閆星，劉山梅，劉長宏*

經(jīng)過幾十年的相關探索，肺癌患者的管理方法發(fā)生了深刻變革?？梢悦鞔_的是，疾病監(jiān)測是治療成功的基礎，目前在肺癌的臨床診療過程中因復發(fā)導致術后患者死亡的百分比仍然很高（2年內(nèi)ⅠB期患者復發(fā)率為45%、ⅢA期患者復發(fā)率高達76%）［1］。因此作為腫瘤復發(fā)的“罪魁禍首”——微小殘留疾?。∕RD）越來越受到臨床重視。MRD是指經(jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學或?qū)嶒炇覚z查不能發(fā)現(xiàn)，通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的癌來源分子異常，代表惡性腫瘤的持續(xù)存在和臨床進展可能［2］。在TRACERx研究中［3］，經(jīng)液體活檢分析證實99%以上沒有復發(fā)的非小細胞肺癌患者MRD陰性，并且發(fā)現(xiàn)在通過標準成像檢測到疾病之前復發(fā)的患者中可以檢測到MRD。目前檢測MRD的新興手段之一便是液體活檢，通過分析血液及其他體液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、 循 環(huán)腫 瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌體等來源于實體瘤的生物標志物監(jiān)測腫瘤進展，可為后續(xù)治療提供臨床決策。液體活檢不同于組織活檢的是可以多次、連續(xù)進行識別腫瘤驅(qū)動突變、跟蹤腫瘤演變和監(jiān)測疾病復發(fā)的無創(chuàng)操作，且操作方式更加便捷，能夠動態(tài)反饋疾病的進展，相關報道稱液體活檢可使患者避免約5%與CT引導肺組織活檢相關的主要并發(fā)癥［4］。同時液體活檢可以完全反映腫瘤的異質(zhì)性，為患者術后進行個體化靶向治療、改善預后提供更多機會。本文綜述了幾種熱點液體（外周血、尿液、唾液、痰液、胸腔積液）標本在肺癌MRD檢測中的進展，并探討多元化液體活檢標本分析指導肺癌MRD精準治療的應用價值，期待其成為未來指導臨床決策并改善患者預后的一條嶄新道路。

1 肺癌MRD液體活檢的優(yōu)勢及挑戰(zhàn)

傳統(tǒng)檢查（包括組織活檢、影像學、生化指標等常規(guī)檢查）一直在肺癌的發(fā)生、發(fā)展監(jiān)測及治療過程中起著重要作用，在液體活檢應用于臨床之前其是包括原發(fā)性肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤病理診斷、分期和治療決策的“金標準”。然而，傳統(tǒng)檢查受限于操作與時效性而難以真正推動肺癌MRD監(jiān)測的發(fā)展。液體活檢的優(yōu)勢在于，首先相對于組織活檢其是一種非侵入性操作，患者的體液可以很容易地重復取樣，這使得在治療過程中可以通過連續(xù)取樣來監(jiān)測腫瘤特征（“實時活檢”），同時打破了其腫瘤異質(zhì)性的取樣局限。ROTHWELL等［5］的一項研究發(fā)現(xiàn)，39例晚期實體瘤患者的循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）和患者相應腫瘤組織DNA的高通量測序（NGS）顯示，在腫瘤組織中未檢測到的突變是來自血漿樣本的30%；其次，液體活檢相對于常規(guī)檢測具有時間優(yōu)越性及較高的特異度。TRACERx研究發(fā)現(xiàn)［3］，術后ctDNA預測肺癌患者36個月復發(fā)的靈敏度為48%，特異度為100%；且ctDNA檢測和影像學復發(fā)之間的中位時間為167 d，而癌胚抗原（CEA）升高和影像學復發(fā)之間的中位時間為61 d，相比較液體活檢縮短了臨床診斷復發(fā)間隔時間，爭取了復發(fā)前治療優(yōu)勢。有趣的是一份報告描述了1例ⅡB期非小細胞肺癌患者接受了放射治療且影像學檢查顯示有殘留腫塊，盡管該患者在治療后沒有檢測到ctDNA，但根據(jù)ctDNA連續(xù)監(jiān)測，該患者在治療22個月后被視為無病狀態(tài)［6］，事后來看，該腫塊代表輻射誘導的炎癥變化，這也引起了業(yè)界對影像學篩查導致假陽性率過高以及輻射風險的關注。然而，液體活檢要想進一步在臨床應用中大有作為仍存在一些挑戰(zhàn)，例如克隆性造血（cloning of hematopoietic，CH），在沒有已知驅(qū)動突變的情況下，隨著非小細胞肺癌患者年齡增長，通過cfDNA檢測到造血干細胞在造血的隨機過程中可能獲得突變，而大多數(shù)JAK2突變和部分TP53突變可能是由于CH，這就使得樣本中CH相關突變的檢測可能被錯誤地解釋為腫瘤切除后MRD的指示。研究者目前正在采用各種方法從真正的腫瘤DNA衍生突變中篩選出CH相關突變。最直接的方法是對有核白細胞進行深度測序（CAPP-Seq）以識別克隆性造血突變，并將其從樣本中排除［7］。雖然該方法在技術上可行且操作簡單，但其卻將成本翻了一番。其他如基因片段太小、t1/2短以及隨著治療效果顯現(xiàn)，腫瘤DNA比例會大幅度下降等。鑒于檢測成本較高及缺乏分析方法共識，目前液體活檢仍不能完全替代傳統(tǒng)檢查，但作為后者的輔助檢測手段，未來的研究必定需要將兩者更好地結(jié)合起來，監(jiān)測與評估MRD狀態(tài)，進而完善肺癌患者術后個體化治療。不同液體活檢的比較見表1。

