何姍姍，趙財

貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室，貴陽 550025

小根蒜（Allium macrostemonBunge）隸屬于石蒜科（Amaryllidaceae）蔥屬（AlliumL.），為藥食同源植物，別名苦蒜、小根菜等。在1963-2020年版《中華人民共和國藥典》中均記載其干燥鱗莖作為中藥薤白的主要生藥來源之一［1］。該植物大部分生長于野外，分布區(qū)域廣泛［2］。小根蒜為全株可食的野生蔬菜，其地下鱗莖像小蒜頭，地上莖葉似韭菜，具有類似大蒜、蔥的特征風(fēng)味，受大眾喜愛。小根蒜富含多種微量元素和營養(yǎng)成分，有重要的營養(yǎng)、藥用和食用價值［3-4］。

植物的外觀和風(fēng)味是優(yōu)良品種選育的重要指標(biāo)。受遺傳因素和生態(tài)環(huán)境等因素影響，小根蒜野生種質(zhì)資源群體之間的性狀差異越來越顯著。氨基酸的含量和種類是衡量食品感官呈味性的重要指標(biāo)之一。Wu等［5］發(fā)現(xiàn)小根蒜中富含游離氨基酸，并包含多種風(fēng)味氨基酸。游離氨基酸具有呈味特征，周秀琴［6］在分析天然調(diào)味料的開發(fā)狀況中認(rèn)為氨基酸是天然調(diào)味料的重要組成部分，甜、苦、鮮、酸、咸均有。近代以來對小根蒜的品質(zhì)評價以個大、味辛者為佳［7］，然而對小根蒜地方野生種質(zhì)資源的研究和整理工作較少。本研究選取貴州省為研究區(qū)域，以不同居群小根蒜植株為對象，采用高效液相色譜法測定小根蒜鱗莖中的游離氨基酸含量，并進行氨基酸呈味性分析，擬進行貴州省不同產(chǎn)地優(yōu)良形態(tài)性狀小根蒜的篩選；基于游離氨基酸呈味性評價各產(chǎn)地小根蒜的風(fēng)味，旨在為選育開發(fā)具有良好外觀品質(zhì)和風(fēng)味品質(zhì)的小根蒜提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料及區(qū)域

于2021年3-4月，在貴州省貴陽市、六盤水市、安順市、銅仁市、畢節(jié)市、遵義市、黔東南、黔西南和黔南共9個地區(qū)，采集無明顯缺陷、正常生長的小根蒜植株。每個居群隨機選取25個樣本，每個個體間距至少5 m，共225份單株栽種于土壤、水分等條件一致的環(huán)境中備用。

1.2 形態(tài)性狀測定

對9個居群小根蒜的6個性狀指標(biāo)進行測量，具體包括株高、鱗莖直徑、葉長、葉寬、株中部寬和根須長，每株測3次重復(fù)，取平均值，將所測得的各居群指標(biāo)值錄成形態(tài)性狀Excel表。

1.3 游離氨基酸的檢測

采用高效液相色譜法（HPLC）將新鮮的小根蒜鱗莖在適宜的色譜條件下測定游離氨基酸含量，作為小根蒜的質(zhì)量控制方法之一［8］。

測定儀器和色譜條件：儀器：HPLC，二元泵，自動進樣器，DAD檢測器。色譜條件：色譜柱：Ad?vanceBio AAA C18色譜柱（4.6 mm × 100 mm， 2.7 μm）；流動相A：10 mmol/L磷酸氫二鈉和10 mmol/L硼酸鈉溶液，用鹽酸將pH調(diào)節(jié)為8.2；流動相B：V甲醇∶V乙腈∶V水=45∶45∶10；流速：1.5 mL/min；柱溫：40 ℃；采用梯度洗脫。

樣品處理：將小根蒜新鮮鱗莖取下剪碎，取約2.0 g鮮樣用10%乙酸水溶液冰水浴研磨或勻漿提取，于8 500 r/min離心取清液做為試驗樣。量取2 mL的試驗樣，先加入約相同體積的鹽酸混勻后，再用6 mol/L鹽酸溶液補充至10 mL，用氮氣置換管內(nèi)空氣后密封。水解管在（115±5） ℃烘箱中水解22～24 h后放至室溫，取出水解液，用0.22 μm孔徑的濾膜過濾，取1 mL濾液至進樣小瓶中，氮吹干后用0.1 mol/L的HCl水溶液超聲溶解固體物質(zhì)，取溶液直接進樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel和SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州省各居群小根蒜形態(tài)性狀比較

