楊少君，周乃珍，王曉霞

（1.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，福建廈門 361004；2.廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院保健病房，福建廈門 361004）

心肌梗死等缺血性心臟病是導(dǎo)致心臟功能障礙的重要原因之一，活性氧自由基生產(chǎn)量增多可加重心肌細(xì)胞損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)可破壞心血管結(jié)構(gòu)及功能，還可引起心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而加重心肌細(xì)胞損傷，因而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)可降低心肌梗死等缺血性心臟病的發(fā)生率［1-2］。過氧化氫（H2O2）可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷，并可用于建立體外心肌損傷模型［3］。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由共價(jià)鍵結(jié)合形成的閉合環(huán)狀RNA 分子，其不易被核酸外切酶降解且穩(wěn)定存在于真核生物中，并可充當(dāng)微小RNA（micro RNA，miR）的海綿分子而發(fā)揮功能作用，研究表明，circRNA在心肌細(xì)胞損傷中表達(dá)異常，并可能參與心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程［4］。circ_0000285在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)其表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激而減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷［5］。但circ_0000285 在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未可知。通過靶基因預(yù)測(cè)顯示circ_0000285 與miR-625 存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明，miR-625在帕金森病細(xì)胞模型中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡從而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷［6］。但miR-625在心肌細(xì)胞損傷中的表達(dá)及其可能作用機(jī)制尚未可知。因此，本研究主要探討circ_0000285 是否可通過靶向調(diào)控miR-625 的表達(dá)從而參與H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H2O2購(gòu)自美國(guó)Sigma；大鼠心肌細(xì)胞H9C2 購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；丙二醛（malondialed?hyde，MDA）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧化物歧化酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；噻唑蘭（Methylthiazolyldiphe?nyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑、凋亡檢測(cè)試劑盒、胰蛋白酶購(gòu)自北京索萊寶；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone；兔抗鼠活化半胱氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate-specific protease-3，cleaved caspase-3）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-asso?ciated protein 1 light chain 3，LC3）-Ⅱ、LC3-Ⅰ抗體與二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam；細(xì)胞裂解液、BCA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物；反轉(zhuǎn)錄試劑與SYBR Primix Ex Taq檢測(cè)試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher；Lipo?fectamine2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；Trizol 試劑購(gòu)自北京全式金生物；circ_0000285小分子干擾RNA（sicirc_0000285）及其陰性對(duì)照（si-NC）、miR-625寡核苷酸模擬物（miR-625 mimics）及陰性對(duì)照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-625 特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-625）及其陰性對(duì)照（anti-miR-NC）購(gòu)自廣州銳博生物；circ_0000285 過表達(dá)載體（pcDNAcirc_0000285）及其空載體（pcDNA）購(gòu)自上海吉滿生物。

1.2 方 法

1.2.1 構(gòu)建心肌細(xì)胞氧化損傷模型 參考文獻(xiàn)［7］的方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板（3×103個(gè)/孔），加入含有200 μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理48 h，記為H2O2組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的H9C2 細(xì)胞記為Con 組。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)Lipofectamine2000 試劑盒說明書操作，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si-NC、si-cic_0000285、si-circ_0000285 與anti-miR-NC、si-circ_0000285 與anti-miR-625 分別轉(zhuǎn)染至H9C2 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后加入含有200 μmol/L H2O2培養(yǎng)基處理48 h，分別記為H2O2+si-NC 組、H2O2+si-circ_0000285 組、H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC組、H2O2+si-circ_000028 5+anti-miR-625 組。

1.2.3 細(xì)胞中circ_0000285、miR-625 的表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）進(jìn)行檢測(cè)，用Trizol 試劑提取各組H9C2 細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 合成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 次循環(huán)。circ_0000285 以GAP?DH為內(nèi)參，miR-625以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算circ_0000285、miR-625 相對(duì)表達(dá)量。circ_0000285正向引物5'-TACCTCTGCAGGCAGGAACT-3'，反向引物5'-TCACATGAATTTAGGTGGGACTT-3'；GAPDH 正向引物5'-GCCATCACAGCAACACAG?AA-3'，反向引物5'-GCCATACCAGTAAGCTTGC?C-3'；miR-625 正向引物5'-GGCTAGTTCACTCCT?CTCCTCG-3'，反向引物5'-GTGCAGGGTCCAGGT-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGC?AGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATT?TGCGT-3'。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、NO 的濃度與SOD 的活性檢測(cè) 將各組H9C2 細(xì)胞裂解后按照試劑盒說明書檢測(cè)MDA、NO 的濃度與SOD 的活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 細(xì)胞增殖檢測(cè) 各組H9C2 細(xì)胞（2×104個(gè)/mL）接種于96 孔板（100 μL/孔），于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后每孔加入MTT 溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 300 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度值（OD）并計(jì)算細(xì)胞存活率［實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%］。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 收集各組H9C2 細(xì)胞后加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞后棄上清，收集細(xì)胞沉淀后加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC后室溫避光孵育5 min，加入5 μL PI 后室溫避光孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)circ_0000285 與miR-625 的靶向關(guān)系 Circ RNA Interactome 預(yù)測(cè)顯示circ_0000285 與miR-625 存在結(jié)合位點(diǎn)，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的片段分別克隆至pmirGLO 載體得到野生型載體WT-circ_0000285、突變型載體MUTcirc_0000285，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-625 mimics 分 別 與WT-circ_0000285、MUT-circ_0000285共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將pcDNA、pcDNA-circ_0000285、si-NC、si-circ_0000285 轉(zhuǎn)染至H9C2 細(xì)胞后，采用qRT-PCR 法檢測(cè)miR-625 的表達(dá)量。

