程洪坤，趙瑞力*，李 琳，徐玉茹，胡國斌，蘭利利

(1.河北省邯鄲市眼科醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 邯鄲 056000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050011；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河北 石家莊050011)

喉癌(laryngeal carcinoma)是耳鼻咽喉-頭頸外科常見的惡性腫瘤之一，每年在全世界造成8.3萬人死亡，其中絕大多數(shù)為男性，死亡人數(shù)為7.3萬[1]。喉癌中最常見的病理類型為喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)，約占所有喉癌類型的90%[2]。近年來，人類粗放式發(fā)展經(jīng)濟(jì)，造成大氣污染、城市人口的大量增加，人類生存環(huán)境的逐步惡化，從而導(dǎo)致我國北方喉癌的發(fā)病率逐年增加。與甲狀腺癌、頭頸皮膚癌等癌癥不同，喉癌早期癥狀并不典型，患者初次就診多處于喉癌的中、晚期。另外，喉是一個特殊器官，負(fù)責(zé)機(jī)體發(fā)音、呼吸并協(xié)助吞咽，中晚期LSCC患者需采取手術(shù)治療部分甚至全部切除喉體，術(shù)后可能發(fā)生咽瘺、喉瘺，可能需要長期佩戴氣管套管，甚至喪失發(fā)音功能，無論身體還是精神上均給患者帶來巨大創(chuàng)傷。因此喉癌的早診早治直接影響了喉癌患者術(shù)后生存質(zhì)量，這就要求我們深入了解喉癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期預(yù)測LSCC發(fā)病的指標(biāo)。人類線粒體DNA(mtDNA)是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)。多項前期研究顯示，人類的衰老、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生均與可能人體mtDNA氧化損傷相關(guān)[3]。本研究所涉及D-Loop區(qū)是mtDNA的非編碼區(qū)，包含復(fù)制的起始點和轉(zhuǎn)錄啟動子，控制著整個mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，成為近年來研究mtDNA突變與多態(tài)性的熱點區(qū)域[4]。因為單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)在多基因疾病的易感基因研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。SNPs已然成為繼限制性片斷長度多態(tài)性(restrictive fragment length polymorphism，RFLP)標(biāo)志和微衛(wèi)星標(biāo)志后的第3代遺傳標(biāo)志。多項國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，線粒體D-Loop區(qū)的單核苷酸多態(tài)性改變與包括食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)病和預(yù)后有關(guān)[5-8]。本課題旨在探討LSCC發(fā)病與線粒體D-Loop區(qū)的單核酸多態(tài)性改變的關(guān)系，希望能夠找到預(yù)測因子，從而提高LSCC患者的早診早治，改善LSCC患者術(shù)后生活質(zhì)量。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 病例組選取接受喉部分切除術(shù)或喉全部切除術(shù)的患者71例，均在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科住院，住院日期在2013年6月1日—2016年11月30日。病例組患者均為男性，年齡39～73歲，平均(53.2±8.1)歲。由該院病理科兩名以上病理診斷經(jīng)驗豐富的醫(yī)生診斷，確認(rèn)術(shù)后標(biāo)本為LSCC。病例組患者的臨床資料除年齡及抽煙史[每日抽煙支數(shù)×煙齡(年)>400]外，還包括喉腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control,UICC)TNM分期情況(2002版)等。另外，對照組選取2012年2月1日—2013年8月31日在該院體檢中心行健康查體的人群159例，其中男性97例，女性62例，年齡40～64歲，平均(52.1±7.8)歲。標(biāo)本均為空腹外周靜脈血，取材后即刻放入-4 ℃冰箱恒溫保存。

標(biāo)本采集過程取得病例組和對照組研究對象的知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2研究方法

1.2.1mtDNA提取及聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 實驗采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)全血線粒體萃取試劑盒線粒體DNA的提取試劑盒，線粒體DNA提取后迅速置入-80 ℃恒溫冰箱保存。標(biāo)本mtDNA的D-Loop區(qū)的擴(kuò)增采用PCR法。標(biāo)本mtDNA的D-Loop區(qū)擴(kuò)增的上游引物為5′-CCCCATGCTTACAAG-CAAGT-3′，標(biāo)本mtDNA的D-Loop區(qū)下游引物為5′-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3′，mtDNA的D-Loop區(qū)擴(kuò)增的目的片段長度為982 bp。上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成本實驗標(biāo)本mtDNA的D-Loop區(qū)上、下游引物的合成和純化。反應(yīng)程序程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變形30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38個循環(huán)，最后于72 ℃延伸5 min。

