鄧新喜，傅斌，劉霄強(qiáng)

（1.九江市第一人民醫(yī)院；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌 330000）

亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（Methylenetetrahydrofolata dehydrogenase 2，MTHFD2）是一碳代謝的關(guān)鍵酶之一，是由人類第二號染色體上基因所編碼的線粒體酶，相對分子量約為34kD。最早于1960年，由Scrimgeour等從腹水腫瘤細(xì)胞中提取了煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性亞甲基四氫葉酸脫氫酶，其活性未被證實(shí)。直到1985年Mejia[1]在分化細(xì)胞中檢測到，并證實(shí)其活性，該酶同時(shí)具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和環(huán)化水解酶的雙重活性，對維持細(xì)胞生長及活性起到重要作用。其中包括核酸的生物合成、線粒體蛋白的生物合成、甲基化、氨基酸和維生素代謝等。

1 MTHFD2概述

1.1 MTHFD2簡介MTHFD2能夠?qū)?,10-亞甲基-四氫葉酸(5,10-CH2-THF)轉(zhuǎn)化為5,10-甲?；?四氫葉酸(5,10-CH-THF)。MTHFD2為有脫氫酶作用，而且還具備5,10-THF環(huán)化水解酶活性的雙功能蛋白。它由三個(gè)功能結(jié)合區(qū)域組成，但合成酶區(qū)域功能喪失，對NAD具有特異性的新型脫氫酶，而對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)不具有特異性[2]。MTHFD2位于線粒體內(nèi)，需要Mg2+或Mn2+參與激活；無機(jī)鹽不僅是必須的，而且還作為NADP競爭性抑制[3]。

1.2 MTHFD2在線粒體中的作用 在線粒體內(nèi)，葉酸經(jīng)過兩次還原后形成重要中間產(chǎn)物四氫葉酸（THF），然后在羥甲基轉(zhuǎn)移酶2（SHMT2）的作用下及絲氨酸和甘氨酸的參與下產(chǎn)生一碳單位和5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)。在哺乳動(dòng)物中一碳單位主要參與絲氨酸和甘氨酸的代謝過程。通過使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記，在一個(gè)小鼠胚胎細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中提供甲基循環(huán)的一碳單位超過75%是來源于線粒體[4]。而CH2-THF進(jìn)一步被MTHFD2轉(zhuǎn)化為5,10-甲基四氫葉酸（CH+-THF)，進(jìn)一步還原為10-甲?；臍淙~酸(CHO-THF)。同時(shí)CHO-THF在MTHFD1酶的作用下生成甲酸鹽，甲鹽酸、絲氨酸和甘氨酸可通過線粒體膜轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)中被使用（如圖1）。

1.3 MTHFD2在細(xì)胞質(zhì)中的作用 在細(xì)胞質(zhì)中，甲酸鹽可轉(zhuǎn)化為10-甲?；臍淙~酸(CHO-THF),CHO-THF是合成嘌呤的底物。10-甲?；臍淙~酸可轉(zhuǎn)化為5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)。在胸腺嘧啶合成酶（TYMS）作用下，脫氧尿苷酸（dUM）和5，10-亞甲基四氫葉酸(CH2-THF)可轉(zhuǎn)化成脫氧胸腺嘧啶一磷酸（dTMP）；這些新合成的嘌呤和嘧啶用于維持細(xì)胞的增殖。而且CH2-THF還可以轉(zhuǎn)化為CH3-THF，參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)，見圖1。

圖1 一碳單位代謝示意圖

1.4 MTHFD2在細(xì)胞核中的作用2015年Nina等[5]還發(fā)現(xiàn)該酶定位于細(xì)胞核，證實(shí)MTHFD2是一個(gè)核蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。并且與DNA復(fù)制位點(diǎn)共定位。他們報(bào)道了MTHFD2與兩個(gè)差異明顯的基因集共表達(dá)，分別代表氨基酸新陳代謝和細(xì)胞增殖。單獨(dú)過表達(dá)MTHFD2足以促進(jìn)細(xì)胞增殖，而不需要依賴于脫氫酶活性。

2 MTHFD2的功能及其應(yīng)用

葉酸代謝在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是獨(dú)立分開的，主要在細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間[6]。最近Woeller等[7]發(fā)現(xiàn)，葉酸依賴酶的定位是動(dòng)態(tài)變化的，不同組織、細(xì)胞類型和細(xì)胞周期之間存在差異。而MTHFD2作為葉酸代謝的關(guān)鍵酶，介導(dǎo)一碳單位新陳代謝用于支持多個(gè)生理過程[8]，其中包括生物合成嘌呤和胸腺嘧啶，氨基酸穩(wěn)態(tài)，如甘氨酸，絲氨酸和甲硫氨酸，表型的維持和氧化還原的保護(hù)。

