何偉彬，林澤獲，何鵬程

［1.廣東省心血管病研究所，廣州 510010；2.廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），廣州 510010；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515000］

心血管疾病是我國(guó)乃至世界的頭號(hào)殺手，在一次心肌梗死（myocardial infarction，MI）事件中，患者可一次喪失10 億的心肌細(xì)胞［1］，盡管心肌細(xì)胞具有一定分裂增殖能力，然而成年時(shí)心肌細(xì)胞更新率只有大約1%，并且隨著年齡的增長(zhǎng)進(jìn)一步降低，這對(duì)于大面積缺血壞死的心肌細(xì)胞來(lái)說(shuō)如杯水車薪，取而代之的是纖維瘢痕組織，這將導(dǎo)致心臟功能減弱，心肌順應(yīng)性降低，最終誘發(fā)心力衰竭（heart failure，HF）。對(duì)于HF，藥物治療往往不盡如人意，尤其對(duì)于終末期的HF，心臟移植治療是目前唯一的選擇。然而目前器官供體不足限制了此項(xiàng)治療方式，因此HF 的治療亟待更多有效療法。

近年來(lái)，細(xì)胞治療成為MI 后HF 一項(xiàng)有前景的新興治療策略。既往用于細(xì)胞治療的細(xì)胞有骨骼肌母細(xì)胞、心血管祖細(xì)胞、成體干細(xì)胞，應(yīng)用這些細(xì)胞作為治療的臨床試驗(yàn)也廣泛開(kāi)展，然而其效果不盡如人意。近年來(lái)以多能干細(xì)胞（pluripotent stem cells，PSCs）為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療在心肌修復(fù)再生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得良好效果，這也使其成為心臟再生領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。

PSCs 包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），其多能性讓心肌瘢痕的重新肌肉化成為可能，這也是干細(xì)胞治療的初衷。20 余年的研究表明，盡管以其為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療短期內(nèi)改善了心功能，但是目前尚缺乏其長(zhǎng)期獲益的證據(jù)，其他的阻礙如致心律失常、免疫原性、安全性等也限制了其臨床轉(zhuǎn)化。值得注意的是，除了直接補(bǔ)充心肌細(xì)胞，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)旁分泌作用也是以PSCs為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療的重要機(jī)制。本綜述將主要分析PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療的困境以及近年來(lái)PSCs 旁分泌作用的證據(jù)及應(yīng)用可行性，以期為MI 后心衰治療提供新的視角。

1 多能干細(xì)胞為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療的發(fā)展概要及現(xiàn)狀

PSCs 包括ESCs 和iPSCs，ESCs 首先從小鼠胚胎中成功分離，之后人源性ESCs 的分離及其進(jìn)一步分化為心肌細(xì)胞相繼實(shí)現(xiàn)；而iPSC 則在2006 年由Takahashi 等利用病毒載體將4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 導(dǎo)入小鼠胚胎或成體成纖維細(xì)胞成功獲得，次年人類體細(xì)胞來(lái)源的iPSCs 也相繼產(chǎn)生。ESCs 和iPSCs 十分相似，都具有自主更新能力和多能性，且基因表達(dá)譜分析也具有高度相似性，但iPSCs 也存在一些特異的基因表達(dá)，后續(xù)的研究推測(cè)這些基因表達(dá)的差異可能來(lái)自于供體細(xì)胞的來(lái)源不同以及誘導(dǎo)方法的差異，而這些差異通常被認(rèn)為與細(xì)胞的多能性無(wú)關(guān)［2］，故兩者均可以用于心肌修復(fù)再生的細(xì)胞治療。