1.2.2線粒體DNA測序及結(jié)果分析 委托北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司對PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化及擴(kuò)增，對純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用ABI PRISM 3730xl測序儀進(jìn)行基因測序，采用雙向、測通、重復(fù)測序?qū)ν粯?biāo)本進(jìn)行檢測。本研究醫(yī)用DNAMAN測序分析及Chromas軟件對病例組及對照組的mtDNA D-Loop區(qū)序列進(jìn)行分析，將分析結(jié)果與人mtDNA文庫記錄的劍橋序列(revised cambridge reference sequence，rCRS)進(jìn)行比對，從而篩選出病例組及對照組mtDNA D-Loop區(qū)的SNPs。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。喉癌組與對照組的D-Loop區(qū)變異及臨床特征的比較采用χ2檢驗，當(dāng)理論頻數(shù)T≥5時，用χ2檢驗專用公式，當(dāng)1≤T<5 時，用χ2檢驗連續(xù)校正公式，當(dāng)T<1時，用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1研究對象的一般特征 將喉癌組與對照組的性別、年齡、吸煙史進(jìn)行比較，結(jié)果顯示病例組男性多見，吸煙的喉癌發(fā)病率顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。比較病例組與對照組間<40歲與≥40歲的分布頻數(shù)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，見表1。

表1 喉癌組與對照組臨床特征Table 1 Comparison of general characteristics between case group and control group (例數(shù))

2.2mtDNA D-Loop 區(qū)SNPs與喉癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系 研究剔除了mtDNA D-Loop 區(qū)SNPs最小等位基因頻率<5%的位點，獲得共25個單核苷酸多態(tài)位點，并對之進(jìn)一步分析。采用χ2檢驗比較病例組與對照組mtDNAD-Loop區(qū)SNPs的分布頻率，實驗發(fā)現(xiàn)多達(dá)9個多態(tài)性位點與LSCC發(fā)病相關(guān)，包括73G/A、309C/Cinsert、315C/C insert 、524C/del、556A/del、16288T/C、16291C/T、16311T/C及16319G/A。進(jìn)一步分析表明。LSCC發(fā)病風(fēng)險的提高可能與73G、309C、315C及16319G相關(guān)，而LSCC發(fā)病風(fēng)險的降低可能與524C、556A、16288T、16291C及16311T相關(guān)。見表2。

表2 病例組與對照組單SNPs位點的頻數(shù)差異Table 2 SNP sites showing frequency difference between case group and control group (例數(shù)，%)

2.3與LSCC發(fā)病相關(guān)的 SNPs與臨床特征的關(guān)系 分析比較LSCC相關(guān)的SNPs位點與患者的臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示相較于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組16291C基因型分布頻率(62.5%)，該基因型在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的分布頻率(96.4%)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。將病例組LSCC發(fā)病相關(guān)SNPs與其他臨床特征(腫瘤大小、腫瘤分化程度、腫瘤臨床分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期)相比較，結(jié)果顯示上述臨床特征與病例組喉癌發(fā)病相關(guān)SNPs無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 LSCC患者16291位點多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系Table 3 The relationship between 16291 locus polymorphism and clinical characteristics in patients with laryngeal squamous cell carcinoma (例數(shù)，%)

表3 (續(xù))

3 討 論

人類的線粒體DNA為雙鏈閉合分子結(jié)構(gòu)，含有16 569個堿基，其中包括2種核糖體RNA基因，13種多肽編碼基因以及22種轉(zhuǎn)運RNA基因，它的產(chǎn)物參與構(gòu)成電子傳遞鏈復(fù)合體及氧化磷酸化過程，還在線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成方面有著重要作用[9]。線粒體D-環(huán)區(qū)(D-Loop區(qū))處于線粒體DNA 16024bp-576bp之間，長度為1 122 bp，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)胃癌、食管癌、淋巴瘤及卵巢癌與mtDNA突變及多態(tài)性相關(guān)，而線粒體D-環(huán)區(qū)是線粒體DNA突變與多態(tài)性發(fā)生的熱門研究區(qū)域[10-13]。線粒體D-環(huán)區(qū)的突變與多態(tài)性改變誘發(fā)腫瘤的發(fā)生，可能與抑制細(xì)胞電子傳遞的過程，超閾值釋放大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)有關(guān)[14]。