2.1 維持氨基酸平衡 在哺乳動(dòng)物中一碳單位主要參與絲氨酸和甘氨酸的代謝，線粒體中產(chǎn)生甲酸鹽是通過MTHFD2和MTHFD1L的連續(xù)活性使亞甲基四氫葉酸通過SHMT2生成絲氨酸或甘氨酸。據(jù)報(bào)道[9]，MTHFD2的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠成纖維細(xì)胞中甘氨酸缺失。另外，MTHFD2缺陷的纖維母細(xì)胞也缺乏甘氨酸，通過線粒體亞甲基四氫葉酸還原酶和環(huán)化酶的表達(dá)后可以營救甘氨酸缺乏。2018年，Juliane等[10]發(fā)現(xiàn)氧化磷脂調(diào)節(jié)氨基酸新陳代謝，是通過MTHFD2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞中的核苷酸釋放完成的。所以，MTHFD2在參與甘氨酸和絲氨酸調(diào)節(jié)方面具有重要作用。

2.2 參與嘌呤和嘧啶的合成MTHFD2是葉酸代謝合成嘌呤和嘧啶過程中的重要代謝酶，對細(xì)胞的生物學(xué)活性及生長有重要作用。MTHFD2在快速增殖的惡性腫瘤中過表達(dá)，并且被認(rèn)為參與線粒體中一碳代謝及嘌呤合成，是腫瘤細(xì)胞能夠快速生長“主開關(guān)”。 在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中[11]，發(fā)現(xiàn)MTHFD2參與嘌呤合成，影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展，可以作為一種新的治療策略。2016年，Issam等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)腫瘤細(xì)胞快速增長時(shí)，促進(jìn)MTHFD2和絲氨酸的合成，從而增加甲酰單位的產(chǎn)生來合成嘌呤[12]。當(dāng)肺癌細(xì)胞敲除MTHFD2后可影響嘌呤核苷酸合成的通路，從而減少腫瘤的生長[13]。

2.3 細(xì)胞表型的維持 葉酸介導(dǎo)的一碳代謝，還可以影響表觀遺傳和致癌作用，這反映在DNA甲基化和DNA合成中的關(guān)鍵作用，從而導(dǎo)致染色體復(fù)制過程中的不穩(wěn)定，增加基因突變的概率，誘發(fā)或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2019年，Green等[14]發(fā)現(xiàn)，MTHFD2通過作用于HIF-2αmRNA甲基化，影響腎細(xì)胞腎癌新陳代謝重編，促進(jìn)腫瘤生長。由此可見MTHFD2可以通過甲基化的作用，影響腫瘤的進(jìn)展。另外還發(fā)現(xiàn)MTHFD2不僅局限在線粒體，而且發(fā)現(xiàn)定位于細(xì)胞核時(shí)，并獨(dú)立于脫氫酶活性支持癌細(xì)胞增殖[5,15]，當(dāng)敲除MTHFD2導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡不能被其代謝產(chǎn)物甲酸鹽營救[16]。說明該蛋白擁有額外的功能，它的功能展現(xiàn)在細(xì)胞核中。因此MTHFD2非酶功能對腫瘤細(xì)胞也非常重要。2018年，Costas等[15]通過蛋白互作和功能數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)MTHFD2的另外一個(gè)非酶功能，涉及到了RNA加工和翻譯。他們發(fā)現(xiàn)MTHFD2與核蛋白密切相關(guān)，這些蛋白主要涉及RNA新陳代謝和翻譯，包括小核糖體亞基和多種不均一核糖核蛋白家族成員。2020年，Yue等[17]發(fā)現(xiàn)，MTHFD2可調(diào)控DNA修復(fù)來維持大鼠干細(xì)胞多向分化潛能，主要是在細(xì)胞核中通過維持DNA末端剪切功能和促進(jìn)同源重組修復(fù)功能來完成的。所以，這些額外的功能會(huì)影響基因的表達(dá)和基因的突變，進(jìn)而影響細(xì)胞的表型變化。

