張焱，仇志浪，申洛男，文曉鵬

貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025

甜櫻桃（Prunus aviumL.）屬薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）櫻亞屬植物，原產(chǎn)歐洲及亞洲西部，果實(shí)色澤紅潤(rùn)，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受消費(fèi)者的喜愛，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。

擴(kuò)展蛋白（expansins，EXPA）又稱為細(xì)胞壁松弛蛋白，廣泛存在于植物細(xì)胞組織中，是調(diào)節(jié)細(xì)胞壁伸展和松弛的細(xì)胞壁蛋白酶［2］。它首先從黃瓜細(xì)胞壁中分離［3］，后來在很多植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了擴(kuò)展蛋白。此外，擴(kuò)展蛋白能夠通過其他細(xì)胞壁酶相互作用，促進(jìn)細(xì)胞壁降解［4］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展蛋白基因參與了植物的抗逆過程。Sabirzhanova等［5］發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下玉米葉片中擴(kuò)展蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平提高，推測(cè)擴(kuò)展蛋白能夠特異調(diào)節(jié)細(xì)胞壁松弛。毛竹葉片中擴(kuò)展蛋白基因PeEXPA2表達(dá)水平也明顯升高［6］。Cho［7］利用特異啟動(dòng)子使擬南芥AtEXP10基因超表達(dá)促進(jìn)葉柄脫落；而抑制表達(dá)則會(huì)減少葉片脫落，并證明了葉柄脫離的原因是由于分離區(qū)擴(kuò)展蛋白受到誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞膨脹、使其產(chǎn)生機(jī)械壓力而導(dǎo)致的。在花器官脫落過程中，RbEX?PA1的表達(dá)量上升，在延緩花瓣脫落的過程中，Rb?EXPA1的轉(zhuǎn)錄水平則降低［8］。

甜櫻桃在花發(fā)育、坐果及發(fā)育期間易出現(xiàn)幼果異常脫落現(xiàn)象，但有關(guān)甜櫻桃擴(kuò)展蛋白基因的克隆和功能分析未見報(bào)道?；贓XPA基因在植物器官脫落中的功能，本研究以甜櫻桃脫落小果果柄為材料，克隆甜櫻桃擴(kuò)展蛋白基因PavEXPA2，并通過在線軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用 qRT-PCR技術(shù)分析該擴(kuò)展蛋白基因在不同組織以及不同脅迫處理中的表達(dá)情況，以期為闡明其在甜櫻桃生長(zhǎng)發(fā)育中的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

以甜櫻桃品種“桑提娜”為材料，分別采集莖、花芽、盛開花朵、幼葉、老葉、幼葉葉柄、老葉葉柄、2個(gè)脫落高峰期正常果柄與即將脫落果柄、2個(gè)脫落高峰期正常果實(shí)與脫落果實(shí)。以葉片為材料，使用20% PEG6000和20 mmol/L NaCl溶液分別模擬干旱和鹽脅迫，采集處理0、2、4、6、8 h的材料，采集后迅速用液氮速凍，后于-80 ℃中保存?zhèn)溆?。以上材料均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 甜櫻桃PavEXPA2基因的克隆

用植物多糖多酚RNA提取試劑盒（賽諾生物科技有限公司，中國(guó)張家口）提取甜櫻桃果柄總RNA，用MutiscanGO（Thermo，美國(guó)）和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，并用PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，日本）對(duì)甜櫻桃果柄總RNA進(jìn)行cDNA第1鏈合成，使用內(nèi)參基因檢測(cè)cDNA的完整性并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在甜櫻桃基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索該基因的CDS序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異引物PavEX?PA22-F：CACATGCTGACCTGTCCTCC、PavEX?PA2-R： CC GCCTAACCTCCTAAC TCTAAT，提交至上海生工生物工程有限公司合成。

以cDNA為模板，利用上述合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 3 μL，高保真mix（TaKaRa，日本）5 μL，cDNA 1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，共10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物純度，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)目的條帶進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt Cloning Kit（全式金，北京）并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，37 ℃活化1 h后吸取100～200 μL活化產(chǎn)物涂布于Kan抗性的LB平板上，于37 ℃過夜培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，對(duì)檢驗(yàn)出的陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，將陽(yáng)性菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.3 PavEXPA2基因的生物信息學(xué)分析