本研究通過對71 例喉癌患者及159例正常人群靜脈血標(biāo)本的mtDNA測序分析，共發(fā)現(xiàn)了146個多態(tài)性變異，其中25個為高頻率多態(tài)性變異位點。對這25個多態(tài)位點進(jìn)一步分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了9個多態(tài)性位點(73G/A、309C/Cinsert、315C/C insert、524C/del、556A/del、16288T/C、16291C/T、16311T/C及16319G/A)與喉癌的發(fā)病風(fēng)險可能相關(guān)，73G、309C、315C及16319G基因型可能增加了喉癌的發(fā)病風(fēng)險，而524C、556A、16288T、16291C及16311T基因型可能是正常基因表型。A-G與T-C的單個堿基替換的變異發(fā)生在多態(tài)位點73、16288、16291、16311及16319，而單堿基插入的變異形式發(fā)生在多態(tài)位點309與315，單堿基缺失則發(fā)生在多態(tài)位點524、556。本研究發(fā)現(xiàn)，與LSCC發(fā)病相關(guān)的多態(tài)性位點中16288、16291、16311及16319位點位于高變1區(qū)(HV1，16 024～16 324 bp)，73、309、315位點位于高變2區(qū)(HV2，63～322 bp)，而524及556位點位于高變3區(qū)(HV3，438～574 bp)，以上的多態(tài)性位點全部位于mtDNA的D-Loop區(qū)的高變區(qū)。在其他腫瘤中，如肺癌、胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、白血病及肝癌發(fā)病和預(yù)后相關(guān)的多態(tài)性位點多數(shù)也分布在線粒體D環(huán)區(qū)這三個高變區(qū)中，表明線粒體D環(huán)區(qū)的高變1區(qū)(HV1，16 024～16 324 bp)、高變2區(qū)(HV2，63～322 bp)、高變3區(qū)(HV3，438～574 bp)是發(fā)生多態(tài)性改變的熱點區(qū)[15-18]。這三個高變區(qū)域的基因突變有可能影響mtDNA復(fù)制并導(dǎo)致氧化呼吸鏈的改變，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量ROS自由基釋放而損傷細(xì)胞核基因組，從而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

此外，本研究結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果呈一致性，如一些多態(tài)性位點改變不僅與LSCC發(fā)病相關(guān)，與其他類型腫瘤(如胃癌、食管癌、腎癌及淋巴瘤等)的發(fā)病也有一定的關(guān)系。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病與mtDNA中D-loop區(qū)73位點、309位點及524位點的多態(tài)性相關(guān)。Fan等[19]研究發(fā)現(xiàn)mtDNA中D-loop區(qū)315位點的多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤的發(fā)病年齡相關(guān)。Zhang等[20]在腎癌方面的研究發(fā)現(xiàn)mtDNA中D-loop區(qū)16319位點的多態(tài)性與之相關(guān)。長遠(yuǎn)規(guī)劃來看，若參考結(jié)合其他惡性腫瘤分子研究中建立的以mtDNA D-Loop區(qū)SNPs分析為平臺的經(jīng)驗，可以建立針對LSCC早期診斷系統(tǒng)，從而提高LSCC腫瘤的早診早治率，也為LSCC的后續(xù)的精準(zhǔn)治療提供有價值的靶點。其中D310區(qū)為位于線粒體D環(huán)區(qū)的高變2區(qū)303～315 bp的多聚胞嘧啶區(qū)，該區(qū)域變異形式以插入、缺失及單堿基重復(fù)為主。相較于其他區(qū)域，D310區(qū)更容易遭到氧化損傷，DNA聚合酶γ控制著線粒體DNA的復(fù)制，當(dāng)損傷影響到4個核苷酸以上復(fù)制的忠實性，DNA復(fù)制出現(xiàn)滑動性錯誤，poly C序列就會發(fā)生多態(tài)性變異，此變異發(fā)生影響了線粒體的電子的傳遞，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量活性氧自由基釋放而損傷細(xì)胞核基因組，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[21]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，16291C基因型在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的分布頻率較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高，其他與喉癌發(fā)病相關(guān)的SNPs與腫瘤的大小、腫瘤分化程度、腫瘤臨床分型、淋巴轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期等無關(guān)，提示16291C可能是LSCC的一個保護(hù)性基因型。由于本研究樣本量較小，明確相關(guān)性需增加樣本量以進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究進(jìn)一步闡述了LSCC的發(fā)病機(jī)制，篩選了預(yù)測LSCC發(fā)病的特異性生物標(biāo)志物，有望提高患者的早診早治率，改善患者術(shù)后生活質(zhì)量，也為LSCC后續(xù)的基因治療提供了有價值的靶點。