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

心臟細(xì)胞治療的初衷是補(bǔ)充心臟損失的心肌細(xì)胞，取代原有的瘢痕組織。1999 年Reinecke 等［3］利用大鼠胚胎或新生大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)外源心肌細(xì)胞與宿主心肌細(xì)胞可建立縫隙連接，體外的共培養(yǎng)試驗(yàn)也證明兩者可電機(jī)械耦合，這為后續(xù)的細(xì)胞治療奠定了基礎(chǔ)。之后Laake 等［4］證實(shí)了ESCs 來(lái)源的心肌細(xì)胞（embryonic stem cell derived cardiomyocytes，ESC-CMs）在移植入心臟后，可以短期改善MI 后的心功能，后續(xù)的移植實(shí)驗(yàn)也相繼在大鼠、豚鼠、豬和非人類的靈長(zhǎng)動(dòng)物中成功實(shí)現(xiàn)。與此同時(shí)，ESCs 分化產(chǎn)生的心血管前體細(xì)胞（embryonic stem cell derived cardiovascular progenitor cells，ESC-CVPCs）是細(xì)胞治療的另一種細(xì)胞，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中亦獲得了不錯(cuò)的成效。而在iPSCs 方面，由于其不僅可以避免ESCs 倫理、法律法規(guī)的一些爭(zhēng)議，還有望通過(guò)自體細(xì)胞移植避免免疫排斥的問(wèn)題，因而日漸受到重視，以iPSC 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)也漸獲突破［5］。

1.2 臨床試驗(yàn)

隨著細(xì)胞移植技術(shù)日趨成熟，以PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療也逐步轉(zhuǎn)化到臨床。在首個(gè)臨床試驗(yàn)ESCORT研究中［6］，6 名受試者在接受冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的同時(shí)，在心外膜上移植含約8 000 000 人源性的ESC-CMs 的細(xì)胞補(bǔ)片，隨訪18 個(gè)月，主要終點(diǎn)是1 年內(nèi)的安全性終點(diǎn)，重點(diǎn)關(guān)注有無(wú)：（1）心臟及心外的腫瘤；（2）心律失常事件；（3）同種異體移植免疫排斥反應(yīng)。結(jié)果顯示，除1例術(shù)后早期死于與移植無(wú)關(guān)的并發(fā)癥外，所有受試者在隨訪期間癥狀均有改善，未檢測(cè)到有腫瘤和心律失常。3 例患者出現(xiàn)了無(wú)臨床表現(xiàn)的同種異體免疫排斥反應(yīng)。第一例誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞（induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，iPSC-CMs）治療HF的人體試驗(yàn)在日本［7］（UMIN000032989）。而在Clinical Trial 上注冊(cè)的iPSC-CMs 的細(xì)胞治療的臨床試驗(yàn)，目前只有2 例，分別是德國(guó)的BioVAT-HF 試驗(yàn)（NCT04396899）和中國(guó)的HEAL-CHF試驗(yàn)（NCT03763136）。前者將招募53 例終末期的HF 受試者以評(píng)估iPSCs 衍生的工程化心肌補(bǔ)片的安全性及有效性，而后者將招募5 例MI后HF 受試者以評(píng)估心臟注射iPSC-CMs 的安全性。

圖1 以PSCs 為基礎(chǔ)的心肌再生細(xì)胞治療發(fā)展時(shí)間軸

2 以多能干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療的困境

盡管前期實(shí)驗(yàn)獲得了可喜的結(jié)果，但細(xì)胞治療要實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化還存在一些尚待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

2.1 長(zhǎng)期效益尚不明確

在一項(xiàng)代表性的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)中，Zhu等［8］使用人類PSC 來(lái)源的心血管前體細(xì)胞（human pluripo?tent stem cell-derived cardiovascular progenitor cells，hPSCCVPCs）作為移植細(xì)胞，于食蟹猴MI 后4 日后心肌內(nèi)注射入約10 000 000 hPSC-CVPCs，同時(shí)使用抗免疫排斥藥物以期減輕免疫排斥反應(yīng)，然而即便使用了三種免疫抑制劑（環(huán)孢素、甲強(qiáng)龍、巴利昔單抗），移植的細(xì)胞在28 d 后仍大幅減少并在140 d 完全消失。因此在該實(shí)驗(yàn)中，hP?SC-CVPCs 并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)心肌的再生。另一項(xiàng)hESC-CVPCs的移植實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果［9］，值得注意的是這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)使用的是免疫缺陷的裸鼠，最大限度排除了免疫排斥的影響。第一例臨床試驗(yàn)ESCORT［10］使用的也是hESCCVPCs，6 例受試者在實(shí)施冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的同時(shí)完成細(xì)胞補(bǔ)片的移植，隨訪18 個(gè)月后所有存活患者的癥狀均獲得改善，然而，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的原始設(shè)計(jì)是為了檢測(cè)細(xì)胞治療干預(yù)的安全性，故不能得出受試者從hESC-CVPCs移植中獲益的結(jié)論。此外，該試驗(yàn)沒(méi)有設(shè)置對(duì)照，很難判斷患者的癥狀改善是僅歸因于再灌注治療還是兩者的疊加作用。

