楊琪 王波濤 黨惠兵（河南省南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南陽 473000）

淋巴細胞白血病是一種血液性的惡性腫瘤，按病程緩急分為急性和慢性，急性型常見于兒童，慢性型多見于中老年患者。分子靶向治療是淋巴細胞白血病新型的治療方式，研究其分子發(fā)病機制，可為臨床新藥研發(fā)提供參考［1-3］。研究表明血液惡性腫瘤中l(wèi)ncRNAs的異常表達參與其進展過程［4］。研究報道沉默lncRNA MAFG-AS1通過調(diào)控miR-3196抑制胰腺癌細胞增殖和遷移，促進胰腺癌細胞凋亡［5］。敲低MAFG-AS1可通過調(diào)節(jié)miR-150-5p抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移［6］。沉默MAFG-AS1抑制肺腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡［7］。然而MAFGAS1對淋巴細胞白血病的影響及機制尚不清楚。研究表明miRNA是腫瘤抑制因子和致癌基因，可作為治療白血病的靶標［8］。研究報道m(xù)iR-335-3p在急性淋巴細胞性白血病中低表達，與患者不良預后有關［9］。LncRNA CDKN2B-AS1通 過miR-335-3p/TRAF5軸促進小兒T細胞急性淋巴細胞白血病的腫瘤發(fā)生和化學耐藥性［10］。本實驗通過在線軟件預測發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1與miR-335-3p的結合位點。但MAFG-AS1是否通過靶向調(diào)控miR-335-3p影響淋巴細胞白血病還尚不清楚。因此，本實驗旨在研究MAFG-AS1對淋巴細胞白血病的影響及機制是否與miR-335-3p表達有關。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料以2018年1月至2020年12月間河南省南陽醫(yī)學高等?？茖W校第一附屬醫(yī)院25例急性白血病患者為研究對象，其中男16例，女9例，年齡12~68歲，平均（35.2±2.3）歲；并隨機選取25例健康志愿者作為正常對照，抽取患者及健康對照的外周血標本，離心、分離血漿后置于-20℃冰箱保存待用。

1.1.2 主要試劑人T淋巴細胞白血病細胞HUT-78購自上海秋傳生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海玉博生物科技有限公司；Tripure分離試劑購自德國Roche公司；Trizol試劑購自上海瑞楚生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上海子起生物科技有限公司；MTT試劑盒購自上海美軒生物科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自上海機純實業(yè)有限公司；雙熒光素酶報告實驗檢測試劑盒購自上海英拜生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自南京恩晶生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染與分組人T淋巴細胞白血病細胞HUT-78置于RPMI1640培養(yǎng)基在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將MAFG-AS1抑制表達載體質(zhì)粒及陰性對照，miR-335-3p模擬物或抑制劑及其對應的陰性對照轉染至HUT-78，分別記為si-NC組、si-MAFGAS1、miR-NC組、miR-335-3p組、anti-miR-NC組、an?ti-miR-335-3p組；將MAFG-AS1抑制表達載體質(zhì)粒與miR-335-3p抑制劑共轉染至HUT-78，記為si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p組。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測MAFGAS1和miR-335-3p的表達水平將分離后的血漿用Tripure分離試劑提取血漿總RNA；用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，將RNA反轉錄成cDNA（42℃反應1 h，95℃5 min，然后置于冰上），按照熒光定量試劑盒說明書進行PCR，擴增條件：94℃2 min；94℃30 s，58℃60 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；后72℃延伸5 min；然后進行融解曲線；相對表達量用2-ΔΔCt法計算。MAFG-AS1正向引物：5'-GGGACG?GAGACAAATGACGG-3'，反向引物：5'-GCAGGCTCCCTGACACGTA-3'；GAPDH正向引物：5'-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3'，反向引物：5'-TTACTCCTT?GGAGGCCATGT-3'；miR-335-3p正向引物：5'-TCAAGAGCAATAACGAAAATGT-3'，反向引物：5'-TTTTTCATTATTGCTCCTGACC-3'；U6正向引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，反向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3'。

