劉鳳霞 李國(guó)才 周鳴（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院輸血科，長(zhǎng)沙 410013）

KARL LANDSTEINER發(fā)現(xiàn)了人類第一個(gè)血型系統(tǒng)——ABO，從而打開了血庫(kù)之門［1］。這標(biāo)志著不同個(gè)體紅細(xì)胞膜上紅細(xì)胞抗原唯一性的概念的開始。ABO血型系統(tǒng)至今仍是輸血醫(yī)學(xué)中最重要的血型系統(tǒng)。A101和B101為ABO基因的兩個(gè)等位基因，分別編碼A糖基轉(zhuǎn)移酶和B糖基轉(zhuǎn)移酶。兩者在編碼區(qū)僅有7個(gè)核苷酸存在差異，導(dǎo)致4個(gè)不同的氨基酸殘基。A型個(gè)體表達(dá)A糖基轉(zhuǎn)移酶將UDP-GalNAc分子上的GalNAc基團(tuán)催化轉(zhuǎn)移至H前體糖蛋白從而形成A抗原；而B型個(gè)體表達(dá)B糖基轉(zhuǎn)移酶將從UDP-Ga1分子上的Gal基團(tuán)催化轉(zhuǎn)移至H前體糖蛋白從而形成B抗原［1］。ABO基因位于第9號(hào)染色體，由7個(gè)外顯子組成，跨越約19.5 kb的基因組DNA［2］。最后兩個(gè)外顯子（6和7）編碼ABO糖基轉(zhuǎn)移酶類的催化結(jié)構(gòu)區(qū)域，大多數(shù)編碼序列在7號(hào)外顯子上。開放閱讀框最大的部分位于6、7號(hào)外顯子［3］。一系列遺傳突變，包括替換、剪接位點(diǎn)突變、堿基插入、缺失和雜交等位基因，可能影響A或B糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）活性，導(dǎo)致ABO表型表達(dá)變化［4］。ABO基因型的復(fù)雜性是由于ABO血型基因位點(diǎn)的顯著多樣性。常見(jiàn)的等位基因之間的重組或基因轉(zhuǎn)換可能會(huì)雜交產(chǎn)生意想不到的ABO表型。檢索血型抗原基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，ABO血型基因大部分突變位點(diǎn)位于外顯子6和7，占77%［5］。ABO亞型是糖基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行糖化功能的酶動(dòng)力學(xué)差異造成的［6］。對(duì)1例Ael亞型獻(xiàn)血者進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)其存在新的基因突變，結(jié)合其血清學(xué)特點(diǎn)探討Ael亞型鑒定策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源2021年3月1例ABO正反定型不符的血液標(biāo)本由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院提供。

1.1.2 試劑與儀器抗-A、抗-B單克隆血型試劑（北京金豪制藥股份有限責(zé)任公司）；ABO血型反定型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞（江蘇力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；抗-H抗體（荷蘭sanquin公司）；抗-A，B抗體、核酸提取試劑盒、人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型熒光PCR法試劑盒（江蘇中濟(jì)萬(wàn)泰生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；Glycosyhransferase Activity Kit（美 國(guó)R&D公司）；UDP-GalNAc、MUC-1（美國(guó)Sigma公司）；人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒、特異性引物（天津秀鵬生物技術(shù)有限公司）；KA-2200血型血清專用離心機(jī)（日本久保田公司）；ABI9700 PCR儀（美國(guó)ABI公司）；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)系統(tǒng)FQD-96A（杭州博日科技有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 血型血清學(xué)檢查根據(jù)文獻(xiàn)［7］進(jìn)行紅細(xì)胞ABO血型正反定型檢測(cè)、紅細(xì)胞抗體篩查、H抗原檢測(cè)、唾液中ABH血型物質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)和紅細(xì)胞弱抗原吸收放散試驗(yàn)。

1.2.2 糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定根據(jù)文獻(xiàn)［8］和Gly?cosyhransferase Activity Kit說(shuō)明書繪制糖基轉(zhuǎn)移酶活性測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線；以已知正常A型紅細(xì)胞/血清作為對(duì)照和待測(cè)獻(xiàn)血者的離體后2 h內(nèi)紅細(xì)胞/血清為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性：供體為1 mmol/L的UDP-GalNAc，受體為0.4 mg/L的MUC-1；最后按本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)曲線的轉(zhuǎn)換因子（CF）通 過(guò) 公 式Specific Activty=S（吸 光 度A/μg）×CF（pmol/吸光度A）/Time（minutes）計(jì)算N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性。