細(xì)胞治療的另一種細(xì)胞是PSC-CMs，既往一系列的實(shí)驗(yàn)證明PSC-CMs 確實(shí)可部分移植至心臟組織中，在短期內(nèi)（4 周）改善心功能，然而這種作用不能持續(xù)至12 周。其中一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)［4］顯示，即使3 個(gè)月后還存在部分移植組織，心功能的改善卻沒(méi)有維持，這表明移植物的存在與心功能的改善并不存在直接因果關(guān)系，在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中甚至得出移植物的量與心功能的改善呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的結(jié)論［11］。這些結(jié)果也提示我們需要謹(jǐn)慎地看待細(xì)胞治療的遠(yuǎn)期獲益，而相關(guān)研究也應(yīng)該對(duì)心功能進(jìn)行遠(yuǎn)期隨訪，方能準(zhǔn)確評(píng)估細(xì)胞治療是否可帶來(lái)的長(zhǎng)期獲益，但遺憾的是，近期開(kāi)展的許多實(shí)驗(yàn)隨訪時(shí)間均不超過(guò)3 個(gè)月［12］。

綜上，目前仍缺乏以PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療的長(zhǎng)期效益證據(jù)，臨床轉(zhuǎn)化的時(shí)機(jī)尚未完全成熟。

2.2 劑量問(wèn)題

以PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療臨床轉(zhuǎn)化的前提是要確定最佳劑量，這與MI 面積大小、細(xì)胞本身的增殖效率以及其移植后的存活率等因素有關(guān)。臨床前試驗(yàn)使用的細(xì)胞劑量參差不齊，其中最有參考意義的大概是靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，Chong 等［13］使用了10 億hESC-CMs，分15 次，每次150 μL 注射至獼猴梗死心肌及其周圍區(qū)域，而在該團(tuán)隊(duì)的最近的一項(xiàng)研究中，則使用了75 億hESC-CMs細(xì)胞實(shí)施細(xì)胞移植。該實(shí)驗(yàn)的獼猴平均體質(zhì)量為8.6 kg，約為人類平均體質(zhì)量的九分之一，若按此比例換算，人類的細(xì)胞移植需求量估計(jì)要達(dá)到600 多億，而人類心臟肌肉細(xì)胞只有約20 億至30 億，因此根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行換算明顯不合理。目前在研究中的（HEAL-CHF 試驗(yàn)NCT03763136）使用的細(xì)胞劑量則為10 億，而該研究如何決定移植細(xì)胞的劑量也不得而知。值得注意的是，在前期的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中［14］，起始劑量的hESC-CMs 治療在4 周內(nèi)可觀察到陽(yáng)性的治療效果，而3 個(gè)月后治療效果消失，而當(dāng)使用起始劑量3 倍的劑量時(shí)，盡管移植的組織明顯增加，然而并沒(méi)有在3 個(gè)月后表現(xiàn)出獲益。這也與近期一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)［15］結(jié)果一致，盡管移植物增加，然而心功能并無(wú)改善。這提示單純通過(guò)增加移植細(xì)胞數(shù)量改善治療效果似乎并不可行，最佳的細(xì)胞移植劑量仍有待探索。