1）各居群形態(tài)及性狀統(tǒng)計。分別隨機選取各居群中1株共9株健康植株，觀察形態(tài)特征（圖1），可見黔南居群的株高較高、鱗莖個大，形態(tài)上整體較突出。每個居群隨機選取25株測定其株高、鱗莖直徑、葉長、葉寬、株中部寬和根須長6個主要形態(tài)性狀，取平均值進行統(tǒng)計（表1），結(jié)果顯示，黔南居群小根蒜的株高、葉長、葉寬、株中部寬、根須長和鱗莖直徑最大，形態(tài)性狀最突出。小根蒜的性狀在各居群之間均存在顯著差異?？傮w上看，平均變異系數(shù)為32.58%，變異范圍22.54%～7.34%。株中部寬的變異系數(shù)最高為37.34%，變異幅度為0.16～0.58 cm；鱗莖直徑的變異系數(shù)最低，為22.54%，變異幅度為0.51～1.21 cm。根據(jù)變異系數(shù)大小判斷，小根蒜各性狀值離散程度順序為：株中部寬>根須長>葉長>葉寬>株高>鱗莖直徑。通過單因素方差分析，F(xiàn)檢驗表明，6個性狀均達到極顯著水平（P<0.01），F(xiàn)值為10.897～39.640。其中，株高的F值最大，而根須長的F值最小。

表1 各居群小根蒜形態(tài)性狀統(tǒng)計Table 1 Basic statistics of morphological traits of Allium macrostemon Bunge in various populations

圖1 9個居群小根蒜的形態(tài)特征圖Fig. 1 Pictures of morphological characteristics of 9 populations of Allium macrostemon Bunge

2）各居群性狀的聚類分析。應(yīng)用SPSS 26.0軟件歐氏距離聚類方法依據(jù)小根蒜6個性狀對小根蒜9個居群進行聚類分析（圖2）。在歐氏距離為25時可劃分為2類，黔東南、安順市、遵義市、畢節(jié)市和六盤水市居群聚為一類，銅仁市、貴陽市、黔西南和黔南居群聚為一類，此類形態(tài)性狀表現(xiàn)較突出，株高、葉長和葉寬值比其他居群的高。

圖2 基于形態(tài)性狀的小根蒜聚類圖Fig. 2 Clustering diagram of A. macrostemon based on morphological traits

3）主成分分析與性狀綜合評價?；?個性狀進行主成分分析，以特征值>1為標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，第1個主成分的特征值為4.858，累計貢獻率為80.967%，說明能夠表達80.967%的信息量，主成分分析效果較好，因此，以第1個主成分作為有效成分進行數(shù)據(jù)分析。主成分載荷是原始變量與主成分之間的相關(guān)系數(shù)，葉寬的載荷為0.986，對第1主成分的貢獻最大，影響最小的是鱗莖直徑，載荷為0.737，其余的表型性狀載荷量依次為0.943、0.934、0.790、0.737，反映了地上部分的性狀。將各數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后，得到第1主成分得分和綜合得分（表2）。第1主成分和綜合得分最高的為黔南居群，分別為45.09和36.53，得分最低的為畢節(jié)市居群。

表2 各居群小根蒜性狀的主成分得分及綜合評價Table 2 Principal component scores and comprehensive evaluation of A. macrostemon characters in each population

2.2 基于氨基酸特征的小根蒜風(fēng)味品質(zhì)分析

1）各居群小根蒜游離氨基酸的含量和組成。對小根蒜鱗莖進行游離氨基酸檢測（表3），在9個居群中檢測出17種游離氨基酸，分別為Asp（天冬氨酸）、Glu（谷氨酸）、Ser（絲氨酸）、His（組氨酸）、Gly（甘氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Arg（精氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、Cys（胱氨酸）、Val（纈氨酸）、Met（蛋氨酸）、Phe（苯丙氨酸）、Ile（異亮氨酸）、Leu（亮氨酸）、Lys（賴氨酸）、Pro（脯氨酸），但在黔南地區(qū)中未檢測到His、Met、Phe和Ile。黔 南 居 群 總 游 離 氨 基 酸（TFAA）含量最低，為103.93 mg/kg，黔東南居群最高，為10 365.90 mg/kg。9個居群總游離氨基酸平均含量為6 078.52 mg/kg。9個居群小根蒜的17種游離氨基酸平均含量較高的為Ser、His和Arg，較低的為Pro、Met和Ile。

