王丹 盧迎宏 井海云王夢超李智慧包曉青陳文哲劉凱邢瑞星

（鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，鄭州 450007）

心肌肥厚是多種心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中共同的病理特征，心肌細(xì)胞體積增大，成纖維細(xì)胞的活化導(dǎo)致膠原、纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積是其主要的病理生理變化。心肌肥厚作為一種機體代償性改變，隨著病情的逐漸加深，會逐漸進展為失代償性心力衰竭［1］。隨著生活水平及飲食習(xí)慣的改變，高血壓患者日益增多，持續(xù)高血壓引起的慢性壓力超負(fù)荷心功能不全逐漸引起人們的關(guān)注。過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）作為核激素受體家族的成員之一，是配體激活的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)解炎癥反應(yīng)在內(nèi)的多種生物學(xué)功能［2］。有研究證實其主要通過抑制心肌炎癥反應(yīng)進而在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護效應(yīng)［3］。炎癥反應(yīng)是誘發(fā)心肌纖維化的因素之一，促炎因子分泌增多可活化心肌成纖維細(xì)胞，促進心肌細(xì)胞損傷或壞死，損傷心功能?；蛑委熓峭ㄟ^將功能明確的基因以載體導(dǎo)入病灶部位，對靶點區(qū)域部位的功能異常進行修復(fù)、補償和校正，進而恢復(fù)相關(guān)區(qū)域正常生理功能［4］。慢病毒載體作為一類使用較多的用于基因表達與治療的缺陷型載體，具有穩(wěn)定表達、較低免疫性及外源基因容量大的優(yōu)點，在心血管疾病等基因治療中廣泛應(yīng)用［5-6］。PPAR-γ作為已知參與心肌異常的心血管炎癥疾病的發(fā)展環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，為了探索PPAR-γ與壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞重塑的相關(guān)性［7］。本研究通過構(gòu)建攜帶PPAR-γ的慢病毒載體，并用該載體對壓力超負(fù)荷大鼠進行治療，觀察其對大鼠心肌纖維化的影響，以期為壓力超負(fù)荷引起的心功能不全治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級雄性6周齡SD大鼠40只，體質(zhì)量260~280 g，購于濟南金豐實驗動物有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（魯）2018-0006］，于恒溫（22±2）℃、恒濕（55±5）%，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境進行常規(guī)飼養(yǎng)。所有操作程序經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和儀器Lv-NC、Lv-PPAR-γ慢病毒載體的構(gòu)建包裝純化均委托上海吉凱生物技術(shù)有限公司完成；TRIzol提取液購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購自日本TaKaRa公司；SYBR Green Mix試劑盒購自美國LifeTech-nology公司；總蛋白RIPA裂解液購自美國ThermoFisher公司；PPAR-γ、α-滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、TGF-β、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6的PCR引物委托上海生物工程股份有限公司設(shè)計并合成；兔抗大鼠PPAR-γ、α-SMA、TGF-β、FN、iNOS、IL-10、β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司；酶標(biāo)儀、蛋白印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR擴增儀購自美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；超聲心動圖系統(tǒng)購自美國GE Health?care公司；BL-410生物機能實驗系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物的模型建立、分組及處理將40只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、Lv-NC組和Lv-PPAR-γ組，每組10只。在恒溫（22±2）℃、恒濕（55±5）%，SPF級飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，給予3 ml/kg的水合氯醛麻醉后仰面固定在操作臺，常規(guī)消毒備皮后，沿腹部中線打開腹腔，小心地將腹主動脈分離，并用直徑0.7 mm的21G針頭沿腹主動脈平行位置放置，然后用4號手術(shù)線從腹主動脈背側(cè)p穿出，將針頭與腹主動脈共同結(jié)扎后，迅速移去針頭，形成50%~70%腹主動脈縮窄，之后關(guān)閉腹腔，假手術(shù)組大鼠僅打開腹腔，不結(jié)扎手術(shù)線［8］。完成手術(shù)后3 d，Lv-NC組和Lv-PPAR-γ組大鼠分別尾靜脈注射20μl 1×109TU/ml Lv-NC、Lv-PPAR-γ，假手術(shù)組、模型組注射等量生理鹽水。常規(guī)飼養(yǎng)4周后進行相關(guān)指標(biāo)測定。

