王 佳，姜克東，周士進(jìn)，龔 芳

［1.荊州市第二人民醫(yī)院急診2 科，湖北荊州 434000；2.湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院（襄陽(yáng)市中心醫(yī)院）心內(nèi)科，湖北襄陽(yáng) 441021］

膿毒癥是一種全身性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致許多器官（包括心臟器官）功能障礙，嚴(yán)重膿毒癥的病死率高達(dá)20%～30%［1］。膿毒癥誘發(fā)的心肌病是膿毒癥和敗血性休克過程中普遍存在的并發(fā)癥之一。在細(xì)胞和分子水平上，炎癥、凋亡被認(rèn)為是膿毒癥和膿毒癥心肌病的關(guān)鍵病理生理現(xiàn)象［2］。因此，研究膿毒癥心肌病的詳細(xì)機(jī)制有助于探索新的治療方案。來自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)促炎和促凋亡活性，被公認(rèn)為膿毒癥中最有特征的激活劑［3］。在這項(xiàng)研究中，LPS 被用來誘發(fā)膿毒癥。越來越多的證據(jù)表明，長(zhǎng)度超過200 nt 的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）參與了膿毒癥［4］，探索lncRNA 在膿毒癥的病理生理過程中的機(jī)制可能有助于尋找有效的治療靶標(biāo)。LINC00707 在幾種疾病中異常上調(diào)，并與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)［5-6］。然而，LINC00707 在膿毒癥中的功能仍不清楚。微小RNA（microRNA，miR）是長(zhǎng)度為21-25 nt 的高度保守的非編碼RNA 分子。大量研究表明，膿毒癥中各種miR 的表達(dá)發(fā)生改變［7］。資料顯示，miR-338-3p 可抑制多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，例如結(jié)直腸癌［8］、肺癌［9］。MiR-338-3p 也被證明在急性腎損傷下調(diào)［10］。在急性腦梗死患者中，血漿miR-338-3p 濃度下調(diào)，且miR-338-3p 與C 反應(yīng)蛋白濃度負(fù)相關(guān)，其中C 反應(yīng)蛋白是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵炎癥因子［11］。但miR-338-3p 在膿毒癥發(fā)展過程中的功能需要進(jìn)一步探索。這項(xiàng)研究旨在檢查L(zhǎng)INC00707 對(duì)LPS 誘發(fā)的心肌細(xì)胞損傷的影響及其所涉及的潛在機(jī)制，以期在分子水平上為膿毒癥心肌病患者的治療提供希望。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究中包括的所有程序均已獲得荊州市第二人民醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。從參與者處獲得了書面知情同意書。于2018 年1 月至2019 年6 月，招募荊州市第二人民醫(yī)院確診收治的57 例膿毒癥患者作為研究對(duì)象。排除以下情況的患者：（1）最近3個(gè)月內(nèi)接受免疫抑制藥物治療；（2）懷孕或哺乳；（3）嚴(yán)重的慢性疾病，如心臟、肝臟、腎臟和肺部；（4）患有實(shí)體腫瘤或血液系統(tǒng)惡性腫瘤；（5）人免疫缺陷病毒感染。患者臨床基線資料基本一致。從健康檢查中心招募57 名與膿毒癥患者年齡和性別相似，沒有全身性炎癥、無膿毒癥或其他嚴(yán)重感染病史、沒有腫瘤病史或心臟和腎臟功能障礙的健康志愿者，作為健康對(duì)照。從膿毒癥患者和健康對(duì)照中采集外周血樣本2 mL，3 000 r·min-1離心10 min分離血清樣品，保存在-80℃用于RNA提取。

大鼠心肌細(xì)胞H9C2（美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked im?munosorbent assay，ELISA）試劑盒、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（美國(guó)R＆D Systems），膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色試劑盒（美國(guó)BD Biosci?ence），活化半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved-caspase-3）兔抗（美國(guó)Abcam），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國(guó)GE Health），PrimeScriptTMRT 試劑盒（日本寶日醫(yī)），SYBR GREEN qPCR Su?per Mix（美國(guó)Invitrogen），LINC00707 小干擾RNA（si-LINC00707）、陰性對(duì)照siRNA（si-NC）、miR-338-3p mimic/inhibitor（anti-miR-338-3p）、陰性對(duì)照（miR-NC/anti-miR-NC）（上海GenePharma）。