用NCBI在 線 分 析 工 具ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/gorf/gorf.Html）尋找DNA的開放閱讀框，通過DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯、NCBI Blastp進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性比對(duì)，利用MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹。利用在線軟件TMHMM Server v.2.0（http：//www. cbs.dtu.dk /services/TMHMM/）對(duì)PavEXPA2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，用ProtParam（https：//web.expasy.org/ prot?param/）分析PavEXPA2蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)，用在線分析工具SignalP 4.1 Serv?er（http：//www. cbs.dtu.dk/services /SignalP-4.1/）分析PavEXPA2基因所編碼的氨基酸序列的信號(hào)肽，利用Cell PLoc2.0（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf /Cell-PLoc-2/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.4 qRT-PCR分析

根據(jù)克隆獲得的PavEXPA2基因序列，用prim?er 5設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列PavEXPA2-Y-F：CTTCTTTCTCATCTCCTCTGCC，PavEXPA2-Y-R：CCAAGGAACCATACC CACAA，在上海生工生物工程有限公司合成。以甜櫻桃不同組織的cDNA為模板，以PavRSP3和PavEF1-α2為內(nèi)參基因［9］，引 物 序列 為：PavEF1-α2-F：ATCCAGAG?TAGCA GAACCAATCAC，PavEF1-α2-R：GT?TAGGCATCCAGTCCCAGAAT，在CFX 96TM Real-Time System（Bio-rad，美國(guó)）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)采用三步法，程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)擴(kuò)增10 min；94 ℃ 變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜櫻桃PavEXPA2克隆與生物信息學(xué)分析

以甜櫻桃果柄cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得與預(yù)期目的基因片段大小一致的條帶，將目的條帶回收并測(cè)序，結(jié)果顯示序列長(zhǎng)度為1 035 bp，開放 閱 讀 框（ORF）為852 bp，編 碼283個(gè) 氨 基酸（圖1）。

圖1 PavEXPA2基因ORF序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 ORF sequence and encoded amino acid sequence of PavEXPA2 gene

采用ProtParam分析可知，PavEXPA2蛋白質(zhì)分子式為C1366H2125N3750408S15，等電點(diǎn)為8.90，分子質(zhì)量約為30.81 ku。PavEXPA2蛋白總的負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為21個(gè)，正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為29個(gè)，由此推測(cè)該蛋白帶正電荷。該蛋白含量最豐富的氨基酸分別為丙氨酸Ala（9.9%）、甘氨酸Gly（8.8%）、絲氨酸Ser（8.8%）、亮氨酸Leu（8.8%）和賴氨酸Lys（6.4%）。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為41.88，這表明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。氨基酸殘基疏水性總和（GRAVY）是-0.139，所以該蛋白親水性較強(qiáng)。

采用SignalP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)得知PavEX?PA2蛋白存在1個(gè)信號(hào)肽，且信號(hào)肽裂解位點(diǎn)位于41～42（圖2）。用在線軟件TMHMM Server v.2.0預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，PavEXPA2為跨膜蛋白，含有2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)（圖3）。利用Cell PLoc 2.0 在線軟件對(duì)甜櫻桃PavEXPA2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要位于細(xì)胞壁中。

圖2 PavEXPA2蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 2 Signal peptide prediction of PavEXPA2 protein

圖3 PavEXPA2 蛋白的跨膜域預(yù)測(cè)Fig. 3 Prediction of the transmembrane domain of PavEXPA2 protein

2.2 PavEXPA2基因的同源性分析

將PavEXPA2基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源檢索，發(fā)現(xiàn)它與很多植物都具有較高的同源性，其中與扁桃（Prunus dulcis）、桃（Prunus persi?ca）、梅（Prunus mume）擴(kuò)展蛋白基因同源性最高，分別為97.49%、97.47%和96.91%，并且發(fā)現(xiàn)PavEX?PA2有較高保守性，含有DPBB_1保守結(jié)構(gòu)域。

利用DNAMAN軟件將PavEXPA2基因的開放閱讀框翻譯成氨基酸序列，并將其序列與30個(gè)和PavEXPA2蛋白同源性較高的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)該基因編碼氨基酸序列與桃、扁桃和梅擴(kuò)展蛋白氨基酸序列的同源性較高，分別為95.58%、95.56%和94.76%。