1.2.2 大鼠心功能檢測完成實驗后，將各組大鼠以三溴乙醇114 mg/kg腹腔注射麻醉后，使用超聲心動圖系統(tǒng)進行超聲心動圖檢測，從圖像中測量前壁和后壁的厚度，記錄中測量左心室舒張末期直徑（LVEDD）和左心室收縮末期直徑（LVESD），測定5個心動周期，并計算左室短軸縮短率（FS），計算公式為：FS（%）=（LVEDD-LVESD）×100/LVEDD×100%。測量完成后，大鼠取仰臥位，分離右頸部動脈，將充滿肝素的生理鹽水聚苯乙烯左心導(dǎo)管插入左心室，采用BL-410生物機能實驗系統(tǒng)檢測大鼠的心率（HR）及左心室收縮壓（LVSP）。

1.2.3 血清心肌損傷標(biāo)志物水平檢測心功能檢測完成后，腹主動脈取血，分離血清，利用ELISA試劑盒檢測血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb水平。

1.2.4 心肌組織HE染色及Masson染色稱重斷頭處死大鼠，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水將血液等沖洗干凈，置于干凈的濾紙上吸干多余水分，沿房室交界處去除左右心房，保留左心室稱量后，將心臟標(biāo)本分為2份，一部分用錫紙包裹置于液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱用于后續(xù)RT-PCR及Western blot檢測。一部分置于4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片后，按照HE試劑盒說明進行染色，顯微鏡下各組大鼠心肌組織病理改變。另取部分切片根據(jù)Masson試劑盒說明書添加染液，分化，脫水，透明，封片。在倒置熒光顯微鏡下觀察膠原沉積，并使用Image-ProPlus 6.0軟件計算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

1.2.5 RT-PCR檢測心肌組織中相關(guān)基因mRNA表達取1.2.3中保存的心肌組織樣品，按照總RNA提取試劑盒說明書上操作步驟提取總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，OD值（A260/A280）=1.8~2.0，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性。將符合要求的低mRNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系（10μl）：2×miRNA反應(yīng)混合液5μl、0.1%BSA 1μl、miRNA PrimeScript?RT酶混合物1μl、總RNA 0.5μl、去RNA酶ddH2O 2.5μl。反應(yīng)條件設(shè)置：37℃60 min，85℃5 s，4℃30 min。PCR體系10μl：SYBR?Prmix Ex TapⅡ（2×）5μl、正向引物0.4μl、反向引物0.4μl、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.2μl、cDNA 1μl、ddH2O 3μl。詳細(xì)操作見試劑盒說明書。PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：50℃激活聚合酶5 min，95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應(yīng)進行40個循環(huán)。溶解曲線繪制：95℃15 s，60℃60 s，85℃15 s，60℃15 s。每個樣孔設(shè)置3個復(fù)孔。用2-ΔΔCt法計算mRNA表達。

1.2.6 Western blot檢測心肌組織中相關(guān)蛋白表達取凍存的心肌組織于冰上研磨成粉末，加入RIPA裂解液后提取總蛋白，采用BCA法對蛋白水平進行定量，并利用Bradford調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至甲醛預(yù)處理過的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠PPAR-γ、α-SMA、TGF-β、FN、iNOS、IL-10、Actin（1∶500）一抗4℃孵育過 夜，TBST漂 洗40 min，加 入HRP標(biāo) 記 的 二 抗（1∶500）孵育1 h，TBST漂洗40 min，使用ECL試劑盒在DNR Bio Imaging System上觀察膜上蛋白條帶，收集影像，采用Image J軟件對各組條帶灰度值進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，若正態(tài)分布、方差齊，采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lv-PPAR-γ轉(zhuǎn)染效率的鑒定如圖1所示，模型組大鼠心肌組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平較假手術(shù)組均顯著降低（P<0.05）；模型組與Lv-NC組大鼠心肌組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠心肌組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平較模型組顯著升高（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平Fig.1 Expression levels of PPAR-γmRNA and protein in myocardial tissues of each group

2.2 各組大鼠心室功能指標(biāo)比較模型組大鼠HR、LVSP、FS水平較假手術(shù)組均顯著降低（P<0.05）；模型組與Lv-NC組大鼠HR、LVSP、FS水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠HR、LVSP、FS水平較模型組顯著升高（P<0.05，表1）。

表1 各組大鼠心室功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of ventricular function indexes of each group（±s，n=10）

表1 各組大鼠心室功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of ventricular function indexes of each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Sham Model Lv-NC Lv-PPAR-γ HR/（beat·min-1）411.32±30.73 212.46±21.521）215.18±22.68 334.29±38.282）LVSP/mmHg 131.66±23.29 55.72±7.171）52.19±8.54 120.13±12.272）FS（%）29.19±2.26 7.91±1.641）8.03±2.43 22.18±2.632）

2.3 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較模型組大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平較假手術(shù)組均顯著升高（P<0.05）；模型組與Lv-NC組大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠血清中CK-MB、Mb、cTnⅠ水平較模型組顯著降低（P<0.05，表2）。

表2 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison on levels of myocardial injury markers in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison on levels of myocardial injury markers in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05.