1.2.3 ABO血型基因分型PCR摻入染料法以熒光染料通過(guò)摻入DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物表示DNA擴(kuò)增效果。擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析。通過(guò)熔解曲線分析可確認(rèn)目的產(chǎn)物是否被特異性擴(kuò)增，以此判斷ABO的等位基因。

1.2.3.1 全血DNA提取根據(jù)核酸提取試劑盒說(shuō)明書提取該標(biāo)本基因組DNA。

1.2.3.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增和結(jié)果判讀。

1.2.4 ABO血型基因測(cè)序 采用特異性引物對(duì)ABO基因的外顯子1~7進(jìn)行雙鏈擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。使用ChromasPro Version軟件1.2版本將結(jié)果與NCBI-dbRBC網(wǎng)站公布的序列比對(duì)，確定ABO基因的突變位點(diǎn)及類型。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 ABO血型正反定型結(jié)果及紅細(xì)胞抗體篩查結(jié)果結(jié)果顯示標(biāo)本正定型為O型，反定型標(biāo)本血清與B細(xì)胞凝集強(qiáng)度較強(qiáng)，為3+~4+，與A1型紅細(xì)胞凝集強(qiáng)度較弱，為0~1+，提示ABO正反定型不符。反定型采用3個(gè)A型和3個(gè)O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，結(jié)果無(wú)凝集。

2.1.2 H抗原檢測(cè)選取健康成人O型紅細(xì)胞做強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照，A型紅細(xì)胞做弱陽(yáng)性對(duì)照，與獻(xiàn)血者紅細(xì)胞做H抗原檢測(cè)結(jié)果顯示，獻(xiàn)血者紅細(xì)胞與抗-H凝集強(qiáng)度明顯強(qiáng)于健康成人A細(xì)胞，與O細(xì)胞凝集強(qiáng)度相當(dāng)。

2.1.3 唾液中ABH血型物質(zhì)測(cè)定結(jié)果獻(xiàn)血者待檢唾液與標(biāo)化的抗體試劑中和后與A細(xì)胞反應(yīng)有2+凝集，與B細(xì)胞反應(yīng)有2+凝集，與O細(xì)胞反應(yīng)無(wú)凝集；提示患者唾液中無(wú)A、B血型物質(zhì)，只有H血型物質(zhì)。

2.1.4 吸收放散試驗(yàn)結(jié)果采用單克隆抗-A進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)，末次洗液與健康成人O型紅細(xì)胞、A型紅細(xì)胞凝集反應(yīng)均顯示為陰性；放散液與O細(xì)胞凝集反應(yīng)顯示為陰性，但與A細(xì)胞凝集反應(yīng)顯示有凝集，且均為3+，提示該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞表面存在弱A抗原。

2.2N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶的試驗(yàn)結(jié)果采用Glycosyhransferase Activity Kit試劑盒檢測(cè)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞和正常A紅細(xì)胞上N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)獻(xiàn)血者紅細(xì)胞的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性為0。同時(shí)測(cè)定血漿中的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性，發(fā)現(xiàn)該獻(xiàn)血者血漿中的N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶活性亦為0。

2.3 ABO血型基因分型依據(jù)熒光PCR試劑盒結(jié)果分型表判讀，該標(biāo)本ABO血型基因分型為A/O02型（圖1），藍(lán)色框?yàn)閮?nèi)參，紅色框?yàn)殛?yáng)性條帶。

圖1 ABO血型基因分型結(jié)果Fig.1 ABO Blood group genotyping results

2.4 ABO測(cè)序結(jié)果（檢測(cè)1~7外顯子）根據(jù)NCBI網(wǎng)站提供的The Blood Group Antigen Gene Mutation Database綜合結(jié)果判定（以A101為參考序列），該樣本的測(cè)序結(jié)果（表1）為：ABO基因在A101/O02的基礎(chǔ)上發(fā)生了239G>A的雜合突變（圖2），且位于外顯子5的最后一位，極可能導(dǎo)致RNA的可變剪接。該突變將導(dǎo)致ABO基因編碼蛋白的第80位氨基酸由半胱氨酸（Cys）變成絡(luò)氨酸（Tyr）。該突變并未被截止到2020年12月的dbRBC數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。根據(jù)血清學(xué)結(jié)果推測(cè)，該突變可能位于A基因，影響了A抗原表達(dá)。同時(shí)，根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023綜合結(jié)果判定（以A101為參考序列），測(cè)序結(jié)果一致，在ISBT數(shù)據(jù)庫(kù)中同樣未收錄239G>A的突變。