表3 各居群小根蒜游離氨基酸含量Table 3 Free amino acid（FAA） content of A. macrostemon in each colony mg/kg

2）氨基酸呈味性分析。游離氨基酸具有呈味性，9個居群小根蒜的呈味氨基酸（TAA）按其呈味性可分為芳香類氨基酸（AAA），包括Cys、Tyr、Phe；甜味氨基酸（SAA），主要是Pro、Ser、Ala、Thr、His和Gly；苦味氨基酸（BAA）占比較大，有Val、Leu、Ile、Met和Arg；鮮味類氨基酸（DAA）包括Asp、Lys和Glu。8種必需氨基酸（EAA）為Lys、Phe、Thr、Ile、Leu、Val、Met和His，其中His對于小兒生長發(fā)育起重要作用；有9種屬于藥用氨基酸（MAA），分別為Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Leu、Met和Lys。氨基酸的味道強度值（TAV）可用來進一步分析各呈味氨基酸對小根蒜風(fēng)味的影響，TAV為呈味物質(zhì)含量值與呈味特質(zhì)味覺閾值的比值，當(dāng)TAV>1表示該氨基酸對樣品的風(fēng)味有貢獻，TAV<1貢獻不顯著。

由各居群小根蒜游離氨基酸的TAV值及特征（表4）可知，DAA含量占比以黔南最高，為19.42%，其次為六盤水市和安順市。SAA含量占比最高、次高和較高的為貴陽市、銅仁市和黔東南。BAA以黔西南和六盤水市為最高和次高，相對較高為遵義市。AAA整體含量較低，其中最高的為黔東南，其次為黔南。比較呈味氨基酸的含量占比，BAA>SAA>DAA>AAA，表明以BAA占比最大，其次為SAA。EAA和MAA占比分別為11.86%和70.31%，可見營養(yǎng)和藥用價值較好。各呈味氨基酸TAV>1的有DDA中的His，BAA中的Arg和AAA中的Cys，在His對應(yīng)的安順市和黔南市居群其TAV<1外，其余呈味氨基酸TAV也均小于1?？傊?，His、Arg和Cys對小根蒜的風(fēng)味有貢獻，而對多數(shù)風(fēng)味有貢獻的為Arg（TAV=6.81），故影響小根蒜風(fēng)味的主要因素為BAA中的Arg。

表4 各居群小根蒜呈味氨基酸的TAV值及特征Table 4 TAV values and characteristics of flavoring amino acids of A. macrostemon in each population

3）氨基酸主成分分析。對游離氨基酸進行主成分分析，前4個主成分（特征值>1）的累積貢獻率已經(jīng)達到90.144%（表5），說明前4個主成分可以作為數(shù)據(jù)分析的有效成分。對于第1主成分，載荷值較高的為Val、Lys、Tyr和Ile，主要體現(xiàn)BAA含量差異；第2主成分中，占比較大的依次為His、Leu、Thr、Gly，體現(xiàn)BAA含量差異；在第3主成分中，主因子系數(shù)由大到小依次為Thr、Ser、Ala、Glu，主要體現(xiàn)各居群小根蒜中SAA含量差異；第4主成分中，影響較大的4個因子依次為Met、Gly、Thr、Val，主 要 體 現(xiàn)BAA含量差異。對各數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后求得各主成分得分及綜合評價指數(shù)（表6）。綜合得分最高的是貴陽市，其次是黔東南。結(jié)合表5可知，貴陽市和黔東南的呈味氨基酸含量和組成均較高，與綜合評分一致。

表5 各居群小根蒜呈味氨基酸的主成分分析Table 5 Principal component analysis of flavoring amino acids of A. macrostemon in each population