Groups Sham Model Lv-NC Lv-PPAR-γ CK-MB/（U·L-1）24.29±5.38 111.37±16.281）113.68±19.34 46.41±10.242）Mb/（ng·ml-1）22.28±4.27 125.47±23.481）126.83±19.02 58.22±7.582）cTnⅠ/（ng·ml-1）0.15±0.04 0.68±0.091）0.69±0.07 0.31±0.062）

2.4 各組大鼠左心HE染色結(jié)果比較如圖2所示，假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞、心肌纖維無異常，紋路清晰；模型組和Lv-NC組大鼠心肌纖維排列紊亂，橫紋難以辨別，可見少量心肌斷裂，核固縮；Lv-PPAR-γ組大鼠心肌排列紊亂明顯改善，可以看出橫紋，肌纖維腫脹也有所改善。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果（×400）Fig.2 HE staining results of rats myocardial tissues in each group（×400）

2.5 各組大鼠左心Masson染色結(jié)果比較如圖3所示，模型組和Lv-NC組大鼠心肌細(xì)胞可見大量藍色膠原纖維沉積，且模型組CVF水平較假手術(shù)組顯著升高（P<0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠心肌細(xì)胞膠原沉積明顯減少，心肌纖維化程度降低，且CVF水平較模型組顯著降低（P<0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（×400）Fig.3 Masson staining results of rats myocardial tissues in each group（×400）

2.6 各組大鼠心肌組織中纖維化標(biāo)志物表達水平比較如圖4所示，模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相對表達水平較假手術(shù)組均顯著升高（P<0.05）；模型組與Lv-NC組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相對表達水平較模型組顯著降低（P<0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織中纖維化標(biāo)志物mRNA及蛋白表達水平Fig.4 Expression levels of fibrosis markers mRNA and protein in myocardial tissues of each group

2.7 各組大鼠心肌組織中炎癥相關(guān)因子表達水平比較如圖5所示，模型組大鼠心肌組織中iNOS、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4 mRNA及iNOS、IL-10蛋白相對表達水平較假手術(shù)組均顯著升高（P<0.05）；模型組與Lv-NC組大鼠心肌組織中iNOS、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4 mRNA及iNOS、IL-10蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；Lv-PPAR-γ組大鼠心肌組織中iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA及iNOS蛋白相對表達較模型組顯著降低（P<0.05），IL-10、IL-4 mRNA及IL-10蛋白相對表達水平較模型組顯著升高（P<0.05）。

圖5 各組大鼠心肌組織中炎癥相關(guān)因子表達水平比較Fig.5 Comparison on expression levels of inflammationrelated factors in rats myocardial tissues of each group