表1 1~7外顯子的測(cè)序結(jié)果Tab.1 Sequencing results of exons 1~7

圖2 ABO基因第5外顯子測(cè)序結(jié)果（239G>A的突變）Fig.2 Sequencing results of the fifth exon of ABO gene（with mutations of 239G>A）

3 討論

ABO血型系統(tǒng)是唯一具有正反定型的血型系統(tǒng)，又因具有強(qiáng)血型抗原性使其成為最為重要的血型系統(tǒng)。ABO亞型是指紅細(xì)胞或分泌液（“分泌型”個(gè)體中）所含A或B抗原量不同的表型［3］。世界范圍內(nèi)有超過(guò)300個(gè)ABO亞型的等位基因報(bào)道［9-10］。大量亞型的原報(bào)道見(jiàn)于使用單克隆分型試劑常規(guī)檢測(cè)ABO血型之前。如果使用常用的人源多克隆抗-A、抗-B和抗-A，B試劑，ABO亞型則表現(xiàn)為血清學(xué)反應(yīng)性減弱。ABO亞型常常導(dǎo)致血型血清學(xué)的ABO血型正反定型不符。A亞型存在一個(gè)問(wèn)題：如果一個(gè)Ax供者被誤判成O型，輸給一個(gè)O型患者，是有潛在危險(xiǎn)的，因?yàn)镺型患者有抗-A，B抗體，可凝集Ax紅細(xì)胞并使其溶解，引起急性血管內(nèi)溶血。因此對(duì)于A亞型的準(zhǔn)確鑒定不僅能反映一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平，同時(shí)對(duì)于輸血安全也非常重要。

中國(guó)人群ABO亞型檢出率為0.015%［11］，比A2弱的亞型很少，大多通過(guò)ABO正反定型不符被發(fā)現(xiàn)。A亞型的特征包括：紅細(xì)胞上A抗原位點(diǎn)減少（與人源多克隆抗-A試劑反應(yīng)較弱或不凝集）；不同程度地凝集人源抗-A、抗-B試劑［3］；H抗原的高度變異性，導(dǎo)致與抗-H試劑反應(yīng)增強(qiáng)；血清中是否存在抗-A1；可利用分泌型檢測(cè)，吸收放散試驗(yàn)；分子生物學(xué)的進(jìn)展使得檢測(cè)紅細(xì)胞上具有A或B抗原弱表達(dá)的許多亞型成為可能［12］。分子檢測(cè)等將A型個(gè)體細(xì)分為A3、Ax、Aend、Ael等。其中Ael亞型為1種少見(jiàn)的A亞型，該亞型個(gè)體紅細(xì)胞上的A抗原極少，僅為A1型的1/1 000。用單克隆抗血清檢測(cè)不到A抗原，需要用人源抗血清吸收放散才能檢出。研究顯示ABO亞型個(gè)體中，吸收放散型亞型（Ael/Bel/AelB/ABel）的個(gè)體者占14%（11/77）［13-15］。Ael紅細(xì)胞與抗-A或抗-A，B試劑不凝集。抗-A，B對(duì)弱的AB抗原的檢測(cè)能力強(qiáng)于單克隆抗-A和抗-B，當(dāng)亞型弱A/B抗原與單克隆抗-A和抗-B反應(yīng)呈陰性時(shí)，常使用抗-A，B進(jìn)行檢測(cè)，但抗-A，B試劑檢測(cè)紅細(xì)胞上抗原并非常規(guī)用于ABO檢測(cè)［16］。Ael只有通過(guò)吸收放散試驗(yàn)才可證實(shí)A抗原的存在，其個(gè)體血清或紅細(xì)胞膜上檢測(cè) 不 到A糖基轉(zhuǎn)移 酶［17］。Ael遺傳 自ABO位 點(diǎn) 上一個(gè)罕見(jiàn)的等位基因［17-18］。Ael型個(gè)體血清中通常含抗-A1抗體，與A1紅細(xì)胞反應(yīng)，有時(shí)產(chǎn)生抗-A，與A2紅細(xì)胞反應(yīng)［17］。Ael分泌型唾液中只含H物質(zhì)。本文案例獻(xiàn)血者使用常規(guī)血型血清學(xué)檢測(cè)，正定型紅細(xì)胞與單克隆抗-A、抗-B、抗-A，B試劑均無(wú)反應(yīng)，只能通過(guò)吸收放散才能證實(shí)A抗原的存在，這是Ael的核心定義所在。另外，弱抗原吸收放散試驗(yàn)特別需要注意的是，越容易吸收到紅細(xì)胞上的抗體越難從紅細(xì)胞上放散下來(lái)。按放散液抗體的強(qiáng)度A1