表6 各居群小根蒜呈味氨基酸的主成分得分及綜合評價Table 6 Principal component scores and comprehensive evaluation of flavoring amino acids in A. macrostemon of each population

3 討 論

植物個體因外部環(huán)境條件狀況不同可以形成不同的形態(tài)性狀［9］。通過對9個居群小根蒜的6個性狀指標(biāo)進行比較分析，發(fā)現(xiàn)小根蒜的形態(tài)性狀在各個居群之間差異顯著。由于黔南居群各項性狀指標(biāo)變異幅度均較大，故可作為良好選育材料，這些性狀的變異系數(shù)均大于10%，表明小根蒜的形態(tài)性狀有不同程度的變異，具有豐富多樣性，這可能是由于貴州省氣候垂直差異明顯，因此，分布在貴州省各區(qū)域的小根蒜形態(tài)性狀存在一定差異［10］。在這6個性狀中，株高的F檢驗值最大，說明各地區(qū)小根蒜的株高差異度最大，與前人對蔥屬植物的研究一致［9］。通常利用聚類分析和主成分分析對性狀差異進行綜合評價，從聚類結(jié)果來看，聚為一類的居群形態(tài)特征具有相似性，性狀較為突出的居群聚為一類。主成分分析結(jié)果中第一主成分反映了80.967%的總信息，主要反映的是地上部分的性狀，而株高占的載荷最高，是主要因子。將各數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，得到各地區(qū)的綜合得分，綜合得分最高的為黔南，其次為黔西南。各指標(biāo)總體情況表明，不同居群小根蒜以黔南表現(xiàn)最好。

利用HPLC法檢測出小根蒜鱗莖中有17種游離氨基酸，在9個居群中，氨基酸含量存在較大差異，黔東南和貴陽市小根蒜總游離氨基酸含量較高，黔南含量最低。馮淑艷等［11］用HPLC法測定貴州煙草的游離氨基酸，研究結(jié)果也表明黔南植株總游離氨基酸含量最低。各居群總游離氨基酸平均含量為6 078.52 mg/kg，結(jié)果與黃少輝［12］的研究結(jié)果（7 880 mg/kg）基本一致。從氨基酸呈味性分析結(jié)果來看，小根蒜中MAA/TFAA占比最高為70.31%，可見其是重要的藥用植物資源。小根蒜的獨特風(fēng)味和呈味氨基酸密切相關(guān)，苦味氨基酸含量最高，其次為甜味氨基酸，芳香和鮮味類氨基酸整體含量較低。采用TAV>1來判斷游離氨基酸對風(fēng)味的影響，結(jié)果顯示，Arg、His和Cys對風(fēng)味有貢獻，其中芳香Cys和甜味His對風(fēng)味帶來影響，苦味Arg（TAV=6.81）是影響小根蒜風(fēng)味的主要因素。有研究表明少量苦味能夠賦予食品特定的風(fēng)味，有助于增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度［5］。在呈味貢獻方面，黔東南居群苦味、芳香類和鮮味氨基酸含量最高，貴陽市其次，故黔東南小根蒜呈味作用最優(yōu)。從氨基酸主成分分析結(jié)果來看，綜合評價得分最高的是貴陽市，其次為黔東南，分值越高代表游離氨基酸的綜合質(zhì)量越好。綜合以上研究分析表明，黔東南和貴陽市小根蒜在風(fēng)味品質(zhì)方面具較大優(yōu)勢。

鑒于此，可以根據(jù)不同的需求選育開發(fā)野生小根蒜種質(zhì)資源，從外觀形態(tài)上，選擇具有優(yōu)良性狀的居群，如具備高大的植株、根系粗大、鱗莖較多的株系，并選擇性狀變異較大的植株，可以培育出更多優(yōu)良個體。在貴州9個居群中，黔南小根蒜外觀質(zhì)量最突出，故可以對該地區(qū)的優(yōu)良野生植株收集、篩選和加大培育力度。在風(fēng)味品質(zhì)上，綜合各指標(biāo)來看，黔東南小根蒜游離氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價值高，風(fēng)味品質(zhì)最好，開發(fā)利用潛質(zhì)大，可以根據(jù)市場需求合理選擇原料進行加工，對提高產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響。