劉 晶，杜晶輝，劉瑞巖，鮑志軍，賀 鑫，趙 巖，王 俊，雷曜榮，劉 旭

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科/國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)是我國(guó)常態(tài)化疫情防控的技術(shù)保障，已在全國(guó)二、三級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開展，是切斷病毒傳播的重要防線。實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)具有高靈敏度、高效高通量的優(yōu)勢(shì)，可在疾病早期或潛伏期內(nèi)識(shí)別微量的病毒核酸片段[1]，是《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》推薦的常規(guī)檢測(cè)方法[2]。為確保核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，各實(shí)驗(yàn)室需具備完善的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系。2021年5月國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)頒布的《新型冠狀病毒肺炎防控方案》(第八版)文件指出[3]，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)控，每批檢測(cè)至少有1 份弱陽性質(zhì)控品、3 份陰性質(zhì)控品，室內(nèi)質(zhì)控是全面質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。新型冠狀病毒RT-PCR檢測(cè)方法屬于定性分析，僅簡(jiǎn)單判斷陰陽性質(zhì)控是否在控，無法評(píng)價(jià)核酸提取效率是否達(dá)標(biāo)、檢測(cè)過程是否存在系統(tǒng)誤差或偶然誤差。本文在陰陽性質(zhì)控在控的基礎(chǔ)上，將定性PCR結(jié)果進(jìn)行計(jì)量資料轉(zhuǎn)換，統(tǒng)計(jì)弱陽性質(zhì)控靶基因循環(huán)閾值(Ct值)，繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖，回顧性分析檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 全自動(dòng)核酸提取儀BG-Flex-96，配套核酸提取及純化試劑TQ-BG-003-96D-96，新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)，以上均購(gòu)自上海伯杰公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀QuantStudio 5，購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司。

1.2質(zhì)控物來源 本實(shí)驗(yàn)質(zhì)控物來自第三方噬菌體假病毒顆粒，批號(hào)2021005，濃度范圍：5.35×103+3～5.24×104+4 copy/mL，購(gòu)自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1新冠病毒核酸檢測(cè) 新冠病毒的核酸檢測(cè)嚴(yán)格按照伯杰試劑說明書和按本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程文件進(jìn)行操作。使用伯杰核酸提取試劑96孔板吸取200 μL樣本，首先樣本與裂解液和磁珠結(jié)合，經(jīng)過兩次洗滌去除蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，洗脫出核酸。將5 μL核酸加入20 μL擴(kuò)增反應(yīng)液，形成25 μL反應(yīng)體系，在PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，應(yīng)用QuantStudioDesign & Analysis軟件進(jìn)行擴(kuò)增曲線分析進(jìn)行結(jié)果判讀。每批次檢測(cè)均設(shè)置3個(gè)陰性質(zhì)控、1個(gè)弱陽性質(zhì)控。

1.3.2弱陽性質(zhì)控稀釋倍數(shù)的選擇 使用無菌生理鹽水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40對(duì)第三方質(zhì)控物進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋倍數(shù)分裝8支，每支200 μL，分裝至1.5 mL離心管。配制完成后，5個(gè)濃度水平的40支質(zhì)控物立即進(jìn)行RT-PCR核酸檢測(cè)。

1.3.3繪制定性檢測(cè)散點(diǎn)圖 記錄每批次陰性質(zhì)控和弱陽性質(zhì)控的結(jié)果并按照自定義數(shù)值繪制定性結(jié)果散點(diǎn)圖：將弱陽性質(zhì)控定義為數(shù)值“1”，檢測(cè)為陽性時(shí)定義數(shù)值為“2”，檢測(cè)為陰性時(shí)定義數(shù)值為“-2”；將陰性質(zhì)控定義為“-1”，檢測(cè)為陰性時(shí)定義數(shù)值為“-2”，檢測(cè)為陽性時(shí)定義數(shù)值為“2”；將質(zhì)控品定義數(shù)值與檢測(cè)結(jié)果定義值相加，等于“3”或“-3”為在控，等于“1”為假陽性反應(yīng)，等于“-1”為假陰性反應(yīng)[4]。

1.3.4弱陽性質(zhì)控的配制與數(shù)據(jù)采集 (1)弱陽性質(zhì)控的配制：首先使用生理鹽水將第三方質(zhì)控物按1∶3稀釋分裝至1.5 mL離心管(無RNase)，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩Ｃ颗鷻z測(cè)時(shí)取一支配制好的質(zhì)控物，室溫平衡，充分混勻并瞬離。進(jìn)行核酸提取時(shí)，弱陽性質(zhì)控位置加入20 μL配制陽性質(zhì)控+180 μL生理鹽水，共200 μL，即再進(jìn)行10倍稀釋。(2)收集本實(shí)驗(yàn)室2022年1-2月每批次實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)；統(tǒng)計(jì)所有實(shí)驗(yàn)批次弱陽性質(zhì)控的靶基因Ct值，建立Excel 2010數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù)。分別對(duì)N基因和ORF1ab基因兩組Ct值進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，當(dāng)P>0.05表示服從正態(tài)分布，當(dāng)P<0.05表示不服從正態(tài)分布。