弱A和弱B抗原的產(chǎn)生與分子水平的改變，如核酸替換、缺失、插入、剪切位點(diǎn)突變等相關(guān)，因此分子生物學(xué)手段，如PCR、基因測(cè)序，是鑒定ABO亞型的重要手段［19］。為進(jìn)一步明確其類型，需要進(jìn)行ABO血型基因分型和ABO基因測(cè)序分析。ABO基因的移碼、插入、缺失突變、堿基替換等可能改變ABO基因表達(dá)或糖基轉(zhuǎn)移酶活性，最終形成血型不同的亞型表型［20］。結(jié)合在ABO基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)和活性，形成A亞型或B亞型［21-22］。所有ABO抗原均源于單個(gè)ABO基因的突變，但只有3種高頻率的特殊突變會(huì)直接改變表位結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致A、B或O特異性的改變。兩種突變（替換）可改變酶的特異性，從α-3-N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶（A酶）轉(zhuǎn)變成α-3-D-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（B酶）［3］。這些糖基轉(zhuǎn)移酶類將1，3N-乙酰半乳糖胺（A）或1，3半乳糖（B）碳水化合物加至H糖鏈末端。第三種突變是指5'催化結(jié)構(gòu)區(qū)域的缺失，導(dǎo)致移碼和酶的失活，而H糖鏈未被改變［23］。不同糖類組成不同的A、B、O抗原或抗原表位。外顯子6和7是產(chǎn)生ABO亞型基因突變的主要區(qū)域，因此目前大部分基因測(cè)序局限在外顯子6和7。當(dāng)血清學(xué)結(jié)果異常而外顯子6和7測(cè)序正常時(shí)，為探索本例獻(xiàn)血者抗原減弱的原因需要檢測(cè)其他外顯子是否存在突變。對(duì)外顯子1~5進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，ABO基因在A101/O02的基礎(chǔ)上發(fā)生了239G>A的雜合突變，根據(jù)與野生型正常A的比對(duì)，該突變位于A基因5號(hào)外顯子的最后一位堿基，將導(dǎo)致ABO基因編碼蛋白的第80位氨基酸由Cys變成絡(luò)氨酸Tyr，從而導(dǎo)致A抗原的功能或活性減弱。突變引起的蛋白質(zhì)變化是ABO亞群的潛在原因［4］。但基因分型預(yù)測(cè)的血型表型最終還須結(jié)合血清學(xué)方法來(lái)驗(yàn)證，從而避免潛在的定型錯(cuò)誤。ABO亞型是由血型血清學(xué)方法結(jié)合基因型所定義，因?yàn)锳BO基因突變并不是決定紅細(xì)胞表面A、B抗原數(shù)量的唯一因素。值得注意的是，仍存在一些A變異型與以上亞型的描述不符，因此ABO亞群背后巨大的遺傳異質(zhì)性已經(jīng)非常明顯［24］。后續(xù)會(huì)進(jìn)一步對(duì)該獻(xiàn)血者的父母和子女進(jìn)行ABO血型相關(guān)檢測(cè)以證實(shí)該突變的遺傳性。

在輸血相容性檢測(cè)當(dāng)中應(yīng)特別注意患者的臨床資料，許多導(dǎo)致異常血型的原因往往都可依據(jù)臨床資料資料來(lái)排除，如年齡、移植史、用藥史、診斷、輸血史等，將血清學(xué)、基因測(cè)序、糖基轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)與Ael亞型家譜研究相結(jié)合，有助于進(jìn)一步了解A亞型的形成機(jī)制。ABO變異的分子基礎(chǔ)在不同群體中具有特定特征。涉及ABO變異的最佳輸血實(shí)踐將是基于特定人群的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)。氨基酸的變化對(duì)所編碼的蛋白質(zhì)具有不同的性質(zhì)和顯著的影響［4］。對(duì)于ABO亞型建議盡可能開展三代家系調(diào)查以確定其遺傳性，為完善中國(guó)人群ABO亞型數(shù)據(jù)庫(kù)奠定基礎(chǔ)。