表1 不同液體活檢比較Table 1 Comparison of five types of body fluid biopsies

2 體液標本活檢

2.1 外周血 從早期至晚期肺癌，隨著實體瘤的進展、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等，大量的腫瘤細胞及其衍生物會進入外周血液循環(huán)中，在影像學檢查和血清學檢查發(fā)現(xiàn)之前其是準確、可靠地識別MRD并指導后續(xù)治療決策的標本。采集血液檢查比活組織檢查具有更小的侵入性，這使其易于獲取，并允許對癌癥進行近實時監(jiān)測。外周血樣本中主要活檢對象包括CTC、ctDNA以及外泌體等，特征比較見表2。目前國內(nèi)外大量臨床試驗以及分析處理的方法已基本達成共識，使得上述對象在以血液為載體的基礎上進行活檢成為目前最常用的方法。而某些特定體液中的腫瘤細胞及其衍生物因無法如同全身循環(huán)的血液那樣反映癌癥轉(zhuǎn)移的具體情況，在臨床實際應用中尚處于探索階段。此外，相比于血液，其他體液有著更加復雜的微生物環(huán)境，微生物自身及其代謝物會對檢測結(jié)果造成難以預測的影響。目前血液活檢技術可根據(jù)其基因組覆蓋范圍進行分類，從靶向等位基因特異性聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）到NGS技術，如雜交捕獲NGS、全外顯子組測序和全基因組測序。所有檢測方法共同面臨的問題包括血漿ctDNA含量低、正常（非腫瘤）細胞產(chǎn)生的cfDNA背景豐富以及發(fā)現(xiàn)的基因變異來源不確定，但隨著技術的進步，使用個性化的基因測序跟蹤更多的突變可以提高這些平臺在檢測低容量MRD時的靈敏度。

表2 外周血中三種常見活檢對象比較Table 2 Comparison of three common liquid biopsy biomarkers in peripheral blood