1.2 測(cè)定LINC00707 表達(dá)情況

使用Trizol 提取膿毒癥患者血清RNA。為了分析LINC00707，使用PrimeScriptTMRT 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將SYBR GREEN qPCR Super Mix 用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如下：LINC00707 正向?yàn)?'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3'，反 向 為5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'；內(nèi) 參GAPDH 正向?yàn)?'-TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，反向?yàn)?'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。使用Ap?plied Biosystems7500 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT方法計(jì)算LINC00707 的相對(duì)倍數(shù)變化。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與脂多糖損傷

H9C2細(xì)胞在含有5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中，于37℃并在補(bǔ)充有100 μg·mL-1鏈霉素、100 μg·mL-1青霉素和10%胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)。LPS損傷時(shí)，以10 μg·mL-1LPS 誘導(dǎo)24 h［12］復(fù)制膿毒癥模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

H9C2 細(xì)胞分為NC 組（對(duì)照）、LPS 組（10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-NC 組（轉(zhuǎn)染si-NC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707 組（轉(zhuǎn)染si-LINC00707+10 μg·mL-1LPS）、LPS+miR-NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+miR-338-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimic+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組（轉(zhuǎn)染si-LINC00707 與anti-miRNC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707+antimiR-338-3p 組（轉(zhuǎn)染si-LINC00707 與anti-miR-338-3p+10 μg·mL-1LPS）。使 用Lipofectamine 2000 試劑進(jìn)行上述轉(zhuǎn)染，24 h 后用10 μg·mL-1LPS誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞。

1.5 測(cè)定炎癥因子TNF-α、IL-6 的濃度

根據(jù)制造商推薦的方案，使用高靈敏度TNF-α ELISA 試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒分析H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-6 的濃度。用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 處的光密度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析炎癥因子TNF-α、IL-6 數(shù)據(jù)。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2 細(xì)胞的凋亡

處理后，收集H9C2 細(xì)胞（1×106），用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，并重懸于500 μL 1×結(jié)合緩沖液中，然后與Annexin V-FITC（5 μL）和PI（10 μL）混合，將混合物在室溫下黑暗中放置15 min，并使用Beckman Coulter 流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡分析。

1.7 Western blot檢測(cè)cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

在細(xì)胞裂解液中于4℃裂解H9C2 細(xì)胞30 min，并用二辛可寧酸法測(cè)定總蛋白。將等量的蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。接下來，將PVDF 膜與一抗和二抗一起孵育。本研究中使用的一抗和二抗包括抗cleaved-caspase-3（1∶1 000 稀釋度）和IgG-HRP 二抗（1∶10 000 稀釋度）。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin；1∶1 000 稀釋度）用作上樣對(duì)照。最后，使用電化學(xué)發(fā)光溶液探測(cè)PVDF膜。通過Quantity One 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量和分析。

1.8 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析LINC00707 對(duì)miR-338-3p 的靶向調(diào)控

Stabase 軟件用于LINC00707 和miR-338-3p 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)。構(gòu)建含有miR-338-3p 結(jié)合位點(diǎn)的LINC00707-野生型（wild type，WT）及突變型（mutant type，MUT）片段，并將其克隆到psi-CHECK2載體中，分別命名為L(zhǎng)INC00707-WT和LINC00707-MUT。使用Lipofectamine 2 000試劑在H9C2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimic 或miR-NC 和LINC00707-WT 及MUT 報(bào)告基因載體。使用Promega 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定48 h 后H9C2 細(xì)胞的海腎和螢火蟲的螢光素酶活性比。另轉(zhuǎn)染pcD?NA-LINC00707、pcDNA、si-LINC00707 和si-NC 于H9C2 細(xì)胞中，記為L(zhǎng)INC00707 組、pcDNA 組、si-LINC00707 組 和si-NC 組，48 h 以qRT-PCR 測(cè) 定LINC00707 和miR-338-3p 表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

在SPSS 22.0 軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異通過單因素方差分析進(jìn)行，組間兩兩差異通過SNK-q檢測(cè)進(jìn)行。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥患者血清LINC00707 表達(dá)情況