2.3 細(xì)胞移植遞送效率低下

細(xì)胞治療的長(zhǎng)期效益及劑量問(wèn)題跟細(xì)胞移植率息息相關(guān)，而細(xì)胞遞送方式是影響移植細(xì)胞存活率的關(guān)鍵因素。其主要包括心肌內(nèi)注射、冠狀動(dòng)脈或逆行冠狀靜脈內(nèi)遞送、靜脈內(nèi)注射、工程化心肌細(xì)胞補(bǔ)片等方式，這些方式都可以通過(guò)不同的優(yōu)化以提高移植細(xì)胞成功率。其中心肌內(nèi)注射被報(bào)道相較與于經(jīng)冠狀動(dòng)脈或逆行冠狀靜脈遞送具有更高的細(xì)胞移植率，然而，心肌內(nèi)注射的細(xì)胞也會(huì)在注射后幾次心臟搏動(dòng)后被靜脈系統(tǒng)從心臟中沖出［16］。而事實(shí)上，在另一項(xiàng)研究中，研究者通過(guò)18F-FDG 示蹤技術(shù)比較了冠狀動(dòng)脈和心肌內(nèi)遞送途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者在短期內(nèi)心臟細(xì)胞留存率上并無(wú)差異［17］。改良導(dǎo)管的設(shè)計(jì)或可成為提高以上遞送途徑細(xì)胞移植率的方法。鑒于以上方式的侵入性比較大，這使得靜脈內(nèi)注射成為一種更好的替代方式，除低侵入性外，靜脈內(nèi)途徑具有更高的可操作性及重復(fù)性，這從一定程度上可以解決細(xì)胞移植停留率低的問(wèn)題。然而，其主要局限性在于其靶向性低，大多數(shù)細(xì)胞在到達(dá)心臟之前會(huì)滯留在其他器官中，因此如何提高其靶向性成了靜脈注射途徑亟待解決的問(wèn)題?？赡艿慕鉀Q辦法是通過(guò)編輯改造移植細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)使其能靶向受損的心肌組織。Tang 等［18］通過(guò)在遞送心臟干細(xì)胞的膜表面耦聯(lián)血小板納米囊泡在大鼠和豬的MI 模型中增加了其靶向性及留存率。除以上方式外，近年來(lái)，通過(guò)將移植細(xì)胞結(jié)合生物材料也是提高其移植率的一種方式。這些材料主要包括一些天然材料如水凝膠、海藻酸鹽、細(xì)胞外基質(zhì)成分以及一些人工合成材料，除了其本身固有的功能外，其可通過(guò)為移植細(xì)胞提供骨架支撐、營(yíng)養(yǎng)成分以及其隔離保護(hù)功能等改善移植效果。具體的分類及作用機(jī)制不在本綜述的討論范圍。值得注意的是，這種方式通常以工程化心肌細(xì)胞補(bǔ)片的形式移植至心外膜上，這也意味著更大的侵入性。

總而言之，盡管各種遞送方式有了極大改善，然而，每種遞送方式仍然存在有待解決的問(wèn)題，通過(guò)改善遞送方式來(lái)提高細(xì)胞移植成功率仍然是以PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療一個(gè)必須跨越的障礙。