2.1.1 CTC 是指從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落、發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化進入患者外周血血液循環(huán)的惡性腫瘤細胞［8］。腫瘤復發(fā)需要許多病理生理級聯(lián)反應，在這些癌癥擴展、生長和轉(zhuǎn)移的基本過程中，CTC可能參與了轉(zhuǎn)移這一重要階段。CTC是血管中一種極其罕見的細胞，外周血液中的數(shù)量非常少（1 ml全血中僅含有1～10個CTC）［9］，從文獻回顧來看，絕大部分肺癌患者中均可發(fā)現(xiàn)CTC［10］。對于早期肺癌，可從外周血中檢測到甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（TTF-1）陽性CTC，并與不良預后和更短的進展期相關［11］。對于經(jīng)證實有遠處轉(zhuǎn)移或復發(fā)的肺癌患者，CTC數(shù)量越多，預后越差，并且LINDSAY等［12］的報告指出CTC將是晚期非小細胞肺癌無進展生存率（PFS）和總生存率（OS）的獨立預后指標。因此，CTC可作為肺癌患者的一種動態(tài)監(jiān)測工具來觀察治療前后腫瘤動力學的變化。在上述文獻回顧的研究中，26例患者早期肺癌術前和術后第0天、第1天和第3天進行CTC檢測，發(fā)現(xiàn)復發(fā)肺癌患者CTC計數(shù)的下降斜率較低，而無復發(fā)患者的CTC下降斜率較高。對于有肺轉(zhuǎn)移的肺外惡性腫瘤，腫瘤切除后CTC下降，術后第3天CTC反彈至更高水平，即使在影像學上可見病變已完全切除。表示CTC可以作為MRD檢測的一種工具，并且可以預測治愈性術后幾個月的復發(fā)情況。

2.1.2 ctDNA 定義為腫瘤細胞脫落到體循環(huán)中的短DNA序列，來源于死亡CTC的分解產(chǎn)物或腫瘤細胞的活性分泌，是cfDNA片段中的一小部分，盡管比例不到1%但測序技術的進步已經(jīng)可以滿足檢測與腫瘤生物學相關的突變和染色體改變［13］，且ctDNA的t1/2約為2 h，比其他腫瘤標記物的t1/2更短［14］。在肺癌發(fā)展過程中，肺腫瘤組織可能獲得一系列體細胞突變。某些突變?nèi)鏓GFR T790M會產(chǎn)生耐藥性，并影響患者的總體生存率。2016年美國食品和藥物管理局（FDA）批準cobas EGFR突變試驗V2［15］作為在肺癌中使用ctDNA檢測MRD的第1次液體活檢試驗。因ctDNA檢測隱匿性癌癥和動態(tài)追蹤腫瘤特異性突變的潛在能力，連續(xù)血漿樣本中跟蹤檢測腫瘤基因突變已經(jīng)用于晚期非小細胞肺癌患者的臨床決策［16］。另一方面術后ctDNA與患者后期復發(fā)率呈正相關，在一項包含230例肺癌患者術后的研究中［17］，研究者通過血漿樣本中相對于健康對照組中最高突變等位基因分數(shù)（MAF）量化的ctDNA確定了ctDNA陽性和陰性患者術后無復發(fā)生存率（RFS）的顯著差異，且認為術后ctDNA狀態(tài)對RFS的影響大于任何單個臨床病理風險因素或任何因素組合，術后靈敏度、特異度皆高于其他檢測手段。目前克隆性造血和組織活檢之間的基因組差異性仍是ctDNA檢測存在的明顯局限性，但隨著NGS及數(shù)字PCR（dPCR）等技術的進步，ctDNA檢測的靈敏度也在逐漸提高。

2.1.3 外泌體 JOHNSTONE等［18］在研究網(wǎng)織紅細胞的成熟過程時首次發(fā)現(xiàn)并命名外泌體。外泌體是一種球形囊泡，直徑為40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/ml，其內(nèi)主要核酸包含microRNA（miRNA）、tRNA和長非編碼RNA（lncRNA），以及大量片段化的信使RNA（mRNA）。外泌體的分離方法主要有基于物理（如大小、密度和分子量）特性、沉淀、微流體、免疫親和捕獲的技術，目前超速離心和商用試劑盒提取法是分離外泌體最廣泛使用的常規(guī)方法［19］。盡管所有類型的細胞會釋放出外泌體，但腫瘤細胞中的外泌體非常豐富。研究表明腫瘤細胞源性外泌體在腫瘤生物學過程中起著重要作用，其負責促進受體細胞的血管生成、侵襲和增殖，通過將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到肺癌微環(huán)境中的靶細胞參與肺癌的形成和進展［20］。癌細胞外泌體包含多種與癌癥相關的蛋白質(zhì)，例如表皮生長因子受體（EGFR）是肺癌外泌體中的主要膜結(jié)合蛋白，從肺癌細胞中提取的外泌體中約有80%呈EGFR陽性［21］，而腫瘤源性外泌體衍生的miRNA也可能是影響非小細胞肺癌患者生存率的獨立預測因子［22］。RABINOWITS等［23］評估了血漿樣本循環(huán)腫瘤外泌體水平對27例肺腺癌患者和9例健康對照的診斷和預后潛力，發(fā)現(xiàn)腺癌患者的外泌體水平（平均2.85 mg/ml）、外泌體miRNA濃度（158.6 ng/ml）均高于健康對照（平均0.77 mg/ml、68.1 ng/ml）。