57 例膿毒癥患者血清LINC00707 表達(dá)水平（2.14±0.25）比健康對(duì)照（1.00±0.13）增加了1.14 倍左右（t=30.544，P＜0.05）。

2.2 LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞LINC00707 表達(dá)情況

在10 μg·mL-1LPS 誘 導(dǎo) 的H9C2 細(xì) 胞 中，LINC00707 表達(dá)水平（1.93±0.15）比對(duì)照NC（1.00±0.07）增加0.93 倍左右（t=16.855，P＜0.05）。

2.3 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)

LPS 組H9C2 細(xì) 胞 中LINC00707 表 達(dá) 水 平、TNF-α、IL-6 的濃度高于NC 組，并且cleaved-cas?pase-3 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率也高于NC 組（P＜0.05）。H9C2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-LINC00707 后，LPS+si-LINC00707組LINC00707表達(dá)水平、TNF-α、IL-6的濃度以及cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均低于LPS+si-NC 組（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá) ［n=9，±s］

表1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá) ［n=9，±s］

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

圖1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平（A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2 細(xì)胞的凋亡；B：Western blot 檢測(cè)cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)）

2.4 LINC00707 靶向miR-338-3p，調(diào)控miR-338-3p 的表達(dá)

Stabase 軟件中預(yù)測(cè)的LINC00707 和miR-338-3p 靶向結(jié)合位點(diǎn)見圖2。MiR-338-3p 組轉(zhuǎn)染LINC00707-WT的H9C2細(xì)胞熒光素酶活性比miRNC組減少了0.58倍左右（P＜0.05），轉(zhuǎn)染LINC00707-MUT 的H9C2 細(xì)胞熒光素酶活性在miR-338-3p組與miR-NC 組之間無明顯差異（P=0.492），見表2。LINC00707 組H9C2 細(xì) 胞 的LINC00707 表 達(dá) 水 平（2.43±0.15）比pcDNA 組（1.00±0.08）增加，miR-338-3p 表達(dá)水平（0.45±0.03）比pcDNA 組（1.00±0.10）減少（P＜0.05），si-LINC00707 組H9C2 細(xì)胞的LINC00707 表達(dá)水平（0.34±0.01）比si-NC 組（1.02±0.09）減少（P＜0.05），miR-338-3p 表達(dá)水平（1.91±0.14）比si-NC 組（0.99±0.07）增加（P＜0.05）。

表2 miR-NC 或miR-338-3p mimic 與LINC00707 報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè) ［n=9，±s］

表2 miR-NC 或miR-338-3p mimic 與LINC00707 報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H9C2 細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè) ［n=9，±s］

注：與miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖2 Stabase 對(duì)LINC00707 和miR-338-3p 結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖

2.5 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)

H9C2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimc 后，LPS+miR-338-3p 組miR-338-3p 表達(dá)水平高于LPS+miR-NC 組，TNF-α、IL-6 的濃度以及cleaved-cas?pase-3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均低于LPS+miR-NC 組（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和cleaved-caspase-3 的蛋白表達(dá)（A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2細(xì)胞的凋亡；B：Western blot 檢測(cè)cleaved-caspase-3 蛋白的表達(dá)）

表3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá) ［n=9，±s］

表3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá) ［n=9，±s］

注：與LPS+miR-NC 組比較，*P＜0.05

2.6 anti-miR-338-3p 逆 轉(zhuǎn)si-LINC00707 對(duì)LPS處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響

H9C2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-LINC00707 與anti-miR-338-3p 后，LPS+si-LINC00707+anti-miR-338-3p 組miR-338-3p 表達(dá)水平低于LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組，TNF-α、IL-6 的濃度以及cleavedcaspase-3 蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均高于LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組（P＜0.05），見表4、圖4。

表4 anti-miR-338-3p 可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00707 對(duì)LPS 處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響 ［n=9，±s］

表4 anti-miR-338-3p 可以逆轉(zhuǎn)si-LINC00707 對(duì)LPS 處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響 ［n=9，±s］

注：與LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖4 anti-miR-338-3p 逆轉(zhuǎn)si-LINC00707 對(duì)LPS 處理的H9C2 凋亡和cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)（A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)H9C2 細(xì)胞的凋亡；B：Western blot 檢測(cè)cleaved-cas?pase-3 蛋白的表達(dá)）