1.2.3 MTT檢測細胞活性將各組對數(shù)生長期細胞消化后接種于96孔板，每組設3個復孔，分別培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時，每孔加入20μl的MTT溶液，反應4 h后加入150μl DMSO，振蕩反應10 min，用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度（OD）值。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡收集各組細胞，PBS洗2遍后調(diào)細胞濃度2×106個/ml，用結合緩沖液重懸，取490μl細胞加入5μl FITC-Annexin V及5μl PI，混勻溫育10 min，上機分析，同時以不加Annexin V-FITC及PI的細胞作為陰性對照。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗構建MAFG-AS1的野生型和突變型熒光素酶載體，待細胞密度達到70%時，將其分別與miR-NC和miR-335-3p共轉染至HUT-78胞中，轉染48 h后按照試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Western blot法檢測蛋白表達提取各組細胞的總蛋白，取30μl蛋白樣品進行SDS-PAGE，通過濕轉法將蛋白轉至PVDF膜，加入封閉液室溫反應2 h；洗膜后加入稀釋好的一抗4℃過夜，倒掉一抗并洗膜后再加入稀釋好的二抗，室溫培養(yǎng)2 h，加入顯色液顯影，成像后用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度水平，計算蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MAFG-AS1、miR-335-3p在白血病患者中的表達與正常人血漿相比，白血病患者血漿中MAFGAS1表達水平升高，miR-335-3p表達水平降低（P<0.05，表1）。

表1 檢測白血病患者中MAFG-AS1、miR-335-3p表達（±s，n=25）Tab.1 Detection of MAFG-AS1 and miR-335-3p expres?sion in leukemia patients（±s，n=25）

表1 檢測白血病患者中MAFG-AS1、miR-335-3p表達（±s，n=25）Tab.1 Detection of MAFG-AS1 and miR-335-3p expres?sion in leukemia patients（±s，n=25）

Note：Compared with plasma of normal human group，1）P<0.05.

Groups Plasma of normal human Plasma of leukemia patients t P MAFG-AS1 1.02±0.13 5.33±0.271）71.913 0.000 miR-335-3p 0.99±0.11 0.16±0.031）36.398 0.000

2.2 各處理組中MAFG-AS1和miR-335-3p表達情況的檢測與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組MAFGAS1表達水平降低，miR-335-3p表達水平升高（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-335-3p組miR-335-3p表達水平升高（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，an?ti-miR-335-3p組miR-335-3p表 達 水 平 降 低（P<0.05）；與si-MAFG-AS1組相比，si-MAFG-AS1+antimiR-335-3p組miR-335-3p表達水平降低（P<0.05，圖1）。

圖1 MAFG-AS1和miR-335-3p的表達Fig.1 Expression of MAFG-AS1 and miR-335-3p

2.3 各處理組中細胞活性的檢測與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組細胞活性降低（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-335-3p組細胞活性降低（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-335-3p組細胞活性升高（P<0.05）；與si-MAFG-AS1組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p組細胞活性升高（P<0.05，圖2）。

圖2 各處理組細胞活性的檢測Fig.2 Detection of cell viability in each treatment group

2.4 各處理組中凋亡率的檢測與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組細胞凋亡率升高（P<0.05）；與miRNC組相比，miR-335-3p組細胞凋亡率升高（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-335-3p組細胞凋亡率降低（P<0.05）；與si-MAFG-AS1組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p組細胞凋亡率降低（P<0.05，圖3、表2）。

表2 流式細胞儀檢測各處理組細胞凋亡率（±s，n=3）Tab.2 Flow cytometry detection of apoptosis rate of each treatment group（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05；compared with anti-miR-NC group，3）P<0.05；compared with si-MAFG-AS1 group，4）P<0.05.

