王 嬋，王俊華，左 薇，許明軍，張 剛

(湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院針灸科，湖北 十堰 442000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種炎癥性自身免疫性疾病，其特征是滑膜炎和骨破壞[1-2]。微生物感染被認(rèn)為是RA最重要的誘因[3-4]。RA多見(jiàn)于女性，男女比例約為1∶3，多發(fā)生在20～55歲之間。人類(lèi)腸道微生物組很復(fù)雜，它們不僅參與食物的消化和吸收，而且在調(diào)節(jié)宿主的免疫和新陳代謝方面也發(fā)揮著重要作用[5-7]。腸道微生物組紊亂會(huì)導(dǎo)致微生物代謝物的變化和腸黏膜通透性增加[8-9]。這些通常會(huì)破壞非自身抗原耐受性和免疫之間的平衡，這可能會(huì)促進(jìn)抗原吸收并增加免疫介導(dǎo)的疾病(如RA)的持續(xù)性或惡化[10-12]。微生態(tài)調(diào)節(jié)劑是根據(jù)微生態(tài)學(xué)原理，利用對(duì)宿主有益的正常微生物、其代謝產(chǎn)物或生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)所制成的制劑，通過(guò)酶作用、抗菌、黏附定殖及生物屏障等作用來(lái)調(diào)整和保持微生態(tài)平衡，改善宿主的健康狀態(tài)[13-15]。微生態(tài)調(diào)節(jié)劑主要包括益生菌、益生元，以及益生菌與益生元的混合制劑合生元等[16]。本研究旨在探究腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對(duì)RA患者腸道微生物組和免疫微環(huán)境的影響。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2019年7月—2021年7月在我院就診的90 RA患者，隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(口服甲氨蝶呤片治療，n=45)和觀(guān)察組(腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑治療，n=45)，2組患者均連續(xù)治療3個(gè)月。入組標(biāo)準(zhǔn)：性別不限，年齡18～60歲；受試者均為RA患者初治者，現(xiàn)在及入組前均未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素；28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)評(píng)分-紅細(xì)胞沉降率(disease activity score 28-erythrocyte sedimentation rate,DAS28-ESR)≥2.6。排除標(biāo)準(zhǔn)：食物過(guò)敏或不耐受患者；無(wú)法理解信息患者；其他嚴(yán)重疾病患者；懷孕和哺乳患者。2組患者一般臨床資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者參與研究前被告知研究目的并簽署知情同意書(shū)。

表1 患者一般資料統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of general data of patients

1.2方法 對(duì)照組(口服甲氨蝶呤片治療，n=45)：口服成人5～10 mg/次， 1次/d，每周1～2次，患者均連續(xù)治療3個(gè)月。觀(guān)察組(腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑治療，n=45)：口服整腸生膠囊(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S10950019)治療，口服，1粒/次，3次/d，5 d為一個(gè)療程，患者均連續(xù)治療3個(gè)月。

1.3觀(guān)察指標(biāo)

1.3.1腸道微生物組多樣性檢測(cè) DNA提取和PCR擴(kuò)增：解凍的腸道樣品最初在提取緩沖液中用手持杵和研缽研磨，然后通過(guò)添加陶瓷和二氧化硅顆粒的混合物有效地裂解樣品。使用FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Bio公司，美國(guó))并按照制造商提供的方案提取總DNA。用于16S rRNA擴(kuò)增的PCR熱循環(huán)為：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s 27個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下進(jìn)行10 min的延伸步驟。

Illumina MiSeq測(cè)序：PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢查，提取目標(biāo)條帶，然后使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences公司，美國(guó))進(jìn)行純化，并使用QuantiFluorTM-ST(Promega公司，美國(guó))進(jìn)行定量。匯集來(lái)自每個(gè)cDNA文庫(kù)的等摩爾濃度的純化擴(kuò)增子，并使用Illumina MiSeq平臺(tái)(上海Majorbio公司)進(jìn)行測(cè)序(2×250 bp)。所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行了正態(tài)性(Shapiro-Wilk檢驗(yàn))和同質(zhì)性(O′Brien檢驗(yàn))測(cè)試。使用JMPTM軟件(SAS 公司，美國(guó))分析數(shù)據(jù)，使用R計(jì)算Chao1的豐富度指數(shù)以及Simpson和Shannon多樣性指數(shù)。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA) 收集患者血樣，使用ELISA試劑盒(RayBiotech Norcross公司，美國(guó))測(cè)定IgG、IgM和IgA水平，并使用Biotek Synergy HTX酶標(biāo)儀或自動(dòng)液體處理器(Dynex Technologies，美國(guó))在450 nm處讀取板。