2.4 安全性問(wèn)題

以PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療的另一困境為安全性問(wèn)題，主要包括致心律失常性、致瘤性。移植相關(guān)心律失常［19］是限制PSC 細(xì)胞治療的又一巨大障礙，既往的幾項(xiàng)研究均揭示了在豬和靈長(zhǎng)類動(dòng)物移植PSC-CMs 可以誘發(fā)致命性的心律失常（室性心動(dòng)過(guò)速），這種心律失常的發(fā)生頻率通常在移植后的一至兩周達(dá)到高峰，之后逐漸減輕。Liu 等［20］和Romagnuolo 等［19］兩個(gè)團(tuán)隊(duì)探究了這種心律失常的發(fā)生機(jī)制，證實(shí)了正是移植物誘發(fā)了室性心動(dòng)過(guò)速的發(fā)生，進(jìn)一步的電生理機(jī)制研究揭示了其主要是通過(guò)局灶性的機(jī)制而不是通過(guò)大折返機(jī)制，可能的解釋是移植細(xì)胞的異質(zhì)性及不成熟性。一方面，目前移植的細(xì)胞純度還不能達(dá)到100%，假如混入了一些起搏細(xì)胞，就可能作為局灶性室性心動(dòng)過(guò)速的病理基礎(chǔ)，誘發(fā)心律失常。另一方面，盡管既往的研究揭示了宿主心肌細(xì)胞可與其接觸的移植心肌細(xì)胞建立電耦聯(lián)，但移植細(xì)胞周圍的瘢痕組織阻礙了其與宿主心肌細(xì)胞之間的電耦聯(lián)，此外，移植的細(xì)胞存在不成熟的心肌細(xì)胞，而其在形態(tài)學(xué)、代謝特征、收縮力、電生理特性及鈣離子處理能力等方面與成熟心肌細(xì)胞的明顯不同［21］，在形態(tài)學(xué)方面，非成熟的心肌細(xì)胞較成熟心肌細(xì)胞明顯較小，且缺乏完整的肌原纖維及T 型小管；在能量代謝方面，非成熟心肌的線粒體數(shù)目、結(jié)構(gòu)及分布與成熟心肌細(xì)胞明顯不同，其脂肪酸β 氧化水平也低于成熟心?。辉谑湛s力方面，非成熟心肌細(xì)胞較成熟心肌細(xì)胞有著不同的肌節(jié)長(zhǎng)度及排布，以及肌球蛋白重鏈不同亞型的比例，在電生理特性方面，非成熟的細(xì)胞具有較高的自律性及靜息電位以及較低的動(dòng)作電位時(shí)程及幅度。在鈣離子處理能力方面，非成熟心肌細(xì)胞因不完備的肌漿網(wǎng)以及T 型小管，具有較低的鈣儲(chǔ)備及興奮收縮耦聯(lián)能力。非成熟心肌細(xì)胞的這些獨(dú)特生理特征是其在移植入心臟時(shí)作為潛在的異位起搏點(diǎn)觸發(fā)心律失常的基礎(chǔ)。因此完善誘導(dǎo)PSC-CMs 成熟的技術(shù)或有助于解決其致心律失常的副作用。

近年來(lái)，誘導(dǎo)PSC-CMs 成熟的技術(shù)飛速發(fā)展，其中最直接的方法便是延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，成熟的過(guò)程主要發(fā)生在誘導(dǎo)分化后的1～4 周，然而，有研究表明長(zhǎng)期的培養(yǎng)并不足以誘導(dǎo)T 型小管的形成；電和機(jī)械的刺激也被報(bào)道可在體外誘導(dǎo)非成熟的PSC-CMs 成熟；此外，PSC-CMs 與其他細(xì)胞如心臟成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等的共培養(yǎng)也可促進(jìn)其成熟的進(jìn)程；激素處理如甲狀腺激素和糖皮質(zhì)激素也被報(bào)道可促進(jìn)hiPSC-CMs 的T 型小管的形成。更快捷高效的誘導(dǎo)PSC-CMs 成熟的方法仍然在摸索中，而目前為止，移植相關(guān)的心律失常問(wèn)題并未得到有效的解決。

PSCs 的致瘤性與其無(wú)限的自我增殖特性及多能性相關(guān)，主要表現(xiàn)為良性畸胎瘤及惡性腫瘤。未分化ESCs 在正常的心肌和MI 的區(qū)域均可形成畸胎瘤。在一項(xiàng)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的ESC-CVPCs 細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)中，以階段特異性胚胎抗原（SSEA-1）為標(biāo)記物純化的ESC-CVPCs 移植沒(méi)有發(fā)展為畸胎瘤，而未經(jīng)純化的對(duì)照組則可能在移植區(qū)發(fā)展為畸胎瘤［22］。通過(guò)識(shí)別不同譜系來(lái)源細(xì)胞的特異性標(biāo)志，是提高純化程度的主要方向之一。近期Zhang 等［23］發(fā)明的雙報(bào)告系統(tǒng)，可根據(jù)TBX5 和NKX2-5 的表達(dá)情況分離出心臟第一發(fā)生區(qū)、第二發(fā)生區(qū)、心外膜以及內(nèi)皮譜系的細(xì)胞，這種純化系統(tǒng)或許有助于純化出心腔特異性的心肌細(xì)胞亞群，為解決iPSC 的致瘤性問(wèn)題提供幫助。而惡性腫瘤方面，iPSCs 的形成過(guò)程中，諸如基因的低度甲基化、原癌基因的激活和抑制基因失活等因素均可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性，進(jìn)而誘發(fā)惡性腫瘤的產(chǎn)生［24］。盡管PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生的細(xì)胞治療研究中尚未見(jiàn)有惡性腫瘤形成的報(bào)道，但是這可能是由于實(shí)驗(yàn)本身的樣本量小和隨訪期短而未發(fā)現(xiàn)，仍不能排除其發(fā)生的可能性。