利用MEGA5.1軟件對(duì)甜櫻桃擴(kuò)展蛋白PavEX?PA2與BLAST檢索得到其他物種（柑橘、楊梅、胡楊、楊樹）擴(kuò)展蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜櫻桃PavEXPA2與PmEXPA2（梅）、PdEXPA2（扁桃）和PpEXPA2（桃）序列相似程度最高，親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖4 甜櫻桃PavEXPA2系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of sweet cherry PavEXPA2 and the α-expansins of other plant species

2.3 PavEXPA2的組織特異性表達(dá)

PavEXPA2在甜櫻桃“桑提娜”即將脫落組織，如莖、花芽、花朵，葉、葉柄、果柄和果實(shí)的表達(dá)結(jié)果顯示，在成熟葉葉柄中表達(dá)量最高，隨后依次是盛開花朵、第2落果高峰即將脫落果柄、成熟葉、第1落果高峰即將脫落果柄、第2落果高峰即將脫落果實(shí)，在第1落果高峰正常果實(shí)中表達(dá)量最低。而在第1落果高峰正常果柄、第2落果高峰正常果柄、花芽、第1落果高峰即將脫落果實(shí)、第2落果高峰正常果實(shí)、幼葉葉柄、幼葉以及莖中基本檢測(cè)不到表達(dá)（圖5）。因此，PavEXPA2基因主要是在成熟葉及其葉柄、脫落果柄和盛開花朵中表達(dá)，且在這些組織的表達(dá)與其成熟和脫落進(jìn)程大致同步，由此推測(cè)該基因可能參與甜櫻桃組織脫落的調(diào)控，尤其與葉柄脫落相關(guān)。

圖5 甜櫻桃PavEXPA2基因組織差異性表達(dá)分析Fig.5 Differential expression of PavEXPA2 gene in sweet cherry

2.4 PavEXPA2對(duì)非生物逆境的應(yīng)答

在20% PEG6000和20 mmol/L NaCl處 理后PavEXPA2基因的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果（圖6）顯示，在干旱處理（20% PEG6000處理）條件下，PavEXPA2基因表達(dá)量逐漸上升，在處理6 h時(shí)的表達(dá)量達(dá)到峰值，同時(shí)鹽脅迫（20 mmol/L NaCl處理）下其表達(dá)量也在6 h達(dá)到峰值。而在兩者表達(dá)量均達(dá)到峰值時(shí)，干旱脅迫下該基因的表達(dá)量顯著高于鹽脅迫，推測(cè)甜櫻桃在抵御干旱及鹽脅迫過程中，通過PavEX?PA2基因上調(diào)表達(dá)而響應(yīng)逆境脅迫。表明PavEX?PA2在甜櫻桃抵御非生物脅迫時(shí)可能起著關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)較為明顯。

圖6 鹽處理和干旱脅迫下甜櫻桃PavEXPA2基因的表達(dá)Fig.6 Expression of PavEXPA2 gene in sweet cherry under salt and drought treatments

3 討論

本研究從甜櫻桃克隆了1個(gè)擴(kuò)展蛋白基因家族成員PavEXPA2，其編碼蛋白與桃、扁桃、梅等擴(kuò)展蛋白氨基酸序列有較高的同源性，PavEXPA2參與甜櫻桃器官脫落的調(diào)控，尤其是葉柄脫落；在干旱及鹽脅迫下，PavEXPA2基因均上調(diào)表達(dá)。因此，甜櫻桃可能通過該基因上調(diào)促進(jìn)脫落而抵御逆境脅迫。

擴(kuò)展蛋白是1個(gè)龐大的多基因家族，目前植物擴(kuò)展蛋白一般分為4類，分別為α-expansin（EXPA）、β-expansin（EXPB）、類α-expansin（EXLA）和類β-ex?pansin（EXLB）［10-11］。擴(kuò)展蛋白基因在植物基因組中廣泛存在，但在基因家族序列的組成、數(shù)量、功能等方面，不同物種間有很大差異［12］。研究較多的是α-expansin和β-expansin，越來越多研究表明，在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中擴(kuò)展蛋白（尤其是α-擴(kuò)展蛋白）幾乎都有參與。在種子萌發(fā)、根毛起始和延長(zhǎng)、莖和葉生長(zhǎng)發(fā)育、葉柄脫落、花粉管延長(zhǎng)以及果實(shí)成熟等過程中都有擴(kuò)展蛋白參與［4］。另外，Downes［12］在大豆中同樣發(fā)現(xiàn)了1個(gè)β型擴(kuò)展蛋白基因CIM1，該基因通過軟化柱頭與花柱細(xì)胞的細(xì)胞壁、協(xié)助花粉管伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，從而協(xié)助花粉管通過花柱進(jìn)入子房，顯示出擴(kuò)展蛋白功能的多樣性。

