被鑒定為關(guān)鍵基因，而其他關(guān)鍵基因在男性組和女性組之間完全不同。EGFR在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用［14］。與腫瘤生長(zhǎng)相似，RA中EGFR及其配體的上調(diào)將導(dǎo)致RA滑膜的增生和侵襲［15］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，通過(guò)藥物調(diào)控EGFR或其配體可能是治療RA的有效方法［16］。由JUN蛋白和FOS蛋白組成的二聚體復(fù)合體AP-1是細(xì)胞核中重要的轉(zhuǎn)錄因子。c-Fos/AP-1可以控制炎癥因子IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)［17］。IL-1β是多種基質(zhì)金屬蛋白酶最重要的誘導(dǎo)劑，與軟骨破壞和破骨細(xì)胞生成密切相關(guān)［18］。此外，IL-1β和c-Fos/AP-1相互影響基因表達(dá)和活性，加重RA的進(jìn)展。PTPRC，又稱(chēng)CD45，是經(jīng)典的蛋白酪氨酸磷酸酶，在所有造血源有核細(xì)胞中表達(dá)［19］。蛋白酪氨酸蛋白磷酸酶是T細(xì)胞抗原受體激活T細(xì)胞所必需的，一些風(fēng)險(xiǎn)等位基因已經(jīng)被確認(rèn)與RA發(fā)病的增加有關(guān)，而PT?PRC的上調(diào)可能有利于維持正?；すδ埽?0］。趨化因子是細(xì)胞黏附和細(xì)胞運(yùn)輸?shù)闹饕{(diào)控因子，具有誘導(dǎo)附近應(yīng)答細(xì)胞定向趨化的能力［21］。CXCL8作為炎癥介質(zhì)，在成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá)，并作為中性粒細(xì)胞的趨化因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞在炎癥部位（如RA患者的炎癥關(guān)節(jié)）聚集［22］。CCR5是細(xì)胞內(nèi)β趨化因子的受體，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移、增殖和免疫，CCR5主要表達(dá)于單核細(xì)胞和未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜上［23］。CCR5及其配體除了是早期HIV-1感染所必需的共受體外，還在RA和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中發(fā)揮重要作用［24-26］。此外，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊化分析，發(fā)現(xiàn)男性組核心模塊KEGG分析主要與趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和Toll樣受體信號(hào)通路有關(guān)；女性組核心模塊KEGG分析主要與趨化因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體-受體相互作用有關(guān)。

綜上所述，本研究使用生物信息學(xué)技術(shù)整合3個(gè)RA表達(dá)譜芯片，分別對(duì)男性和女性RA患者的DEGs進(jìn)行分析，得到了不同的關(guān)鍵基因，本研究發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致男性和女性RA發(fā)病機(jī)制差異的相關(guān)證據(jù)，為RA的治療提供了更有前景的治療靶點(diǎn)。