1.3.5繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖 根據(jù)前20次檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算N基因和ORF1ab基因的靶值X和標(biāo)準(zhǔn)差s，上下限為X±3s，警告限為X±2s。以檢測(cè)次數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析、制圖。應(yīng)用IBM SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

表1 5個(gè)稀釋倍數(shù)的弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值比較(n=8)

2.2RT-PCR定性室內(nèi)質(zhì)控散點(diǎn)圖 根據(jù)自定義數(shù)值繪制定性檢測(cè)結(jié)果散點(diǎn)圖，如圖1所示。在97個(gè)批次檢測(cè)結(jié)果中出現(xiàn)1次失控，即第85次(即2月2日第3批次)弱陽性質(zhì)控檢出陰性結(jié)果出現(xiàn)了“假陰性”反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)失控后，立即采取糾正措施并復(fù)檢。

圖1 熒光PCR定性室內(nèi)質(zhì)控散點(diǎn)圖

2.3弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值的正態(tài)性檢驗(yàn) 2021年1-2月份弱陽性質(zhì)控靶標(biāo)N基因、ORF1ab基因Ct值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，結(jié)果兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布(P>0.05)。見圖2。

注：N基因Ct值正態(tài)分布(P=0.574)ORF1ab基因Ct值正態(tài)分布(P=0.08)。

2.42022年1-2月弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值Levey-Jennings質(zhì)控圖 弱陽性質(zhì)控N 基因靶值X為34.13，標(biāo)準(zhǔn)差s為0.652，變異系數(shù)CV為1.91%。結(jié)果如圖3所示，所有Ct值均在X±3s以內(nèi)，5次出現(xiàn)±2s警告，根據(jù)Westgard多規(guī)則法分析，符合質(zhì)控規(guī)則。弱陽性質(zhì)控ORF1ab基因靶值X為35.30，標(biāo)準(zhǔn)差s為0.910，CV為2.58%。第73次檢測(cè)(2月20日)Ct值超過+3s，見圖4。經(jīng)原始曲線分析，該次檢測(cè)ORF1ab曲線第1～10個(gè)循環(huán)基線波動(dòng)較大，整體信號(hào)強(qiáng)度較低。5次出現(xiàn)±2s警告，根據(jù)Westgard多規(guī)則法分析，第31～41批次檢測(cè)違反了10x規(guī)則，第73～80批次違反了R 4s規(guī)則。

圖3 2022年1-2月弱陽性質(zhì)控N基因Levey-Jennings質(zhì)控圖

圖4 2022年1-2月弱陽性質(zhì)控ORF1ab 基因Levey-Jennings質(zhì)控圖

3 討 論

目前RT-PCR法是臨床上廣泛應(yīng)用的新冠病毒核酸檢測(cè)方法，是確診COVID-19的直接證據(jù)[3]，因此準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)結(jié)果在疾病診斷和疫情防控中承擔(dān)重要作用。《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)專家共識(shí)》指出[5]，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)從試劑質(zhì)量控制、操作質(zhì)量控制、設(shè)置對(duì)照、多指標(biāo)診斷等多方面避免假陰性、假陽性結(jié)果出現(xiàn)。因此做好全過程質(zhì)量控制，特別是室內(nèi)質(zhì)量控制尤為重要，它是連續(xù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室工作可靠性程度的方法，是確定檢測(cè)結(jié)果是否可靠、可否發(fā)出報(bào)告的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。

首先，本研究選用第三方假病毒技術(shù)的陽性質(zhì)控品，原因是假病毒技術(shù)以MS2噬菌體外殼蛋白為載體，包裹核酸檢測(cè)的靶標(biāo)RNA，具有真實(shí)病毒相似的物理結(jié)構(gòu)，可參與核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增全過程，實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)的全過程質(zhì)量控制[7-8]。第三方邦德盛的陽性質(zhì)控品(濃度范圍：5.35×103+3～ 5.24×104+4 copy/mL)，為確定弱陽性質(zhì)控的稀釋倍數(shù)，進(jìn)行5個(gè)稀釋倍數(shù)的平行試驗(yàn)，結(jié)果表明，確定最接近檢出限且穩(wěn)定性高的稀釋倍數(shù)為1∶30，平均濃度為556.7 copy/mL(濃度范圍：178.3～1 746.7 copy/mL)，是核酸檢測(cè)試劑檢出限(500 copy/mL)的1.2倍左右，符合弱陽性質(zhì)控品的濃度要求。