1.3.3病殘分級(jí) 功能活動(dòng)分為4級(jí)，Ⅰ級(jí)：關(guān)節(jié)功能完整，一般活動(dòng)無(wú)障礙。Ⅱ級(jí)：有關(guān)節(jié)不適或障礙，但尚能完成一般活動(dòng)。Ⅲ級(jí)：功能活動(dòng)明顯受限，但大部分生活可自理。Ⅳ級(jí)：生活不能自理或臥床。

1.3.42組治療效果的比較 患者采取治療后，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛的癥狀完全消失，關(guān)節(jié)活動(dòng)度恢復(fù)正常，日常生活不受影響，表示治療痊愈；患者治療后，關(guān)節(jié)腫脹、疼痛等癥狀明顯改善，關(guān)節(jié)活動(dòng)度基本恢復(fù)到正常水平，隨著天氣變化會(huì)感到輕微疼痛，表示治療有效；患者治療后，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)疼痛有一定改善，關(guān)節(jié)活動(dòng)度恢復(fù)一部分，表示治療好轉(zhuǎn)；患者治療后，關(guān)節(jié)腫脹、關(guān)節(jié)疼痛無(wú)改善，甚至加重，關(guān)節(jié)活動(dòng)度受限嚴(yán)重，患者日常生活受到極大影響，表示治療無(wú)效。

1.3.5疾病活動(dòng)度評(píng)分 使用C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)的DAS28-ESR和DAS28綜合評(píng)分包括28個(gè)關(guān)節(jié)中壓痛和腫脹關(guān)節(jié)的數(shù)量、患者在視覺(jué)模擬量表(visual analogue scale,VAS)上對(duì)其總體健康狀況的估計(jì)，以及ESR或CRP。DAS28-ESR計(jì)算為0.56×(壓痛關(guān)節(jié)數(shù))+ 0.28 × (腫脹關(guān)節(jié)數(shù))+0.7×ln ESR+0.014×VAS(31)。DAS28-CRP計(jì)算為0.56×(壓痛關(guān)節(jié)數(shù))+0.28×(腫脹關(guān)節(jié)數(shù))+0.36×ln(CRP+1)+0.014×VAS+0.96。為了檢查參與者對(duì)飲食治療的反應(yīng)如何，使用了歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(European alliance against Rheumatism，EULAR)臨床試驗(yàn)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)效定義為治療后DAS28-ESR降低≤0.6單位，或>0.6至≤1.2單位且DAS28>5.1。有效定義為降低>0.6至≤1.2單位與DAS28≤5.1或降低>1.2單位與DAS28>3.2組合。顯效定義為減少>1.2單位，同時(shí)DAS28≤3.2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.12組治療前后腸道微生物組多樣性 治療前2組患者的微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，兩組患者微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，觀(guān)察組微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組治療前后腸道微生物組多樣性Table 2 Intestinal microbiome diversity of the two groups before and after treatment

2.22組治療前后免疫功能指標(biāo) 治療前2組患者IgA、IgM和IgG比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，2組患者IgA、IgM和IgG較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療后，觀(guān)察組IgA、IgM和IgG較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 2組治療前后免疫功能指標(biāo)Table 3 Immune function indexes of the two groups before and after treatment

2.3病殘分級(jí) 治療前2組患者的Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，2組患者Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)患者比例較治療前升高，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者比例較治療前降低(P<0.05)。治療后，觀(guān)察組Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)患者比例較對(duì)照組升高，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)患者比例較對(duì)照組降低(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 2組病殘分級(jí)Table 4 Classification of diseases and disabilities in two groups (n=45，例數(shù)，%)

2.42組治療效果 觀(guān)察組顯效率和總有效率較對(duì)照組升高(P<0.05)，觀(guān)察組無(wú)效率較對(duì)照組降低(P<0.05)，觀(guān)察組與對(duì)照組的治療效果的有效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 2組治療方法兩組治療效果Table 5 Therapeutic effect in two groups (n=45，例數(shù)，%)

2.52組疾病活動(dòng)度評(píng)分比較 調(diào)查兩者疾病活動(dòng)度評(píng)分，觀(guān)察組患者的疾病活動(dòng)度評(píng)分較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 2組疾病活動(dòng)度評(píng)分比較Table 6 Comparison of disease activity scores between two groups 分)