2.5 移植排斥反應(yīng)

移植排斥反應(yīng)是限制心臟再生治療的一大障礙，移植的細(xì)胞因含有不同的主要組織相容復(fù)合物（major histo?compatibility complex，MHC）會(huì)被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別為“非己”成分，激活急性期的固有免疫反應(yīng)和慢性期的適應(yīng)性免疫反應(yīng)而被宿主排斥。iPSCs 的出現(xiàn)提供了一種美好的設(shè)想：使用患者自身的體細(xì)胞分化產(chǎn)生iPSCs，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生與自身MHC 相容的移植心肌細(xì)胞。然而，要從患者自身特異性的體細(xì)胞加工成治療劑量的iPSC-CMs 至少需要6 個(gè)月［25］，這個(gè)時(shí)間點(diǎn)纖維化瘢痕和心室重構(gòu)已然形成，如何使移植的iPSCs 與宿主心肌細(xì)胞不被瘢痕隔離，成了另一個(gè)難題。而實(shí)際上，在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的薈萃分析中，同種異體和自體對(duì)缺血性心臟病的細(xì)胞治療在改善左心室射血分?jǐn)?shù)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［26］。目前主要提倡使用同種異體的iPSCs。然而在一項(xiàng)靈長(zhǎng)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究中，使用同種異體的MHC 匹配的iPSC-CMs 仍產(chǎn)生了強(qiáng)烈的宿主抗移植物反應(yīng)，必須加用免疫抑制劑才能使移植的細(xì)胞成功存活［27］，故MHC 匹配的移植反應(yīng)似乎不能解決移植物的免疫原性問(wèn)題，這在近期的一個(gè)以iPSC 為基礎(chǔ)的神經(jīng)退行性病變的細(xì)胞治療的靈長(zhǎng)類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到印證。既往研究針對(duì)免疫排斥做了各種嘗試：建立了模擬人體免疫系統(tǒng)的動(dòng)物模型，通過(guò)基因編輯人類白細(xì)胞抗原（HLA）Ⅰ和Ⅱ類分子、干預(yù)免疫細(xì)胞激活的共刺激分子或激活免疫細(xì)胞的抑制通路等減少宿主的免疫排斥反應(yīng)，值得注意的是，除了直接調(diào)控免疫反應(yīng)，近期Yoshida 等［28］利用間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的免疫調(diào)節(jié)功能，將MSCs 與iPSC-CMs 共同移植入小鼠心臟，明顯減少了免疫排斥反應(yīng)和提高了移植細(xì)胞的存活率。然而，這些方法均尚未投入臨床使用。目前臨床主流的方法還是使用免疫抑制劑，而免疫抑制劑的使用時(shí)長(zhǎng)與細(xì)胞治療的目標(biāo)密切相關(guān)。如果細(xì)胞治療的目的是使心肌瘢痕重新肌肉化，那么宿主將要接受長(zhǎng)期的免疫移植劑治療，這將增加其感染和患癌的風(fēng)險(xiǎn)。在PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化之前，有必要在移植細(xì)胞的獲益與長(zhǎng)期使用免疫抑制劑的毒副作用之間權(quán)衡其中的利弊。

3 以多能干細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療旁分泌作用

經(jīng)歷了多年的發(fā)展，以PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療陷入許多困境，其長(zhǎng)期效益證據(jù)似乎不甚充裕，最佳治療劑量有待探索，其安全性和免疫原性更是限制其臨床轉(zhuǎn)化的巨大阻力。而在其相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，旁分泌學(xué)說(shuō)近年來(lái)日益受到重視，這一學(xué)說(shuō)認(rèn)為移植的細(xì)胞是通過(guò)分泌體激活內(nèi)源性的修復(fù)通路從而改善心功能。