其次，關(guān)于核酸檢測(cè)熒光PCR法的室內(nèi)質(zhì)控，文件規(guī)定“每批檢測(cè)至少有1份弱陽性質(zhì)控品(第三方質(zhì)控品)、3份陰性質(zhì)控品(生理鹽水)[3]?！薄昂怂釞z測(cè)試驗(yàn)以及其他定性試驗(yàn)可選擇適當(dāng)濃度的質(zhì)控物，采用定性檢測(cè)結(jié)果合格即判為在控的方法[9]?！睋?jù)此本研究采用自定義弱陽性質(zhì)控及陰性質(zhì)控?cái)?shù)值的方法，繪制核酸檢測(cè)定性室內(nèi)質(zhì)控散點(diǎn)圖，直觀地反映出質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期檢測(cè)結(jié)果不一致的情況并判定為“失控”，繪制定性質(zhì)控散點(diǎn)圖簡(jiǎn)單易行，符合國(guó)家相關(guān)規(guī)定。

最后，Ct值是擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點(diǎn)，是判讀結(jié)果是否為陰(陽)性的重要依據(jù)，是熒光PCR反應(yīng)中靶標(biāo)濃度的相對(duì)測(cè)量[10]。為更加精細(xì)的進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控管理，本研究參照定量測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控的方法，基于靶基因Ct值建立室內(nèi)質(zhì)控的L-J質(zhì)控圖，可分辨檢測(cè)過程的系統(tǒng)誤差和偶然誤差，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精密度。本研究共累積2022年1-2月每批次檢測(cè)的弱陽性質(zhì)控Ct值97個(gè)，對(duì)兩組靶基因Ct值數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，均符合正態(tài)分布，適宜采用L-J質(zhì)控圖分析其離散程度和變化趨勢(shì)。本研究對(duì)上述弱陽性質(zhì)控Ct值進(jìn)行了L-J圖分析，如圖3、4所示。結(jié)果表明，N基因的CV為1.91%，ORF1ab基因的CV為2.58%，盡管目前沒有明確的病毒核酸可接受的CV范圍，但可以肯定的是長(zhǎng)期統(tǒng)計(jì)室內(nèi)質(zhì)控CV值是反映實(shí)驗(yàn)室每個(gè)檢測(cè)環(huán)節(jié)的穩(wěn)定性，能夠檢測(cè)操作中的長(zhǎng)期變化趨勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)測(cè)定過程中存在的問題[11-12]。

如圖4所示，結(jié)果表明ORF1ab基因第73批次超過3s屬于偶然誤差，產(chǎn)生偶然誤差的原因可能是(1)核酸提取過程中靶基因丟失、或存在PCR抑制物的殘留[13];(2)試劑問題，如反轉(zhuǎn)錄酶的失活;(3)人員操作失誤。根據(jù)Westgard多規(guī)則質(zhì)控法，第31～41批次違反了10x規(guī)則屬于系統(tǒng)誤差，第73～80批次違反了R 4s規(guī)則，離散程度較大，同樣屬于系統(tǒng)誤差，通過分析，產(chǎn)生系統(tǒng)誤差的原因是PCR反應(yīng)前10個(gè)循環(huán)基線波動(dòng)較大，擴(kuò)增曲線不平滑，S型曲線在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期斜率偏低。查找原因發(fā)現(xiàn)八連排離心管由于質(zhì)量問題與擴(kuò)增儀小孔不服帖，導(dǎo)致受熱不均勻，影響擴(kuò)增結(jié)果。因此通過弱陽性質(zhì)控靶基因Ct值的L-J質(zhì)控圖，可分析出偶然誤差和系統(tǒng)誤差出現(xiàn)的原因，及時(shí)采取糾正措施，從而提高核酸檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

本研究中，定性室內(nèi)質(zhì)控散點(diǎn)圖是判斷該批次檢測(cè)是否有效、是否可發(fā)出報(bào)告的依據(jù)，L-J質(zhì)控圖用作回顧性分析熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)穩(wěn)定性的方法，分析偶然誤差或系統(tǒng)誤差的原因，及時(shí)發(fā)現(xiàn)操作過程失誤或試劑耗材質(zhì)量問題。當(dāng)定性室內(nèi)質(zhì)控散點(diǎn)圖和L-J質(zhì)控圖兩種方法結(jié)果不一致時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室以定性質(zhì)控散點(diǎn)圖“失控”作為質(zhì)控失敗重新復(fù)檢的依據(jù)。

綜上所述，本文創(chuàng)新性的提出將定性質(zhì)控散點(diǎn)圖及L-J質(zhì)控圖聯(lián)合應(yīng)用于熒光PCR檢測(cè)新冠病毒的室內(nèi)質(zhì)控，能夠較全面地反映核酸檢測(cè)的有效性和穩(wěn)定性，監(jiān)控核酸提取、擴(kuò)增全過程。這2種方法在本實(shí)驗(yàn)室已應(yīng)用近1年時(shí)間，效果優(yōu)于既往的“陰陽性質(zhì)控在控即合格”單一判斷方法，具有很好的預(yù)警功能。