3 討論

目前認(rèn)為膿毒癥中的心肌損傷機(jī)制與炎性因子密切相關(guān)。革蘭氏陰性細(xì)菌是引起膿毒癥的主要病原體。這些細(xì)菌細(xì)胞壁中的LPS 是脂質(zhì)和多糖復(fù)合物，可以激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起許多病理生理變化，包括釋放大量促炎因子，例如TNF-α 和IL-6［13］。研究顯示，LPS 可通過升高心肌組織中TNF-α、IL-6 的濃度來加重膿毒癥小鼠的心臟功能障礙或H9C2 細(xì)胞的體外損傷［14］。此外，凋亡是膿毒癥和敗血性心臟病的關(guān)鍵原因［15］。本研究在LPS 刺激的H9C2 細(xì)胞模型中進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LPS 治療可誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞中TNF-α、IL-6 的表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡率和凋亡執(zhí)行蛋白cleavedcaspase-3 表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和炎癥損傷，與前人研究［13，16］吻合。

本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清和LPS 誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中LINC00707上調(diào)，因此推測(cè)LINC00707在膿毒癥中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，LINC00707調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等［17-18］。根據(jù)報(bào)道，在LPS 處理的神經(jīng)細(xì)胞PC-12 中，LINC00707 表達(dá)上調(diào)，LINC00707 的抑制通過靶向miR-30a-5p 減輕LPS 誘導(dǎo)的PC-12 細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡，具體表現(xiàn)為抑制LINC00707 降低IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度，并抑制細(xì)胞凋亡［5］。在LPS 處 理 的MRC-5 細(xì) 胞 中，LINC00707 升 高，LINC00707 的敲低通過充當(dāng)miR-223-5p 的海綿減輕MRC-5 細(xì)胞中LPS 觸 發(fā) 的 損 傷［6］。但 是，LINC00707 對(duì)膿毒癥心肌病炎癥和凋亡的作用仍不清楚。轉(zhuǎn)染si-LINC00707 敲減LINC00707 后，LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中TNF-α 及IL-6 的濃 度、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)和凋亡率均降低，提示敲減LINC00707 減輕了LPS 誘導(dǎo)的炎癥和H9C2細(xì)胞凋亡，與前述報(bào)告類似。這些結(jié)果表明敲減LINC00707 在LPS 處理的H9C2 細(xì)胞中具有抗凋亡和抗炎作用。

此外，本研究還評(píng)估了LINC00707對(duì)LPS處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥發(fā)揮作用的潛在分子機(jī)制。lncRNA 可以充當(dāng)miRNA 的分子海綿，并起競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA 的作用［19］。在結(jié)直腸癌中，LINC00707 通過使miR-206 變海綿促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移［20］。本實(shí)驗(yàn)的機(jī)理研究表明，通過Stabase 和雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)分析，miR-338-3p 是LINC00707 的靶標(biāo)。MiR-338-3p 在消炎中起重要作用，在LPS 處理的16HBE 細(xì)胞中，miR-338-3p 被下調(diào)，miR-338-3p過表達(dá)減弱了LPS 誘導(dǎo)的16HBE 細(xì)胞炎性損傷［21］。在心肌梗死中，H9C2 細(xì)胞與過表達(dá)miR-338 的外泌體共培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞凋亡率降低，caspase3熒光強(qiáng)度增加［22］。此外，miR-338 被鑒定為心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的自噬和自噬細(xì)胞死亡的新型抑制劑［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00707 與miR-338-3p 靶向結(jié)合，并負(fù)調(diào)控miR-338-3p 表達(dá)。miR-338-3p mimc 降低LPS 誘導(dǎo)的H9C2 細(xì)胞中TNF-α 及IL-6 的濃度、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡。另外，si-LINC00707 抑制LPS處理的H9C2 細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的效果被anti-miR-338-3p 所逆轉(zhuǎn)，這表明敲減LINC00707通過上調(diào)miR-338-3p 來抑制LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥。

綜上所述，本研究證明了LINC00707 在膿毒癥患者血清和LPS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中高表達(dá)，敲減LINC00707 通過靶向miR-338-3p 來治療LPS 引起的心肌細(xì)胞炎性損傷和細(xì)胞凋亡，這可能為膿毒癥心肌病的治療鋪平了道路。