3.1 PavEXPA2基因與植物器官脫落

在其他物種中，例如在草莓［13-14］、枇杷［15］及葡萄［16］等植物中，擴(kuò)展蛋白與果實(shí)的成熟軟化相關(guān)。Cho［7］在擬南芥葉以及葉柄基部分析表明，擴(kuò)展蛋白參與了擬南芥葉柄的脫落過程。此外，Tucker等［17］的研究也發(fā)現(xiàn)在大豆脫落葉柄離區(qū)中擴(kuò)展蛋白有顯著上調(diào)。西洋接骨木（Sambucus nigraL.）的花脫落過程中能觀察到離區(qū)中擴(kuò)張蛋白的多克隆抗體標(biāo)記逐漸增加，并且在脫落之前的黃化階段檢測(cè)到高水平的擴(kuò)展蛋白，且離區(qū)中編碼擴(kuò)展蛋白基因SniExp2和SniExp4上調(diào)表達(dá)［18］。因此，擴(kuò)展蛋白在植物器官脫落過程中發(fā)揮了重要作用。

本研究克隆得到1個(gè)甜櫻桃中的擴(kuò)展蛋白Pav?EXPA2，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)PavEXPA2在成熟的器官及易脫落的組織中高表達(dá)，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，此基因可能在細(xì)胞壁中發(fā)揮作用。許多研究表明，擴(kuò)展蛋白可重塑細(xì)胞壁，破壞纖維素和半纖維素之間的氫鍵［19-20］。細(xì)胞壁是植物細(xì)胞連接的部分，在植物器官脫落的過程中，同樣涉及細(xì)胞壁的變化［21］。本研究中甜櫻桃PavEXPA2在一些易脫落或者趨向脫落的器官中均有較高的表達(dá)量，說明該基因可能與甜櫻桃組織的脫落相關(guān)。擴(kuò)展蛋白在細(xì)胞中的功能機(jī)制已經(jīng)較為明晰，但是該基因如何參與甜櫻桃器官脫落尚需進(jìn)一步深入研究。

3.2 PavEXPA2基因與非生物脅迫

擴(kuò)展蛋白在響應(yīng)非生物脅迫中有重要作用，在煙草中過表達(dá)TaEXPA2基因能提高植株對(duì)鹽［22］、干旱［23］和鎘［24］的抗性。同樣的，在煙草中過表達(dá)TaEXPB23基因，提高了煙草的抗氧化和鹽脅迫［25］的能力。在干旱條件下，小麥胚芽鞘擴(kuò)展蛋白基因的表達(dá)上調(diào)［26-27］說明干旱條件下，擴(kuò)展蛋白基因的功能發(fā)生了變化。Dai等［28］在擬南芥中過表達(dá)月季擴(kuò)展蛋白基因RhEXPA4，增強(qiáng)了植株的抗旱性。在高鹽條件下，玉米葉片細(xì)胞的擴(kuò)展蛋白基因ZmEX?PA1的表達(dá)上調(diào)［29］，上述研究都表明擴(kuò)展蛋白與植物的抗逆性相關(guān)。本研究中PavEXPA2表達(dá)量在干旱和鹽脅迫下均上調(diào)，與以上研究結(jié)果一致，說明該基因在甜櫻桃抗逆過程中同樣有著關(guān)鍵作用。

由于貴州的寡日照及喀斯特高原的特殊地理?xiàng)l件，櫻桃的生長(zhǎng)及果實(shí)的發(fā)育有著一定的限制。甜櫻桃在幼果階段的異常脫落已經(jīng)是制約貴州甜櫻桃發(fā)展的一個(gè)嚴(yán)峻問題，而關(guān)于甜櫻桃生理落果的分子信號(hào)機(jī)制仍舊比較模糊。在逆境脅迫時(shí)， 擴(kuò)展蛋白主要通過調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁的組分以增加細(xì)胞壁的柔韌性從而緩解脅迫對(duì)細(xì)胞造成的壓力［30］。細(xì)胞的變化在逆境脅迫和脫落中存在相似之處，對(duì)擴(kuò)展蛋白基因的功能研究有助于在細(xì)胞層面解析甜櫻桃幼果異常脫落的機(jī)制。