2.2 唾液 唾液由唾液腺中的腺泡細胞產(chǎn)生，腺泡細胞具有很高的滲透性，且周圍有豐富的毛細血管，使血液中的分子能夠與相鄰唾液細胞中的分子自由交換［24］，目前血液中大約40%的腫瘤標志物也可以在唾液中找到［25］。加之唾液的收集速度快、簡單、便宜、無創(chuàng)，表明唾液可以被視為一種理想的液體活檢標本。GU等［26］首次將血漿CTC和唾液mRNA生物標志物聯(lián)合應用于非小細胞肺癌的無創(chuàng)檢測，在區(qū)分早期肺癌患者和健康對照組的研究中其靈敏度和特異度分別高達92.1%和92.9%。非小細胞肺癌患者和健康人群之間唾液cfDNA的定量或濃度無顯著差異［27］。然而，血漿cfDNA和唾液cfDNA之間EGFR突變的一致性為83.78%，scfDNA能夠作為基因突變的補充［28］。EGFR是一種在NSCLC中頻繁表達的膜受體，其影響NSCLC細胞的增殖、血管生成和MRD復發(fā)及化療耐藥性，并促進NSCLC細胞的轉(zhuǎn)移［29］。頻繁對術后肺癌患者進行血液活檢監(jiān)測EGFR突變是不切實際的，而唾液活檢恰可以為肺癌MRD提供另一個有希望的診斷補充。加州大學洛杉磯分校（UCLA）牙科學院開發(fā)的電場誘導釋放和測量（EFIRM）技術可以檢測肺癌患者體液中表皮生長因子受體（EGFR）突變。LI等［30］在13例非小細胞肺癌患者唾液樣本中利用上述技術檢測到循環(huán)腫瘤DNA（sctDNA）EGFR突變，靈敏度為100%。另一些腫瘤生物化學指標與肺癌患者的生存率顯著相關［31］，例如咪唑化合物（ICs）濃度和唾液乳酸脫氫酶（LDH）活性，這兩個參數(shù)的組合被用作評估肺癌預后及存活率更為有效。對于預后良好（ICs<0.311 mmol/L和LDH>1 133 U/L）的患者，1年、3年和5年生存率比預后不良的患者均高2倍。而C反應蛋白（CRP）水平可能也會隨著腫瘤大小和區(qū)域轉(zhuǎn)移而升高。