3 討 論

RA的發(fā)展基于遺傳和表觀(guān)遺傳學(xué)，但環(huán)境因素也起著重要作用，例如香煙煙霧和灰塵接觸，尤其是代表“內(nèi)部”環(huán)境的微生物組[17]。RA的易感性與環(huán)境因素有關(guān)，例如吸煙和感染，這可能由腸道微生物組介導(dǎo)。特別是，基因型和性別是腸道微生物組的重要決定因素，盡管腸道微生物組會(huì)隨著年齡而動(dòng)態(tài)變化[18]。腸道微生物組多樣性的減少是RA發(fā)生的原因之一[19]。早期RA患者腸道微生物組的組成發(fā)生了變化，雙歧桿菌和擬桿菌屬中某些細(xì)菌的豐度降低，普氏菌屬增加。在無(wú)菌模型中，腸外注射外源性腸道細(xì)菌細(xì)胞壁碎片可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。臨床RA患者的部分腸道微生物組在抗風(fēng)濕治療后恢復(fù)正常。飲食會(huì)影響炎癥的活動(dòng)，高脂肪飲食對(duì)腸道通透性有負(fù)面影響[20]。RA患者糞便中腸道微生物組的α多樣性指數(shù)明顯低于健康人。類(lèi)桿菌屬和埃希菌-志賀菌屬在RA患者中更為豐富腸道菌群失調(diào)與RA等自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)，其在導(dǎo)致免疫耐受性破壞中的作用。RA的自然病程包括不同的階段，包括有風(fēng)險(xiǎn)的癥狀前階段和經(jīng)典侵蝕性疾病階段之前的早期關(guān)節(jié)炎階段。RA臨床前階段最引人注目的參與者是自身抗體，這是RA的標(biāo)志。RA相關(guān)自身抗體包括類(lèi)風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、瓜氨酸蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibody，ACPA)和抗氨基甲酰肽抗體(anti-carbamoyl peptide antibody，anti-CarP)?？梢栽谂R床明顯RA發(fā)病前數(shù)年檢測(cè)到高血清濃度的RF、ACPA和抗CarP。RA臨床前階段自身抗體譜的演變包括同種型轉(zhuǎn)換。在高RA風(fēng)險(xiǎn)人群中，IgA-的患病率高于IgG-ACPA，表明黏膜免疫反應(yīng)在疾病的臨床前階段很重要。在后來(lái)發(fā)展為RA的不同人群中，發(fā)現(xiàn)血清IgA-和IgM-RF的患病率高于IgG-RF，并且IgA-RF出現(xiàn)最早。黏膜微生物群的失調(diào)與局部自身免疫過(guò)程密切相關(guān)，早期和長(zhǎng)期RA患者的微生物群組成均受到顯著干擾。本研究顯示，治療后，2組患者IgA、IgM和IgG較治療前升高。治療后，觀(guān)察組IgA、IgM和IgG較對(duì)照組升高。益生元是一種不易消化的食物成分，可選擇性地刺激腸道中益生菌的生長(zhǎng)和活性，從而改善宿主健康。益生菌/益生元對(duì)RA的治療作用已在動(dòng)物和人類(lèi)中得到證實(shí)。本研究顯示，治療后，兩組患者微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較治療前升高。觀(guān)察組微生物組菌群均勻度和微生物組菌群豐富度較對(duì)照組升高。筆者分析認(rèn)為，益生菌是活的微生物，當(dāng)攝入足夠量時(shí)，可以改善個(gè)體的健康情況。益生元是一組被腸道微生物群降解的營(yíng)養(yǎng)素，支持共生體的生存。益生菌和益生元的使用會(huì)影響腸道微生物群的組成和功能。益生菌不僅通過(guò)直接免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)具有免疫調(diào)節(jié)作用，還通過(guò)調(diào)節(jié)腸道通透性和與病原體的競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)不同菌株的多項(xiàng)研究[21]，證明益生菌調(diào)節(jié)緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)和分布。乳酸桿菌和雙歧桿菌屬被認(rèn)為是SCFA的生產(chǎn)者，導(dǎo)致腸道屏障功能的加強(qiáng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，觀(guān)察組顯效率和總有效率較對(duì)照組升高，觀(guān)察組無(wú)效率較對(duì)照組降低，觀(guān)察組與對(duì)照組的治療效果的有效率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀(guān)察組患者的疾病活動(dòng)度評(píng)分較對(duì)照組升高。本研究與相關(guān)研究可相互印證，一項(xiàng)益生菌補(bǔ)充劑對(duì)RA患者的疾病活動(dòng)和代謝狀態(tài)的影響研究顯示[22]，與安慰劑相比，這組患者的DAS28、高敏CRP血清水平有所改善。另一項(xiàng)研究評(píng)估了每天補(bǔ)充干酪乳桿菌八周對(duì)RA患者疾病活動(dòng)和炎性細(xì)胞因子水平的影響。L.casei補(bǔ)充劑導(dǎo)致DAS28的改善和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)CRP的顯著降低。此外，促炎細(xì)胞因子(如TNF、IL-6和IL-12)的水平降低，而IL-10(一種已知的抗炎細(xì)胞因子)的水平增加。

綜上所述，腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑通過(guò)調(diào)節(jié)RA患者腸道微生物組和免疫微環(huán)境，能夠有效控制RA患者疾病活動(dòng)的發(fā)生發(fā)展，是一種安全有效的治療方法。