3.1 旁分泌作用機(jī)制證據(jù)

既往的實(shí)驗(yàn)支持旁分泌機(jī)制的證據(jù)如下：（1）移植細(xì)胞的存在與功能的改善似乎因果關(guān)系不足，即移植細(xì)胞無(wú)長(zhǎng)期存活，而心功能改善卻可持續(xù)一段時(shí)間。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中［29］，滅活的與有活性的PSC-CMs 之間在改善心功能上無(wú)明顯的差異。（2）一些細(xì)胞中的分泌體可以重現(xiàn)細(xì)胞本身的移植作用，KERVADEC 等［30］發(fā)現(xiàn)，ESC-CVPCs 與其分泌的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）具有相似的改善心功能的作用，且兩者均可激活相似的內(nèi)源性的修復(fù)基因的表達(dá)。在另一項(xiàng)研究中，研究者向兩組缺血再灌注48 h 小鼠心肌分別注射iPSC 與iPSC 分泌的EVs，兩者均表現(xiàn)為心功能改善，且囊泡組表現(xiàn)為更明顯的心功能改善［31］。（3）近年許多研究進(jìn)一步揭示了細(xì)胞分泌的EVs 對(duì)心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制。El 等［32］發(fā)現(xiàn)ESCCVPCs 分泌的EVs 富集了16 個(gè)進(jìn)化保守的與組織修復(fù)相關(guān)的微小RNA（miRNAs）；后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下移植細(xì)胞會(huì)分泌富含抑制凋亡、促進(jìn)新生血管形成等的調(diào)控分子，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。Jung 等［33］發(fā)現(xiàn)iPSC-CMs 在缺氧條件下可分泌miR-106-363 族，通過(guò)JAG1-NOTCH3-HES1 通路發(fā)揮抗凋亡及抗纖維化的作用。Wu 等［34］則發(fā)現(xiàn)ESC-CVPCs 在缺氧的條件下可分泌富含lncRNA MALAT1的EVs，以miR-497 為靶點(diǎn)抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)新生血管形成。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，iPSC-CM 的外泌體可以通過(guò)調(diào)控缺血心肌細(xì)胞自噬抑制心肌凋亡和纖維化。值得注意的是，ESC-CMs 還可通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)控MI 急性期的巨噬細(xì)胞極化，這表明ESC-CMs 治療還可通過(guò)調(diào)節(jié)局部的免疫微環(huán)境發(fā)揮修復(fù)心肌作用。在最近的一項(xiàng)研究中，Ikeda 等［35］發(fā)現(xiàn)心肌內(nèi)注射富含線粒體的iPSCCMs 外泌體可恢復(fù)心肌產(chǎn)能和線粒體生成，從而改善心功能，這從能量代謝的角度為旁分泌作用機(jī)制提供了又一新的視角。

3.2 應(yīng)用旁分泌機(jī)制的優(yōu)勢(shì)

假設(shè)細(xì)胞的分泌體與細(xì)胞移植本身同樣能達(dá)到相同的保護(hù)作用，那么單純應(yīng)用細(xì)胞分泌體將具有巨大優(yōu)勢(shì)，在應(yīng)用方面，其較易保存，可即時(shí)使用，有望通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的批量生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模應(yīng)用；在安全性方面，作為一種無(wú)細(xì)胞治療，其避免了細(xì)胞治療潛在的致心律失常性及致瘤性，具有更高的安全性；在免疫原性方面，其較細(xì)胞具有較低的免疫原性［36］，無(wú)需免疫抑制治療；此外，使用疾病和患者特異性外泌體，有利于通過(guò)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療HF。