2.3 尿液 經(jīng)治療后MRD血漿中ctDNA和CTC的含量較低，在連續(xù)監(jiān)測病灶進展過程中需要提取相對大容量的血液，盡管是微創(chuàng)但患者仍然會感覺到不適。研究表明外周血中的cfDNA能夠通過腎屏障并經(jīng)過尿液排泄［32］，CHEN等［33］對非小細胞肺癌患者匹配的3 ml外周血和8 ml尿液樣本共計150份進行分析，從中獲得的cfDNA數(shù)量沒有統(tǒng)計學差異。且尿液易于儲存和運輸，更易于提取大容量樣本，從尿液樣本中獲取關鍵疾病信息的可能性為補充傳統(tǒng)的腫瘤取樣方法提供了更多選擇。MRD陽性意味著癌癥治療后血液中可檢測到來自腫瘤的DNA，那么尿液中檢測到的DNA水平也可以類似地指示腫瘤負擔相關性。在先前的報道中利用尿液DNA追蹤腫瘤特異性突變并針對耐藥性給予個體化治療，臨床應用被證明適用于晚期非小細胞肺癌患者［34］。LI等［35］發(fā)現(xiàn)治療后可檢測到尿ctDNA的存在與肺癌患者的疾病復發(fā)明顯相關，尿ctDNA檢測不到的患者有較好的無病生存率，可檢測到ctDNA的患者3、6和9個月復發(fā)概率對應為15.6%、6.6%和5.1%。表明尿ctDNA對疾病復發(fā)風險有一定的前瞻性，尤其是對突變DNA檢測不到的患者進行甄別具有良好的臨床實用性。LEE等［36］指出在治療后階段EGFR突變持續(xù)陽性的NSCLC患者可能存在殘余病灶，需要進一步治療或加強疾病復發(fā)監(jiān)測。特別是T790M突變與疾病進展時間縮短和總體生存率降低密切相關。CHEN等［33］對150例非小細胞肺癌患者分組后發(fā)現(xiàn)，尿液DNAT790M陽性組患者的總體生存結(jié)果明顯最差，中位生存率為30個月，T790M陰性組的中位生存率為34個月，進一步驗證了尿液DNA在治療后患者風險分層和疾病監(jiān)測中的臨床實用性。

2.4 痰液 美國國家癌癥研究所（NCI）［37］進行了一項肺癌的低劑量螺旋計算機斷層掃描和痰細胞學雙重篩查研究，雙重篩查診斷的90例患者中有18例（20%）痰標本呈癌癥陽性，但影像學檢查呈陰性，表明痰液在診斷臨床上處于緩解期或隱匿期的癌癥相比較影像學具有時間優(yōu)越性，但因為大多數(shù)肺癌患者痰液樣本量較少，致使其包含的腫瘤細胞數(shù)量有限，加之痰液中的黏性黏液成分使得腫瘤源性的DNA提取更加困難。這也是液體活檢相對較少使用痰液的原因之一。WANG等［38］制備了一種無甲醇黏液溶解溶液（MS2）改進從痰中分離腫瘤源性cfDNA，實驗證明經(jīng)治療后患者的痰標本中利用MS2提取的cfDNA檢測EGFR突變的靈敏度顯著高于經(jīng)MS1（傳統(tǒng)的含甲醇的黏液溶解溶液）分離的同一隊列痰標本，并在一項包括102例肺腺癌患者的研究中，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術對痰cfDNA檢測后發(fā)現(xiàn)，30例患者（29.4%）的EGFR突變狀態(tài)呈陽性，總體靈敏度和特異度分別為46.2%和100.0%。MAO等［39］在肺癌患者臨床診斷之前發(fā)現(xiàn)10例原發(fā)腫瘤中有8例患者的痰液樣本中檢測到K-ras突變和p53突變，這對提高腫瘤基因分型和腫瘤靶向精準治療、發(fā)展圍術期個體化治療具有重要意義。研究證明miRNAs、mir-21和mir-155的過度表達是腫瘤切除后患者復發(fā)、預后及總體生存率的負面因素［40］。而痰液含有來自肺部和下呼吸道的支氣管上皮細胞，痰液環(huán)境下miRNA對RNase活性具有抗性，能顯著地以穩(wěn)定形式存在，并且在儲存長達7 d的痰液樣本中也可檢測到［41］。LIAO等［42］發(fā)現(xiàn)痰樣本中miRNA組可以檢測NSCLC，具有顯著的靈敏度和特異度。來自較小氣道的腺癌很難通過支氣管鏡或痰細胞學檢查發(fā)現(xiàn)，痰中miRNA的表達將為肺癌的MRD監(jiān)測提供一種高準確率的特異性標志物。并在無創(chuàng)的基礎上對患者起到早診斷、早治療的作用。