2.4 維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài) 腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激是腫瘤細(xì)胞在快速增殖中需要面臨的問題之一。NADPH是細(xì)胞中重要的抗氧化物質(zhì)，在腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色。最近一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)[18]，MTHFD2催化亞甲基四氫葉酸生成甲酰基四氫葉酸，同時(shí)產(chǎn)生NADPH。NADPH可以為還原性生物合成和氧化還原防御提供動(dòng)力的輔助因子。2019年，Ju等[19]還發(fā)現(xiàn)MTHFD2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中維持NADPH穩(wěn)態(tài)以及促進(jìn)腫瘤發(fā)展與轉(zhuǎn)移的重要作用，抑制MTHFD2可以顯著誘導(dǎo)ROS的上升；在缺氧和懸浮培養(yǎng)條件下，MTHFD2可以維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，抵御失巢凋亡。說明MTHFD2在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)中扮演著重要的角色。

3 MTHFD2在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

代謝的改變在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用早已證實(shí)。早在20世紀(jì)20年代Otto Warburg[20]觀察到腫瘤細(xì)胞高效率消耗葡萄糖，甚至在有氧條件下進(jìn)行糖酵解。20世紀(jì)40年代，氨苯喋呤治療急性淋巴細(xì)胞白血病，使得病情首次得到緩解[21]，并證實(shí)其作用靶點(diǎn)是參與葉酸代謝的二氫葉酸還原酶(DHFR)。核酸代謝抑制劑吉西他濱被用于胰腺癌、肺癌、膀胱癌的治療[22]；作用于胸苷酸合成酶的5-氟尿嘧啶和培美曲塞等藥物運(yùn)用于癌癥的治療[23]。由此可見代謝的改變對癌癥的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要。MTHFD2作為一碳代謝的關(guān)鍵酶，在腫瘤中的作用越來越受到關(guān)注，故針對MTHFD2在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展概述如下。

3.1 MTHFD2的表達(dá)與腫瘤患者臨床分期及預(yù)后的關(guān)系MTHFD2在腫瘤快速生長過程中發(fā)揮重要的作用。已經(jīng)有大量研究證實(shí)其在腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與疾病的分級分期呈正相關(guān)，導(dǎo)致不良的預(yù)后。通過檢測698例乳腺癌樣本組織中MTHFD2的表達(dá)情況[24]，發(fā)現(xiàn)41.12%的樣本組織中高表達(dá)MTHFD2，且MTHFD2的表達(dá)與腫瘤大小，組織病理分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性。MTHFD2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤[25]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[26]、食道鱗狀細(xì)胞癌[27]、肝細(xì)胞癌[28]、腎細(xì)胞癌[29]中同樣高表達(dá)，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為可以作為一個(gè)獨(dú)立的生物標(biāo)記來預(yù)測預(yù)后。而MTHFD2與相關(guān)基因聯(lián)合可以提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，如在胰腺癌[30]中，聯(lián)合MTHFD2和ALDH1L2可以作為獨(dú)立預(yù)后因素評估總體生存率和無病生存率。SHMT2、MTHFD2和ALDH1L2在直腸癌中[31]聯(lián)合高表達(dá)與不良預(yù)后的相關(guān)性更高。

3.2 MTHFD2作用于惡性腫瘤的相關(guān)機(jī)制研究癌細(xì)胞具有無限增殖的能力，但快速的增殖過程中將不得不面臨的問題是能量和營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏。為了維持快速生長，并在營養(yǎng)和氧氣匱乏的環(huán)境中生存，癌細(xì)胞重編新陳代謝來適應(yīng)細(xì)胞的快速增殖。MTHFD2對一碳代謝的影響是非常關(guān)鍵的，但其作用機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，不盡相同。以下根據(jù)MTHFD2的功能進(jìn)行分類概述。

MTHFD2在維持氨基酸平衡方面發(fā)揮重要作用，在哺乳動(dòng)物中一碳單位主要參與絲氨酸和甘氨酸的代謝過程中。MTHFD2在乳腺癌細(xì)胞[32]代謝重編中主要參與糖酵解、葉酸代謝和甘氨酸與絲氨酸轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致甘氨酸生物合成受阻，限制癌細(xì)胞的生長。另外，乳腺癌細(xì)胞敲除MTHFD2后會(huì)導(dǎo)致波形蛋白的表達(dá)減少，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力受損[33]，而且導(dǎo)致腫瘤干細(xì)胞數(shù)量的減少[13]。

氧化應(yīng)激是腫瘤細(xì)胞在快速增殖中需要面臨的問題之一，MTHFD2在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。2019年，Ju等[19]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中，MTHFD2通過調(diào)控氧化還原穩(wěn)態(tài)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