Groups si-NC si-MAFG-AS1 miR-NC miR-335-3p anti-miR-NC anti-miR-335-3p si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p F P Apoptosis rate（%）8.63±0.22 21.44±0.831）8.54±0.38 24.70±0.992）8.75±0.37 3.60±0.383）13.57±0.614）491.787 0.000

圖3 細胞凋亡率的檢測Fig.3 Detection of cell apoptosis rate

2.5 MAFG-AS1靶向miR-335-3p關系的驗證DI?ANA Tools預測顯示MAFG-AS1和miR-335-3p有互補序列（圖4）。Wt-MAFG-AS1與miR-335-3p共轉染的細胞熒光素酶活性降低，而Mut-MAFG-AS1與miR-335-3p共轉染的細胞熒光素酶活性無顯著變化（表3）。

圖4 MAFG-AS1和miR-335-3p的互補序列Fig.4 Complementary sequence of MAFG-AS1 and miR-335-3p

表3 熒光素酶活性的檢測（±s，n=3）Tab.3 Detection of luciferase activity（±s，n=3）

表3 熒光素酶活性的檢測（±s，n=3）Tab.3 Detection of luciferase activity（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-335-3p t P Wt-MAFG-AS1 0.96±0.09 0.15±0.011）15.493 0.000 Mut-MAFG-AS1 0.93±0.08 1.01±0.06 1.386 0.238

2.6 各處理組中凋亡蛋白表達的檢測與si-NC組相比，si-MAFG-AS1組Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-335-3p組Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低（P<0.05）；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-335-3p組Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高（P<0.05）；與si-MAFG-AS1組相比，si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p組Bax表達水平降低，Bcl-2表達水平升高（P<0.05，圖5、表4）。

圖5 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達Fig.5 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expression

表4 Western blot檢測各處理組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expressions in cells of each treatment group（±s，n=3）

表4 Western blot檢測各處理組細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達（±s，n=3）Tab.4 Western blot detection of Bax and Bcl-2 protein expressions in cells of each treatment group（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05；compared with anti-miR-NC group，3）P<0.05；compared with si-MAFG-AS1 group，4）P<0.05.

Groups si-NC si-MAFG-AS1 miR-NC miR-335-3p anti-miR-NC anti-miR-335-3p si-MAFG-AS1+anti-miR-335-3p F P Bax 0.23±0.02 0.68±0.051）0.23±0.02 0.80±0.062）0.24±0.01 0.07±0.013）0.34±0.034）187.250 0.000 Bcl-2 0.82±0.07 0.26±0.021）0.83±0.08 0.14±0.012）0.82±0.08 1.35±0.093）0.71±0.054）125.507 0.000

3 討論

非編碼RNA在淋巴細胞白血病的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用，作為潛在的生物標志物和治療靶標用于淋巴細胞白血病的靶向治療［11-12］。lncRNA作為非編碼RNA的一種，參與調(diào)控淋巴細胞白血病的進展，如lncRNA-H19通過靶向miR-29a-3p促進急性髓性白血病細胞增殖，但抑制細胞凋亡［13］。lnc-RNA ANRIL可促進成人T細胞白血病細胞的增殖［14］。MAFG-AS1作為lncRNA的一種，已有研究報道MAFG-AS1可調(diào)控結直腸癌、卵巢癌及宮頸癌細胞的增殖和凋亡［15-17］。而MAFG-AS1對淋巴細胞白血病的影響尚不清楚。本實驗結果顯示，白血病患者血漿中MAFG-AS1表達水平升高；干擾MAFGAS1后，淋巴細胞白血病細胞的活性降低，凋亡率升高，Bax表達水平升高，Bcl-2表達水平降低，表明干擾MAFG-AS1可抑制淋巴細胞白血病細胞的增殖，促進細胞凋亡。

研究報道m(xù)iR-335-3p靶向COPB2促進肺腺癌NCI-H1975細胞的凋亡，抑制細胞遷移和增殖［18］。CASC9可以通過miR-335-3p/S100A14軸促進非小細胞肺癌進展［19］。本實驗結果顯示，白血病患者血漿中miR-335-3p表達水平降低，過表達miR-335-3p可降低細胞活性，提高細胞凋亡率，表明過表達miR-335-3p可抑制淋巴細胞白血病細胞的增殖，促進細胞凋亡。而抑制miR-335-3p表達與過表達miR-335-3p的作用相反。且本實驗還發(fā)現(xiàn)MAFGAS1靶向負調(diào)控miR-335-3p，抑制miR-335-3p表達減弱了干擾MAFG-AS1對淋巴細胞白血病細胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，干擾MAFG-AS1通過靶向上調(diào)miR-335-3p抑制淋巴細胞白血病細胞的增殖，促進細胞凋亡。