3.3 旁分泌作用機(jī)制的運(yùn)用

旁分泌作用機(jī)制的運(yùn)用將給PSCs 細(xì)胞治療的困境提供一條潛在出路。近年來(lái)許多研究對(duì)此進(jìn)行了探索，PSCs 或其分化的細(xì)胞分泌的EVs 可通過(guò)各種途徑運(yùn)用于心臟再生修復(fù)治療。心臟直接注射是其中一種方式，Wang 等［37］發(fā)現(xiàn)，通過(guò)直接心臟內(nèi)注射iPSC-EVs 可減少小鼠心肌缺血再灌注損傷和抑制心肌細(xì)胞凋亡。盡管這種方式可以在梗死區(qū)集中大量的EVs，然而其侵入性降低了其臨床應(yīng)用的潛力。水凝膠貼片是另一種運(yùn)用途徑，Liu 等［38］將一種工程水凝膠貼片移植入MI 大鼠心臟，這種貼片可緩慢釋放iPSC-CMs 分泌的EVs，從而促進(jìn)射血分?jǐn)?shù)恢復(fù)，減少心肌細(xì)胞凋亡和梗死面積。但是通過(guò)貼片的方式移植通常需要開(kāi)胸手術(shù)，侵入性也較大，冠狀動(dòng)脈內(nèi)運(yùn)用或可減少侵入性，然而PSCs 為基礎(chǔ)的旁分泌機(jī)制通過(guò)冠狀脈內(nèi)運(yùn)用目前尚未見(jiàn)報(bào)道，而值得注意是，近日Hu 等［39］發(fā)明了一種外泌體涂層支架（exosome-eluting stents，EES），這種支架在遇到活性氧（ROS）后才會(huì)釋放外泌體，這種外泌體的智能釋放功能可避免外泌體的提前損耗。這種支架或許可成為未來(lái)旁分泌機(jī)制運(yùn)用的一種策略。此外，靜脈使用也是一項(xiàng)具有前景的運(yùn)用方式，其低侵入性將可極大提高治療的可行性，而實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸是靜脈使用EVs 的主要難題，Vandergriff 等［40］將心臟歸巢肽通過(guò)DOPE-NHS 連接體接合于外泌體膜上，增加了靜脈使用外泌體的心臟停留時(shí)間。Ciullo 等［41］則將CVPCs過(guò)表達(dá)CXCR4，進(jìn)而獲得了CXCR4 外泌體，并在缺血再灌注大鼠模型中確證了其靜脈使用時(shí)的心臟保護(hù)作用，揭示其通過(guò)提高對(duì)缺血心肌的生物利用度而改善靜脈使用的效率。此外，糖基化工程技術(shù)可以血管損傷和炎癥部位為靶點(diǎn)，或許有助于提高外泌體的靜脈運(yùn)用效率。此外，除了靜脈使用途徑，心包腔注射或許是另一項(xiàng)有前景的使用方式。近期Zhu 等［42］通過(guò)心包腔內(nèi)注射包含間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的水凝膠，明顯改善了小鼠和大鼠的MI后心功能，相對(duì)于直接心肌內(nèi)注射，這種方式更能減少局部的炎癥反應(yīng)和侵入性，此外，該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在豬身上揭示了心包腔內(nèi)注射的可行性。而近期一種心包多功能治療裝置已經(jīng)問(wèn)世［43］，這種裝置由可生物降解的彈性貼片（biodegradable elastic patch，BEP），可滲透的分層微通道網(wǎng)絡(luò)（permeable hierarchical microchannel networks，PHMs）和皮下治療劑遞送泵系統(tǒng)組成，可靶向、持續(xù)、穩(wěn)定地向心包輸送治療劑，且該裝置在豬身上的可行性已經(jīng)得到驗(yàn)證，將其與旁分泌作用機(jī)制靶分子聯(lián)合運(yùn)用令人期待。這些研究均表明旁分泌作用機(jī)制的運(yùn)用具有實(shí)際的可行性和美好的前景，可為PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生治療效果改善及臨床應(yīng)用提供新的方向。

以PSCs 為基礎(chǔ)的心臟再生細(xì)胞治療已經(jīng)發(fā)展20 余年，然而使心肌瘢痕重新肌肉化仍未完全實(shí)現(xiàn)，臨床應(yīng)用尚存在諸多困難與制約，越多越多的證據(jù)表明，既往其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的獲益是通過(guò)旁分泌機(jī)制獲得的，通過(guò)對(duì)旁分泌作用的深入研究可能有助于相關(guān)技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化，進(jìn)而為MI 后HF 的治療提供一個(gè)新的選擇。

表1 PSCs 為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療與旁分泌機(jī)制運(yùn)用比較