1.2.8 Western blot 檢測(cè) Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ組H9C2 細(xì)胞裂解后提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度后加入5×SDS 上樣緩沖液，于100℃水浴10 min，每孔上樣量40 μg 進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），275 mA 恒流下轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h，Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、LC3-Ⅱ（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶1 000）一抗與內(nèi)參GAPDH抗體（1∶3 000）稀釋液分別孵育PVDF 膜，4℃孵育過夜，TBST 洗膜，二抗稀釋液（1∶5 000）孵育PVDF 膜1 h（37℃），滴加ECL 顯影，應(yīng)用Image J 軟件分析各條帶灰度值并計(jì)算LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0000285 與miR-625 的表達(dá)量比較

與Con 組比較，H2O2組circ_0000285 的表達(dá)量升高（P＜0.05），miR-625 的表達(dá)量降低（P＜0.05），見表1。

表1 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0000285 與miR-625 的表達(dá)量比較 ［±s，n=9］

表1 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0000285 與miR-625 的表達(dá)量比較 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05

2.2 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Con 組比較，H2O2組MDA、NO 的濃度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05）；與H2O2+si-NC 組比較，H2O2+si-circ_0000285 組MDA、NO 的濃度降低（P＜0.05），SOD的活性升高（P＜0.05），見表2。

表2 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 ［±s，n=9］

表2 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與H2O2+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

2.3 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡及自噬的影響

與Con 組比較，H2O2組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）；與H2O2+si-NC 組 比 較，H2O2+si-circ_0000285 組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度降低（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（P＜0.05），見圖1、表3。

表3 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡及自噬的影響 ［±s，n=9］

表3 干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活力、凋亡及自噬的影響 ［±s，n=9］

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與H2O2+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

圖1 干擾circ_0000285 表達(dá)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及Western blot 法檢測(cè)Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量比較

2.4 circ_0000285與miR-625靶向調(diào)控作用的驗(yàn)證

Circ RNA Interactome 預(yù)測(cè)顯示circ_0000285 與miR-625 存在結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-circ_0000285 的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC 組比較，miR-625 組熒光素酶活性降低（P＜0.05）（見圖2B）。轉(zhuǎn)染pcDNA-circ_0000285可抑制miR-625表達(dá)，轉(zhuǎn)染si-circ_0000285 可促進(jìn)miR-625 表達(dá)（圖2C）。

圖2 circ_0000285 與miR-625 靶向調(diào)控作用的驗(yàn)證（A：Circ RNA Interactome 預(yù)測(cè)顯示circ_0000285 與miR-625 存在結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)；C：qRT-PCR 法檢測(cè)miR-625 的表達(dá)量）

2.5 抑制miR-625 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0000285表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力、凋亡及自噬的作用

與H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 組比較，H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-625 組MDA、NO 濃度升高（P＜0.05），SOD 的活性降低（P＜0.05），細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高（P＜0.05），LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P＜0.05）（圖3、表4）。

表4 抑制miR-625 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］

表4 抑制miR-625 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞活力、凋亡及自噬的作用 ［±s，n=9］

注：與H2O2+si-circ_0000285+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖3 抑制miR-625 表達(dá)后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及Western blot 法檢測(cè)cleaved caspase-3、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量比較

3 討論

CircRNA 可參與心臟肥大、心肌梗死等多種心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程，研究表明，circRNA可能作為心血管疾病診斷及治療的潛在靶點(diǎn)如，circ-HIPK2 通 過調(diào) 節(jié)miR-485-5p/ATG101 的 表 達(dá)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡和自噬［8］。circRNA ncx1 通過靶向miR-133a-3p 介導(dǎo)缺血性心肌損傷［9］。circRNA_101237 通過靶向let-7a-5p/IGF2BP3 介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷［10］。circRNA Hipk3、circMACF1 等均可參與心肌細(xì)胞損傷過程，并可能作為心血管疾病治療的潛在靶標(biāo)［11-12］。

circ_0000285通過誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑在喉癌中發(fā)揮癌基因的作用［13］。circ_0000285通過調(diào)節(jié)miR-409-3p/IGFBP3 表達(dá)從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［14］。但circ_0000285在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MDA、NO 濃度升高，SOD 的活性降低，與既往研究報(bào)道結(jié)果相似［15］，提示成功建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0000285 的表達(dá)量升高，干擾circ_0000285 表達(dá)后MDA、NO 濃度降低，SOD 的活性升高，提示干擾circ_0000285 表達(dá)可抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。LC3屬于自噬相關(guān)基因8 的同源物，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可反映自噬體數(shù)量與自噬水平高低，caspase-3是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，caspase-3 被激活后可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡［16-17］。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率和cleaved caspase-3 蛋白濃度升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，而干擾circ_0000285 表達(dá)后細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 蛋白濃度降低，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，提示干擾circ_0000285 表達(dá)可促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖而抑制心肌細(xì)胞凋亡及自噬。

本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ_0000285 可靶向結(jié)合miR-625，并可負(fù)向調(diào)控miR-625 的表達(dá)。研究表明，miR-625-5p 通過靶向AKT2 抑制人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)［18］。MiR-625-5p 通過靶向STAT3 和CaMKII 抑制心臟肥大［19］。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-625 的表達(dá)量降低，抑制其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)干擾circ_0000285 表達(dá)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖、氧化應(yīng)激、凋亡及自噬的作用，提示circ_0000285 可通過靶向調(diào)控miR-625 而抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡及自噬。

綜上所述，H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中circ_0000285的表達(dá)量升高，而miR-625 的表達(dá)量降低，干擾circ_0000285 表達(dá)可通過上調(diào)miR-625 的表達(dá)而促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖并可抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡及自噬，circ_0000285/miR-625 在缺血性心臟病發(fā)生、發(fā)展過程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可能作為缺血性心臟病診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。