2020 年，Chan等[34]發(fā)現(xiàn)，抑制MTHFD2可 調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞代謝重編，并且具有抑制肺癌細(xì)胞的活力，轉(zhuǎn)化和自我更新的能力。

葉酸介導(dǎo)的一碳代謝，還可以影響表觀遺傳和致癌，這反映在DNA甲基化和DNA合成中的關(guān)鍵作用，從而導(dǎo)致染色體復(fù)制過程中的不穩(wěn)定，增加基因突變的概率，誘發(fā)或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[35]，在肝細(xì)胞癌中觀察到MTHFD2 CpG島啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)。2019年，Green等[14]發(fā)現(xiàn)，MTHFD2通過作用于HIF-2αmRNA甲基化，影響腎細(xì)胞腎癌新陳代謝重編，促進(jìn)腫瘤生長。并且發(fā)現(xiàn)MTHFD2活性比MTHFD2蛋白數(shù)量更重要，這說明線粒體一碳單位活性是細(xì)胞增殖的限速關(guān)鍵所在。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，miRNA、LncRNA、cirRNA對MTHFD2的作用機(jī)制研究也不斷深入，miRNA通過抑制MTHFD2的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用。如miR-92a[36]、miR-504-3p[37]、miR-33a-5p[38]、miR-940[25]、miRNA-22[39]、hsa-miR-202[40]、miR-9[41]直接下調(diào)MTHFD2水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，改善了患者的預(yù)后。lncRNA TUG1通過抑制MiR-9促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，且正性調(diào)節(jié)MTHFD2的表達(dá)[42]。circ-MTHFD2[43]也可作為臨床預(yù)測非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)記物，在診斷和病理分期及預(yù)后方面有明顯差異。

3.4 MTHFD2改變腫瘤對藥物的敏感性 通過大量的機(jī)制研究，目的在于發(fā)現(xiàn)治療腫瘤可能的作用靶點(diǎn)。在MTHFD2作用腫瘤的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)MTHFD2可以增加腫瘤對放化療的敏感性，從而提高抗癌作用。Kirtikar等[44]發(fā)現(xiàn)阻斷MTHFD2能改善β拉帕醌化療和離子放射治療對頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的敏感性。同樣的低表達(dá)MTHFD2可增加乳腺癌對甲氨蝶呤的敏感性，能恢復(fù)肺癌對吉非替尼的敏感性[13]。另外，2019年，Xu等[45]發(fā)現(xiàn)低表達(dá)circ-MTHFD2的胃癌細(xì)胞株對培美曲塞不易耐藥。隨著研究的不斷深入，MTHFD2小分子抑制劑就可能成為治療腫瘤的新型抗葉酸藥物，不但抑制腫瘤生長，還能增強(qiáng)對放化療的敏感性。

4 總結(jié)與展望

葉酸代謝相關(guān)的輔酶存在于幾乎所有的已知的生物體和各種類型的細(xì)胞中。細(xì)胞中的一碳循環(huán)由葉酸相關(guān)輔酶介導(dǎo)，對維持細(xì)胞生長及活動(dòng)起到重要作用，包括核酸、蛋白的生物合成和氨基酸、維生素代謝等。若葉酸缺乏將會(huì)導(dǎo)致DNA合成障礙最終影響正常的細(xì)胞周期并導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。MTHFD2是一碳代謝的關(guān)鍵酶之一，它不僅具有亞甲基四氫葉酸脫氫酶和環(huán)化水解酶的雙重活性，作為細(xì)胞核蛋白，還獨(dú)立參與氨基酸新陳代謝和細(xì)胞增殖。正因MTHFD2具有如此重要的功能，所以越來越受到大家的關(guān)注，特別是在惡性腫瘤方面的研究與應(yīng)用，可以作為重要的預(yù)測因子和藥物靶點(diǎn)。

然而，已知的MTHFD2的代謝功能對癌癥的重要作用可能無法作為唯一的解釋。如用線粒體通路初級產(chǎn)品甲酸鹽補(bǔ)充培養(yǎng)基，未能挽救MTHFD2抑制癌細(xì)胞[16,46]；通過抑制SHMT2酶應(yīng)該阻斷線粒體途徑，但是并沒有引起細(xì)胞死亡，除非缺乏甘氨酸[47]；盡管單碳代謝和細(xì)胞表型之間不存在明顯的聯(lián)系，但敲除MTHFD2也影響體外侵襲和遷移。綜上所述，MTHFD2與腫瘤關(guān)系密切，在預(yù)測和治療腫瘤方面具有很大的潛力，可能成為未來治療腫瘤的重要靶點(diǎn)，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探索。