2.5 胸腔積液 惡性胸腔積液（MPE）是中晚期肺癌的一種常見并發(fā)癥，是淋巴腺被腫瘤阻塞，組織液滲出積聚于胸膜腔內(nèi)，與患者腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移顯著相關。與組織活檢等其他侵入性技術相比，MPE非常容易收集。此外，與手術切除標本相比，肺癌相關MPE患者的突變率要高得多［43］。胸腔積液活檢標本的生物標志物可能來自多個腫瘤克隆，因此其可以同時反映腫瘤以及播散性病變的異質(zhì)性。同時足夠來源的MPE為獲得評估腫瘤基因組學提供了一個豐富的機會［44］。MPE的分子分析代表了一種檢測腫瘤驅(qū)動基因突變的微創(chuàng)方法，尤其是當腫瘤組織不可用時，其可用于臨床決策。MPE可能是提供EGFR等基因突變狀態(tài)有用信息的替代來源。如果EGFR基因突變檢測可以通過更多可獲得的胸腔積液樣本實現(xiàn)，將有利于探索MRD在驅(qū)動基因陽性和驅(qū)動基因陰性兩種類型患者中的作用，并進一步探討耐藥機制，以及評估能否在影像學之前識別耐藥的優(yōu)越樣本。晚期非小細胞肺癌患者的靶向藥物治療也將成為可能，這將具有重要的臨床和實用價值。

2.6 胸腔積液上清液（MPEs） 晚期非小細胞肺癌患者胸腔積液上清液中的cfDNA的腫瘤基因突變豐度顯著高于積液腫瘤細胞和血漿游離DNA樣本，已成為在檢測治療靶點和腫瘤突變負荷（TMB）中優(yōu)異的替代品［45］。在晚期肺癌MRD中，檢測驅(qū)動基因EGFR的突變被用作靶向治療的指導，TMB可用于評估免疫治療的療效。WANG等［46］對腫瘤組織、血漿和MPEs的EGFR突變狀態(tài)進行比較，并將結(jié)果與EGFR-TKI療法進行關聯(lián)，結(jié)果證明在基于ctDNA的EGFR突變檢測方法下腫瘤組織和MPEs之間EGFR突變靈敏度和特異度的高度一致，而血漿中的EGFR突變率最低。MPEs中的EGFR突變可以預測第一代EGFR-TKI治療的療效。經(jīng)TKI治療的EGFR突變患者的中位總生存期長于野生型EGFR患者，接受一線或二線EGFR-TKI治療的MPEs中EGFR突變患者的ORR和DCR分別為56%和94%，與基于組織的檢測結(jié)果一致。因此當兩種樣本均可用時，從MPEs中提取的游離DNA可能是比血漿更好的作為預測腫瘤對TKIs反應的生物標志物。同時YANG等［47］觀察發(fā)現(xiàn)MPEs中EGFR突變患者的中位PFS顯著長于野生型EGFR患者（7.33個月與2.07個月）。而SONG等［48］研究了使用肺腺癌患者MPEs外泌體DNA進行基因檢測的可行性，發(fā)現(xiàn)在MPEs外泌體DNA中發(fā)現(xiàn)的78%的突變與MPEs ctDNA中發(fā)現(xiàn)的突變相匹配，支持其用于基因檢測的可靠性。多渠道確定腫瘤基因原始突變狀態(tài)和監(jiān)測突變的變化對于肺癌的治療至關重要。

3 總結(jié)與展望

將液體樣本衍生的生物標志物應用于監(jiān)測MRD、預測腫瘤反應和探索治療耐藥性等臨床工作無疑是迫切需要的。液體活檢作為一種分析變異的替代方法，不僅提供了一種非侵入性的方法來提前檢測肺癌的改變，而且還補充了組織活檢檢測的結(jié)果，使更多的癌癥患者能夠接受精準治療。在這個個體化精準醫(yī)療時代，MRD本身仍有很多問題有待進一步解決，未來的研究有必要確定如何最好地將腫瘤組織活檢、臨床檢查和醫(yī)學影像與液體活檢的基因組學和MRD信息結(jié)合起來，從而使多元化液體活檢標本分析應用于臨床腫瘤工作成為指導臨床決策并改善患者預后的一條嶄新道路。

作者貢獻：閆星提出研究選題方向，負責相關內(nèi)容的文獻收集和整理，并撰寫論文初稿；劉山梅參與文獻的收集和整理，負責論文的修訂，與閆星在文章中所做同等貢獻；劉長宏負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責；所有作者確認了論文的最終稿。

本文無利益沖突。