3 討論

心肌肥厚是機體應(yīng)對壓力負(fù)荷過重的一種代償機制，通過增加心肌總量使得心臟收縮能力增強，進而維持心臟的正常血液循環(huán)，但由于肥大的心肌會增加耗氧量，冠狀動脈又無法提供足夠的供血，長期如此會導(dǎo)致心肌缺血，而引起代償性心力衰竭發(fā)生［9］。雖然目前諸多研究表明PPAR-γ在心肌肥厚等多種心血管疾病中發(fā)揮著重要作用［10-11］，但其具體的分子機制仍有待探索。壓力負(fù)荷性模型是心血管疾病研究的常用模型之一，其中腹主動脈縮窄是建模較為理想的一種［12］。本研究通過采用腹主動脈縮窄術(shù)構(gòu)建心室肥厚大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠心臟組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平均顯著降低，提示PPAR-γ很有可能成為治療壓力超負(fù)荷性心功能不全的有效靶標(biāo)。慢病毒載體是目前基因治療載體研究的熱點方向，其對分裂和非分裂細(xì)胞均有較高的感染能力，從而在體內(nèi)獲得長期表達，并且安全性好［13］。本研究結(jié)果顯示通過尾靜脈注射包裝完成的攜帶PPAR-γ基因的載體后，能夠顯著提高模型大鼠心肌組織中PPAR-γmRNA及蛋白表達水平，表明慢病毒介導(dǎo)的過表達可以有效提高心肌組織中PPAR-γ表達水平。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠HR、LVSP、FS水平均顯著降低，并且血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、Mb、cTnⅠ水平顯著升高，而感染Lv-PPAR-γ組大鼠HR、LVSP、FS水平均有所改善，并且CK-MB、Mb、cTnⅠ水平顯著降低，表明穩(wěn)定表達PPAR-γ能夠改善壓力超負(fù)荷大鼠左心室功能，減輕心肌損傷。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，橫紋難以辨別，可見少量心肌斷裂，核固縮，并且存在少量炎癥細(xì)胞浸潤。Masson染色結(jié)果顯示，膠原沉積顯著升高，而感染Lv-PPAR-γ后大鼠心肌排列紊亂明顯改善，橫紋及纖維腫脹也有所改善，并且膠原沉積也顯著降低。炎癥反應(yīng)在心力衰竭等心血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，而炎癥因子引起的損傷會進一步導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞的遷移及增殖，心肌組織的修復(fù)及纖維化必不可少［14］。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，也是成纖維細(xì)胞具有收縮活性的基礎(chǔ)［15］；FN則是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，前者可誘導(dǎo)膠原的形成，促進臟器纖維化［16］；TGF-β是目前研究發(fā)現(xiàn)致纖維化細(xì)胞因子中重要的一種調(diào)控因子，它能夠誘導(dǎo)α-SMA、COLIA1、Vimentin等纖維蛋白的合成，同時TGF-β還可以通過與相應(yīng)的受體相結(jié)合，刺激活化成纖維細(xì)胞，促進成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致纖維化［17-18］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相對表達水平均顯著升高，而感染Lv-PPAR-γ后α-SMA、TGF-β、FN mRNA和蛋白相對表達水平顯著降低，表明PPAR-γ可能通過抑制α-SMA、TGF-β、FN表達，從而抑制心肌組織纖維化。

iNOS是心肌組織中存在的3種類型NOS其中之一，正常情況下其表達量較低，但在病理相關(guān)刺激誘導(dǎo)下大量合成，參與機體防御反應(yīng)，但同時也具有細(xì)胞毒性作用，會引起心肌細(xì)胞損傷［19］；IL-1β、IL-6是由活化單核細(xì)胞合成的促炎癥細(xì)胞因子，能促進T、B細(xì)胞的增殖活化以及免疫球蛋白的產(chǎn)生，同時還能夠作為內(nèi)生致熱源參與炎癥反應(yīng)及促急性時相蛋白合成［20］；IL-4、IL-10則主要是由Th2細(xì)胞分泌的一類抗炎癥細(xì)胞因子，通過抑制巨噬細(xì)胞的提呈功能來降低機體的炎癥反應(yīng)［21］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織中促炎癥細(xì)胞因子iNOS、IL-1β、IL-6表達顯著升高，而抗炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-10水平也顯著升高，這主要是因機體自身調(diào)控炎癥細(xì)胞因子水平的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，從而抑制過度炎癥反應(yīng)，抗炎癥細(xì)胞因子也顯著升高。感染Lv-PPAR-γ后，心肌組織中iNOS、IL-1β、IL-6表達顯著降低，IL-4、IL-10水平顯著升高，表明PPAR-γ能夠通過抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放進而緩解超負(fù)荷大鼠各種病理表征。相關(guān)研究表明，在壓力超負(fù)荷大鼠體內(nèi)，RNA干擾NF-κB信號通路P65后可緩解壓力應(yīng)激引起的心肌損傷，而新發(fā)現(xiàn)的PPAR-γ激動劑能夠通過抑制NF-κB上游的ⅠκB激酶磷酸化來抑制NF-κB信號通路［22-23］。因此，本研究推測PPAR-γ可能通過抑制NF-κB信號通路激活，抑制下游炎癥細(xì)胞因子合成，并促進抗炎癥細(xì)胞因子合成，從而減輕對心肌細(xì)胞的炎癥損傷，并降低心肌組織內(nèi)膠原的異常沉積，進而緩解壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚與功能損傷。

綜上所述，本研究采用慢病毒介導(dǎo)的過表達PPAR-γ壓力超負(fù)荷動物模型試驗，提示心肌組織中穩(wěn)定表達PPAR-γ可緩解壓力超負(fù)荷引起的心肌肥厚與功能損傷，其機制可能與抑制炎癥細(xì)胞因子釋放，降低心肌組織內(nèi)膠原異常沉積有關(guān)。